CN113495102B

CN113495102B - 一种基于uplc-q-tof-ms技术鉴定淫羊藿的方法

Info

Publication number: CN113495102B
Application number: CN202010257468.4A
Authority: CN
Inventors: 孙宜春; 黄春跃; 胡晓; 屈莉莉; 李慧馨
Original assignee: Guoyaojituan Tongjitang Guizhou Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Guoyaojituan Tongjitang Guizhou Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN113495102A

Abstract

本发明涉及一种采用UPLC‑Q‑TOF‑MS结合代谢组学高通量样本的分析能力以及化学计量学方法来研究不同基原淫羊藿和巫山淫羊藿的特征标志物的分析方法，以达到鉴定淫羊藿药材的方法。该方法包括：对淫羊藿和巫山淫羊藿样品分别进行前处理，通过UPLC‑Q‑TOF‑MS采集数据。然后通过Progenesis QI 2.0软件和EZinfor3.0软件对不同批次的淫羊藿样品和巫山淫羊藿样品的质谱数据进行预处理和统计分析来筛选出各自的特征标志物。最后通过对照品比对，UNIFI软件和参考文献对筛选出的特征标志物进行鉴定。本方法具有操作简单，实用性强的特点，可以用于鉴别淫羊藿药材的真伪和质量控制。

Description

一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术鉴定淫羊藿的方法

技术领域

本发明涉及多基原中药材的鉴别方法，具体涉及一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术鉴别淫羊藿的方法。

背景技术

淫羊藿为小檗科淫羊藿属Epimedium L.植物，我国分布有45种，目前作为药材商品的主要种类有15种。《中国药典》2015年版收录的有淫羊藿和巫山淫羊藿，其中淫羊藿为多基原药材，是小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.、箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶。巫山淫羊藿是小檗科植物巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T.S)的干燥叶。淫羊藿药材具有很高的药用价值，市场需求量大，但是来源众多，现有的文献显示不同产地和不同基原淫羊藿的化学成分含量差异较大，严重影响了淫羊藿的用药安全和质量。鉴于目前淫羊藿药材多基原混用现象严重，有效鉴别不同基原淫羊藿药材的方法对于其质量控制和临床疗效具有重要的意义。

植物或中草药在生长发育过程中，会产生特定的次生代谢产物，这类代谢产物是其发挥特殊功效的物质基础，也是对其进行质量控制的核心指标。U PLC-Q-TOF-MS具有高灵敏性、高分辨率和高选择性等优势，可以有效的对生物体中次生代谢产物进行表征；而代谢组学是指将生物体中代谢物进行高通量分析的一种新技术。二者结合可为明确不同生物体、不同代谢组的差异提供技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，目前淫羊藿的鉴定技术及方法主要有性状及显微鉴定法、TLC法、HPLC指纹图谱法、HPLC-MS指纹图谱法等方法，但是还存在许多不足，无法对淫羊藿的不同基原淫羊藿进行有效区分。基于目前淫羊藿鉴定的研究现状，急需要一种鉴别淫羊藿的有效方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种采用UPLC-Q-TOF-MS结合代谢组学及化学计量学方法研究不同基原淫羊藿和巫山淫羊藿特征标志物的鉴别分析方法。

具体来说，本发明提出了如下技术方案：

一种鉴别不同基原淫羊霍的特征标志物的方法，其采用高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对样品进行测定，并结合代谢组学以及化学计量学手段研究不同基原淫羊藿的特征标志物，建立不同基原淫羊藿的鉴别方法，该方法包括下述步骤：

(1)制备供试品溶液：对淫羊藿样品进行提取；

(2)制备对照品溶液：对照品包括：朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷B、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ,宝藿苷V，宝藿苷VII，朝霍定E，朝霍定K和淫羊藿新苷A，将上述对照品分别制成甲醇溶液；

(3)采用UPLC-Q-TOF-MS技术对步骤(1)所得供试品溶液，及步骤(2)得到的对照品溶液进行检测，得到化学成分物质色谱峰；

(4)利用分析软件对步骤(3)得到的化学成分物质峰进行分析，筛选出不同基原淫羊藿的特征标志物。

优选地，对于所述的方法，其中，所述不同基原淫羊霍包括：淫羊藿、朝鲜淫羊藿、箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿四种不同基原的淫羊藿，以及其他淫羊藿属植物。

优选地，对于所述的方法，其中，步骤(1)准备供试品溶液具体操作包括：取淫羊藿样品粉末，加入提取液进行超声提取，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；

优选提取液为甲醇-水溶液，或乙醇-水，进一步优选为70％(体积比)甲醇水溶液；

优选所述淫羊藿样品粉末的质量为2.0g；

优选淫羊藿样品与提取液的质量体积比为1g：10ml～50ml，进一步优选为1g：50ml；

优选所述超声提取的时间为10分钟～60分钟，进一步优选为30分钟；优选超声功率为250W；优选超声频率为40kHz。

优选地，对于所述的方法，其中，步骤(2)中制备的对照品溶液的浓度分别为每1ml含有40、50、50、60、60、30、50、50、50、50、50和50μg的对照品。

优选地，对于所述的方法，其中，步骤(3)所述UPLC-Q-TOF-MS，其中采用的色谱条件包括：

色谱柱为C18色谱柱，优选为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)，进一步优选柱温为25℃～40℃，进一步优选为40℃；

优选使用的检测器为PDA检测器，进一步优选检测波长为210nm～280nm，进一步优选为270nm。

优选地，对于所述的方法，其中，采用的色谱条件包括：采用流动相A和流动相B，

其中，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为色谱级纯乙腈，进一步优选洗脱梯度如下所述：

0～5min：85％→75％流动相A，15％→25％流动相B；

5～12min：75％流动相A，25％流动相B；

12～18min：75％→62％流动相A，25％→38％流动相B；

18～22min：62％流动相A，38％流动相B；

22～26min：62％→50％流动相A，38％→50％流动相B；

26～26.1min：50％→25％流动相A，50％→75％流动相B；

26.1～30min：25％→85％流动相A，75％→15％流动相B；

优选所述流动相A为0～0.5％体积浓度的甲酸水溶液；进一步优选为0.1％体积浓度的甲酸水溶液；

优选流速为流速为0.10ml/min～0.50ml/min，进一步优选为0.36ml/min。

优选地，对于所述的方法，其中，步骤(3)所述UPLC-Q-TOF-MS，其中飞行时间质谱为Q-TOF-MS，质谱条件包括：

质量扫描范围为50Da～1500Da；

干燥气体为N₂，优选干燥气流速为800L/h，进一步优选干燥气温度为380℃～400℃；

离子源温度为110℃～130℃；

锥形气流速为100L/h。

优选地，对于所述的方法，其中，步骤(4)的分析软件为包括Progenesis QI 2.0软件和Ezinfo 3.0软件的数据分析软件。

本发明的有益效果：

本发明提供的筛选不同基原淫羊藿的特征标志物的方法及鉴定不同基原淫羊藿的方法，不局限于本研究的五种淫羊藿，采用同样的方法和手段也可以建立用于其他淫羊藿属药材的鉴别方法。本方法具有操作简单，实用性强的特点，所得到的结果具有特异性高，专属性强的特点，可以用于鉴别淫羊藿药材的真伪和质量控制。

附图说明

在附图中使用的字母及其含义分别为：“W”代表巫山淫羊藿，“R”代表柔毛淫羊藿，“X”代表淫羊藿，“J”代表箭叶淫羊藿，“C”代表朝鲜淫羊藿

图1为正离子模式下BPI图；

图2为负离子模式下BPI图；

图3为淫羊藿样品的PCA得分图，其中，以黑色圆点表示“C”类淫羊藿：朝鲜淫羊藿样品；以方块表示的“J”类淫羊藿样品：箭叶淫羊藿；以正三角形表示的“R”类淫羊藿样品：淫羊藿；以倒三角表示的“X”类淫羊藿样品：心叶淫羊藿；

图4为淫羊藿样品的HCA图；

图5为淫羊藿样品的PLS-DA得分图，，其中，以黑色圆点表示“C”类淫羊藿：朝鲜淫羊藿样品；以方块表示的“J”类淫羊藿样品：箭叶淫羊藿；以正三角形表示的“R”类淫羊藿样品：淫羊藿；以倒三角表示的“X”类淫羊藿样品：心叶淫羊藿；

图6为淫羊藿样品的OPLS-DA载荷图，其中，图中以空心圆圈出的圆点表示筛选出的特征物；

图7为淫羊藿特征标志物的热图分析，其中，在图7右下角图表所示，在热图中颜色由浅(最底部)到深(最顶部)表示不同特征标志物在样品中的相对含量由少到多，图7中横坐标为不同的特征标志物(Peak1-Peak28),纵坐标代表不同种类的样品，将横纵坐标交叉在一起，则可以得到在某一种样品中的某个特征物质含量的颜色，颜色越深则含量越高；

图8为淫羊藿和巫山淫羊藿样品的OPLS-DA载荷图，其中圆点表示四个基原的淫羊藿(“C”表示朝鲜淫羊藿，“J”表示箭叶淫羊藿，“R”淫羊藿和“X”表示心叶淫羊藿)，方块为巫山淫羊藿样品，以“W”表示；

图9为淫羊藿和巫山淫羊藿样品的S-plot图，其中，图中以空心圆圈出的圆点表示筛选出的特征物；

图10为巫山淫羊藿和淫羊藿的差异特征标志物热图分析，其原理与图7相同；

图11为混合标准品色谱图，其中，各标号的峰分别代表的物质为：1:绿原酸；2:山柰酚-3-O-鼠李糖-7-O-鼠李糖；3:双藿苷B；4:淫羊藿苷A；5:朝藿定A1；6:朝藿定A；7:朝藿定B；8:朝藿定C；9:淫羊藿苷；10:朝藿苷E；11:朝藿定K；12:宝藿苷VII；13:箭藿苷B；14:2"-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II。

具体实施方式

本发明提出的采用UPLC-Q-TOF-MS结合代谢组学化学计量学方法研究淫羊藿不同基原和巫山淫羊藿特征标志物的鉴别方法，具体步骤如下：

步骤(1)：建立淫羊藿药材体外数据库

查阅国内外数据库(CNKI，PubMed,Medline,Web of Science and ChemSpider)，建立了包含180个化合物的淫羊藿体外化合物数据库。

步骤(2)：对照品和供试品溶液的制备

对照品溶液的制备：

取对照品朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ,宝藿苷V，宝藿苷VII，朝霍定E，朝霍定K，淫羊藿新苷A适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含40、50、50、60、60、30、50、50、50、50、50和50μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：

取淫羊藿样品(过三号筛)0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇溶液10mL，称定重量，超声提取(超声功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

步骤(3)：UPLC-Q-TOF/MS数据的采集

色谱条件如下：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，流动相A为0.1％的甲酸溶液，所述百分比为体积百分比，流动相B为乙腈，洗脱梯度如表1：

表1梯度洗脱表

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～5	85→75	15→25
5～12	75	25
			12～18	75→62	25→38
18～22	62	38
			22～26	62→50	38→50
26～26.1	50→25	50→75
			26.1～30	25→85	75→15

其中，检测条件包括：

色谱条件：

检测波长为270nm，柱温为40℃，流速为0.36ml/min；

所述测定方法使用的检测器为PDA检测器。

质谱条件：

质量扫描范围：50～1500Da

干燥气体：N₂

干燥气流速：800L/h

干燥器温度：400℃

离子源温度：120℃

锥形气流速：100L/h

步骤(4)：数据分析，筛选特征标记物

采用Progenesis QI 2.0软件对淫羊藿样品的质谱数据进行预处理，利用Ezinfo3.0软件对质谱数据进行进一步分析，主要采用PCA、HCA、PLS-DA及OPLS-DA等统计分析方法，设置VIP＞4，筛选不同基原淫羊藿的特征标志物。

步骤(5)：不同基原淫羊藿的特征标志物的鉴定

利用对照品比对，UNIFI软件及参考相应的参考文献对特征标志物进行鉴定。

为了进一步验证本发明提供的淫羊藿鉴定方法，进行了下述实施例的具体实验过程。下面对本发明作进一步详细描述。

实施例

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件。

1.仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC I-class system(Waters,Milford,USA)(包括autosampler,online degasser,binary solvent delivery system,2998PAD Detector)；METTLER TOLEDO MS 105Du电子天平(梅特勒-托利多)；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1×100mm,1.8μm,Waters,Milford,MA,USA)；乙腈，色谱纯；超纯水，自制；甲酸，LC–MS级，其他试剂均为分析纯。

朝藿定C，批号111780-201503，HPLC≥95.5％，购自中国食品药品检定研究院；淫羊藿苷，批号110737-201516，HPLC≥94.2％，购自中国食品药品检定研究院；朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿次苷Ⅱ、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、箭藿苷B均HPLC≥98％，均购自上海历鼎生物技术有限公司；宝藿苷V，批号：DST190925-083，HPLC≥98％，购自成都徳斯特生物技术有限公司；山奈苷，批号DST190907-003，HPLC≥98％，购自成都徳斯特生物技术有限公司；

朝霍定E，批号DST191009-172，HPLC≥98％，购自成都徳斯特生物技术有限公司；宝藿苷VII，批号DST190806-084，HPLC≥98％，购自成都徳斯特生物技术有限公司；朝霍定K，批号：DST191010-173，HPLC≥98％，购自成都徳斯特生物技术有限公司；淫羊藿新苷A，批号DST190916-093，HPLC≥98％，购自成都徳斯特生物技术有限公司。

下述实施例中，所用淫羊藿样品为贵州同济堂制药有限公司提供的共计82个批次的淫羊藿药材，淫羊藿的具体信息见表2。

表2共计82个批次的淫羊藿样品信息

第一步：制备对照品溶液及供试品溶液

(1)制备对照品溶液

取对照品：朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ,宝藿苷V，宝藿苷VII，朝霍定E，朝霍定K，淫羊藿新苷A标准品试剂，精密称定，然后分别加入70％甲醇水溶液，最终分别制成每1mL含40、50、50、60、60、30、50、50、50、50、50和50μg上述对照品的甲醇溶液，即得。

(2)制备供试品溶液

将表2中不同批次的淫羊藿药材样品粉粹(过三号标准药典筛，筛孔为0.355mm)，取0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入10mL70％甲醇水溶液，称定重量，超声处理30分钟(超声功率250W，频率45kHZ)，再称定重量，用70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

第二步：确定UPLC-Q-TOF/MS检测参数

(1)色谱条件：

Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1×100mm,1.8μm,Waters,Milford,MA,USA)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速为0.36ml/min，检测波长为270nm。

表3 UPLC的洗脱梯度条件

(2)质谱条件

质量扫描范围：50～1500Da；

干燥气体：N₂；

干燥气流速：800L/h；

干燥器温度：400℃；

离子源温度：120℃；

锥形气流速：100L/h。

第三步：数据处理和多元统计分析：

首先采用Progenesis QI 2.0软件(Waters,Milford,MA,USA)对82批淫羊藿样品的正、负离子模式下的质谱数据进行处理，设置过滤参数如下：

限制保留时间范围为0.1–27min；

限制质量范围，50-1200Da；

质量差，0.05Da；

保留时间窗，0.1min；

最高相对高度，>1.5％

最终得到了正负离子模式下的有效数据矩阵，将此数据矩阵导入Ezinfo3.0软件(Waters，Milford，MA，USA)，并对其进行PCA、HCA、PLS-DA和OPLS-DA等分析，筛选出特征标志物。

实施例1

采用上述第一步～第三步提供的方法，对表2中四个基原淫羊藿样品(前67批)进行UPLC-Q-TOF/MS数据采集，结果如下：

在本发明中，“P”与“Peak”的意义相同，例如，P1＝Peak1。

利用PCA，HCA，PLS-DA对淫羊藿样品的数据进行分析，PCA，HCA结果如附图3和4所示，PLS-DA，载荷图如图5和图6所示。

根据附图3-6所示，结果显示PLS-DA、PCA的得分散点图和HCA的分析结果一致，4种不同基原的淫羊藿可以分为四类，同一基原的淫羊藿样品聚为一类，不同类别的淫羊藿差异显著，说明此方法可以对不同基原的淫羊藿药材进行区分，其中，图5中各区域的字母分别代表的淫羊藿为：“R”代表柔毛淫羊藿，“X”代表淫羊藿，“J”代表箭叶淫羊藿，“C”代表朝鲜淫羊藿。

通过设置VIP>4.0，分析特征标志物，结果显示负离子模式下筛选出22个特征标志物，正离子模式下筛选出12个特征标志物(图6中以空心圆圈出的圆点表示筛选出的特征物)，筛选出的特征标志物的详细信息如下表4所述。

表4不同基原淫羊藿特征标志物质谱数据

更进一步地对特征标志物可视化分析，我们对数据进行热图分析，结果见图7，可以清晰明了地看出不同特征标志物的在不同基原淫羊藿中的差异，具体为：如图7中右下角图表所示，在热图中颜色由浅(最底部)到深(最顶部)表示不同特征标志物在样品中的相对含量由少到多，图7中横坐标为不同的特征标志物(Peak1-Peak28),纵坐标代表不同的样品，将横纵坐标交叉在一起，则可以得到在某一种样品中的某个特征物质含量的颜色，颜色越深则含量越高，例如，在图7中，peak11特征物在J类样品(J-1，J-10，J-7，J-2，J-23，J-4，J-3，J-5，J-6，J-11，J-20，J-9)中颜色为黑色，而在其他样品中的颜色都很浅，证明peak11特征物在箭叶淫羊藿中含量较高，可作为鉴定的特征物质；并且通过图7可以看出，在每一种样品中，不同特征物质的含量均是不相同的。

进一步得出朝鲜淫羊藿筛7个特征标志物，分别为Peak1、17、19、20、21、22和28，其中，化合物P1在淫羊藿，柔毛淫羊藿，箭叶淫羊藿里也存在，但是朝鲜淫羊藿含量较高。P17、19～22和28只存在于朝鲜淫羊藿中，可以作为朝鲜淫羊藿快速鉴别的特征标志物。

进一步得出箭叶淫羊藿5个特征标志物，分别为Peak11、12、16、23和25。其中Peak11、23、25在箭叶淫羊藿中含量最高，Peak 12和16只存在于箭叶淫羊藿中，可以作为箭叶淫羊藿快速鉴别的特征标记物。

进一步得出淫羊藿8个特征标志物，分别为Peak3、4、5、8、10、13、15、和18。其中，Peak、5、8、14和18在淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)中含量最高，P4和10只存在于淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)中，可以作为淫羊藿(Epimedium brevicornumMaxim.)快速鉴定的特征标志物。

进一步得出柔毛淫羊藿2个特征标志物，分别为Peak6和27,其中，Peak6在柔毛淫羊藿中响应最高，而Peak27只存在于柔毛淫羊藿中，因此可以作为柔毛淫羊藿快速鉴别的特征标志物。

实施例2

采用上述第一步～第三步提供的方法，对表2中四个基原淫羊藿样品(前67批)以及巫山淫羊藿(后15批)进行UPLC-Q-TOF/MS数据采集，结果如下：

将实施例1中的的四种不同基原的淫羊藿(共67批次)统称为普通淫羊藿；为了筛选出巫山淫羊藿与上述普通淫羊藿的特征标记物，对原材料中共计82批的样品通过UPLC-Q-TOF/MS采集到的的数据进行OPLS-DA，OPLS-DA和S-plot统计和分析，结果如图8和图9所示。

图8显示巫山淫羊藿(图中标记为“W”)能和四个不同基原的普通淫羊藿(图中标记为“X”、“C”、“R”和“J”，分别代表心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿、淫羊藿和箭叶淫羊藿)完全分开，说明巫山淫羊藿样品和四个不同基原的普通淫羊藿的化学成分存在明显差异。

同样设置VIP>4.0，分析上述巫山淫羊藿和四个不同基原的普通淫羊藿的特征标志物，结果如图9 S-plot图所示，其中，负离子模式下筛选出14个特征标志物，正离子模式下筛选出12个特征标志物(图中以以空心圆圈出的圆点表示筛选出的特征物)，筛选出的特征标志物的详细信息详细信息见表5。

上述淫羊藿以及巫山淫羊藿的特征标志物热图分析结果见图10，如图中右下角图表所示，在热图中颜色由浅(最底部)到深(最顶部)表示不同特征标志物在样品中的相对量由少到多，通过图10，也可以看出巫山淫羊藿与包含四种基原淫羊藿的普通淫羊藿，在每一种样品中，不同特征物质的含量均是不相同的。

表5巫山淫羊藿和淫羊藿特征标志物质谱数据

通过共计67批的普通淫羊藿(包括四种不同基原的淫羊藿)和15批巫山淫羊藿的上述OPLS-DA分析，可以得出以下结论：

(a)巫山淫羊藿筛选出4个特征差异标记物，分别为Peak2、7、9和14,这4个化合物在此5种基原淫羊藿中均存在，但是在巫山淫羊藿中含量最高。其中，化合物7(P7)在巫山淫羊藿中的响应值与普通淫羊藿相比，差别非常显著，因此可以作为巫山淫羊藿快速鉴别的特征标记物。

(b)对67批淫羊藿，如表5中所述，共筛选出12个标记物，分别为Peak3、8、11、13、15、17、19、21、22、23、24和26。其中，峰3、8、11、13、17、19、21、22和23的筛选结果与“检测结果分析1”中的四种不同基原的淫羊藿(共67批次)的PLS-DA(如图5和表4所记载)的筛选结果一致。其中，峰15、24和26在四种基原的普通淫羊藿中均有较高含量，且在巫山淫羊藿中均明显偏低，因此，可以将化合物15，24，26(P15，P24和P26)可以作为包括四种基原的普通淫羊藿药材的共性特征物，用以区别于巫山淫羊藿。

利用对照品比对，UNIFI软件，同时参考参考文献对特征标志物进行鉴定，其中，所用混合标准品标图见图11，特征标志物鉴定结果如下述表6所示：

表6特征标志物的鉴定结果

注:心叶淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim(E.B)；朝鲜淫羊藿E.koreanumNakai(E.K)；柔毛淫羊藿E.pubescens Maxim(E.P)；箭叶淫羊藿E.sagittatumMaxim(E.S)和巫山淫羊藿E.wushanense(E.W)。*通过对照品比对确认的成分；rha，glu，xyl分别表示鼠李糖，葡萄糖和木糖；Ac表示乙酰基。

本发明通过结合代谢组学以及化学计量学手段发现了不同基原淫羊藿的特征标志物，所得标志物为不同基原淫羊藿的鉴定和质量控制提供了科学依据，同时，此研究方法也为其他多基原中药材的鉴定提供了技术参考。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims

1.一种鉴别不同基原淫羊霍的特征标志物的方法，其特征在于，采用高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱对样品进行测定，并结合代谢组学以及化学计量学手段研究不同基原淫羊藿的特征标志物，建立不同基原淫羊藿的鉴别方法，所述不同基原淫羊霍为：心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿和巫山淫羊藿，该方法包括下述步骤：

（1）制备供试品溶液：对淫羊藿样品进行提取；取淫羊藿样品粉末，加入提取液进行超声提取，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；所述提取液为甲醇-水溶液，或乙醇-水，淫羊藿样品与提取液的质量体积比为1g：10ml～50ml，

（2）制备对照品溶液：对照品为：朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷B、2''-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ, 宝藿苷V，宝藿苷VII，朝霍苷E，朝霍定K和淫羊藿新苷A，将上述对照品分别制成甲醇溶液；

（3）采用UPLC-Q-TOF-MS技术对步骤（1）所得供试品溶液，及步骤（2）得到的对照品溶液进行检测，得到化学成分物质色谱峰，其中采用的色谱条件包括：

色谱柱为C18色谱柱，所述色谱柱为2.1 × 100mm，1.8 μm Waters ACQUITY UPLC HSST3 色谱柱，柱温为25℃～40℃，使用的检测器为PDA检测器，检测波长为270nm；

流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为色谱级纯乙腈，洗脱梯度如下所述：

0~5min：85%→75%流动相A，15%→25%流动相B；

5~12min： 75%流动相A，25%流动相B；

12~18min：75%→62%流动相A，25%→38%流动相B；

18~22min： 62%流动相A， 38%流动相B；

22~26min：62%→50%流动相A，38%→50%流动相B；

26~26.1min：50%→25%流动相A，50%→75%流动相B；

26.1~30min：25%→85%流动相A，75%→15%流动相B；

所述流动相A为0~0.5%体积浓度的甲酸水溶液，

流速为0.10 ml/min～0.50ml/min；

质谱条件包括：

质量扫描范围为50Da～1500Da；

干燥气体为N₂，干燥气流速为800L/h，干燥气温度为380℃～400℃；

离子源温度为110℃～130℃；

锥形气流速为100L/h；

（4）采用Progenesis QI 2.0 软件对淫羊藿样品的正、负离子模式下的质谱数据进行处理，设置过滤参数如下：

限制保留时间范围为0.1–27min；

限制质量范围，50-1200 Da；

质量差，0.05Da;

保留时间窗，0.1min；

最高相对高度，> 1.5％；

最终得到了正负离子模式下的有效数据矩阵，将此数据矩阵导入Ezinfo 3.0软件，并对其进行PCA、HCA、PLS-DA和OPLS-DA分析，设置VIP＞4，筛选不同基原淫羊藿的特征标志物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中提取液为体积比70%甲醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中所述淫羊藿样品粉末的质量为2.0g。

4. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中淫羊藿样品与提取液的质量体积比为1g：50ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中所述超声提取的时间为10分钟～60分钟。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中所述超声提取的时间为30分钟。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤（1）中超声功率为250W。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤（1）中超声频率为40kHz。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，步骤（2）中制备的对照品溶液的浓度分别为每1ml含有40、50、50、60、60、30、50、50、50、50、50和50μg的对照品。

10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，步骤（3）中，色谱柱柱温为40℃。

11.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，步骤（3）中，流动相A为0.1%体积浓度的甲酸水溶液。

12. 根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，步骤（3）中，流速为 0.36ml/min。