CN115372503B - 决明子的指纹图谱构建与检测方法、基础鉴定的构建方法及其应用 - Google Patents

决明子的指纹图谱构建与检测方法、基础鉴定的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种决明子的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：取红链霉素‑6‑O‑β‑D‑龙胆双糖苷对照品与橙黄决明素对照品，制备混合对照品溶液；取决明子样品，制备供试品溶液；将所述混合对照品溶液与所述供试品溶液分别进行超高效液相色谱分析，构建决明子的指纹图谱；其中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈与甲醇的混合溶液，流动相B为磷酸水溶液；采用梯度洗脱。该方法具有操作简单、图谱信息丰富、特征性强并且重现性好的优势，为决明子药材的质量控制提供了较为全面、有效的快速评价方法。

Description

决明子的指纹图谱构建与检测方法、基础鉴定的构建方法及 其应用
技术领域
本发明涉及中药鉴别及药物分析技术领域，特别是涉及一种决明子的指纹图谱构建与检测方法、基础鉴定的构建方法及其应用。
背景技术
决明子为豆科植物钝叶决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子。决明子味甘、苦、咸，性微寒，归肝、大肠经，有清热明目，润肠通便之效，是中医常用的清肝、明目、通便药，用于治疗头痛、眩晕、目赤肿痛、视物不清、大便秘结等症。目前钝叶决明与小决明通常通过原植物形态或药材性状鉴别区分基原，缺乏直观的差异性。
决明子的炮制加工早见于梁《本草经集注》：“火炙，作饮极香”。以后唐宋明清皆有记载，如“捣碎，打碎，研”等，唐代始有醋渍法记载。自宋代开始有微炒之法。明代创酒炙的方法，本草纲目中记载“补肝明目，决明子一升，蔓菁子二升，以酒五升煮，暴干为末”。明、清以后基本沿用炒法。炒决明子为中药决明子的临床常用炮制品，决明子炒制后能缓和寒泻之性，具有平肝养目的功效。生、炒决明子功效各异，炒制后其化学成分含量及其组成也发生了变化。目前对于临床应用不同基原的生决明和炒决明缺乏有力的鉴别方法。
另外，决明子常见的伪品有望江南，望江南同为豆科植物，但其苯抽出物含有毒蛋白和柯亚素两种有毒物质，对动物肝肾均有损害，临床上也报道过有关望江南中毒的病例，如将望江南误作决明子使用则存在质量隐患。
目前对决明子的理化鉴别主要以体现酸水解后游离葱醒类的特征为主，未体现决明子中其他化合物的存在。药典对决明子的质量控制仅限于薄层鉴别，以及其水解成分橙黄决明素及大黄酚含量测定，难以体现其整体特性和内在品质。
发明内容
基于此，本发明提供了一种决明子的指纹图谱构建方法，具有操作简单、图谱信息丰富、特征性强并且重现性好的优势，为决明子药材的质量控制提供了较为全面、有效的快速评价方法。
本发明通过如下技术方案实现。
一种决明子的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：
取红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷对照品与橙黄决明素对照品，制备混合对照品溶液；
取决明子样品，制备供试品溶液；
将所述混合对照品溶液与所述供试品溶液分别进行超高效液相色谱分析，构建决明子的指纹图谱；
其中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈与甲醇的混合溶液，流动相B为磷酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～8min，流动相A的体积百分数为24％；8min～15min，流动相A的体积百分数由24％变化至27％；15min～20min，流动相A的体积百分数由27％变化至33％；20min～25min，流动相A的体积百分数由33％变化至50％；25min～30min，流动相A的体积百分数保持为50％；30min～35min，流动相A的体积百分数从50％变化至65％；35min～40min，流动相A的体积百分数从65％变化至95％；40min～45min，流动相A的体积百分数保持为95％。
在其中一个实施例中，所述磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.1％～0.3％。
在其中一个实施例中，所述流动相A中，乙腈与甲醇的体积比为4:1。
在其中一个实施例中，超高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为28℃～32℃；流速为0.28mL/min～0.32mL/min；波长为280nm～290nm。
在其中一个实施例中，制备混合对照品溶液包括如下步骤：
将所述红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷对照品、所述橙黄决明素对照品与甲醇混合。
在其中一个实施例中，制备供试品溶液包括如下步骤：
将所述决明子样品粉碎并过筛，与70％甲醇混合，加热回流提取，然后过滤，取滤液。
在其中一个实施例中，所述决明子样品的药材来源包括钝叶决明与小决明中的一种或多种。
本发明还提供一种如上所述的决明子的指纹图谱构建方法所构建获得的指纹图谱在鉴别不同基原的决明子、鉴别决明子与望江南或鉴别决明子生品与炮制品中的应用。
本发明还提供一种决明子的检测方法，包括如下步骤：
取决明子样品，制备待测溶液；
将所述待测溶液进行超高效液相色谱分析；
其中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈与甲醇的混合溶液，流动相B为磷酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～8min，流动相A的体积百分数为24％；8min～15min，流动相A的体积百分数由24％变化至27％；15min～20min，流动相A的体积百分数由27％变化至33％；20min～25min，流动相A的体积百分数由33％变化至50％；25min～30min，流动相A的体积百分数保持为50％；30min～35min，流动相A的体积百分数从50％变化至65％；35min～40min，流动相A的体积百分数从65％变化至95％；40min～45min，流动相A的体积百分数保持为95％。
在其中一个实施例中，所述磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.1％～0.3％。
在其中一个实施例中，所述流动相A中，乙腈与甲醇的体积比为4:1。
在其中一个实施例中，超高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为28℃～32℃；流速为0.28mL/min～0.32mL/min；波长为280nm～290nm。
本发明还提供一种决明子的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，包括如下步骤：
取决明子样品，制备供试品溶液；
将所述供试品溶液进行超高效液相色谱与质谱联用分析；
其中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈与甲醇的混合溶液，流动相B为冰乙酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～8min，流动相A的体积百分数为24％；8min～15min，流动相A的体积百分数由24％变化至27％；15min～20min，流动相A的体积百分数由27％变化至33％；20min～25min，流动相A的体积百分数由33％变化至50％；25min～30min，流动相A的体积百分数保持为50％；30min～35min，流动相A的体积百分数从50％变化至65％；35min～40min，流动相A的体积百分数从65％变化至95％；40min～45min，流动相A的体积百分数保持为95％。
在其中一个实施例中，所述冰乙酸水溶液中，冰乙酸的体积分数为0.1％～0.3％。
在其中一个实施例中，所述流动相A中，乙腈与甲醇的体积比为4:1。
在其中一个实施例中，超高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为28℃～32℃；流速为0.28mL/min～0.32mL/min；波长为280nm～290nm。
在其中一个实施例中，制备供试品溶液包括如下步骤：
将所述决明子样品粉碎并过筛，与70％甲醇混合，加热回流提取，然后过滤，取滤液。
在其中一个实施例中，质谱分析的条件包括：鞘气流速为30arb～40arb；辅助气流速为8arb～12arb；喷雾电压为3kV～3.5kV；S-lens电压为45V～55V；加热温度为320℃～380℃；毛细管温度为320℃～380℃；
采用正离子模式和/或负离子模式；扫描范围为100m/z～1500m/z；归一化碰撞能量为20eV～40eV。
与现有技术相比较，本发明的决明子的指纹图谱构建方法具有如下有益效果：
本发明通过采用超高效液相色谱技术，限定流动相选择为乙腈与甲醇的混合溶液，以及磷酸水溶液，采用梯度洗脱并限定具体的洗脱程序，成功构建了决明子的UPLC指纹图谱，能充分反应样品的特征峰信息，展示了决明子的化学成分特征，从而达到指纹图谱信息丰富、特征性强的目的；同时可用于鉴别不同基原的决明子、正品与伪品望江南，以及生品与炮制品，为决明子药材质量控制提供科学的新方法。
进一步地，本发明所述的决明子的指纹图谱构建方法操作简单并且重现性好。
附图说明
图1为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同提取溶剂考察对比图；
图2为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同提取方式考察对比图；
图3为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同提取时间考察对比图；
图4为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同检测波长考察对比图；
图5为本发明提供的钝叶决明3D光谱扫描图；
图6为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同有机相考察对比图；
图7为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同有机相考察对比图；
图8为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同水相考察对比图；
图9为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同酸水浓度考察对比图；
图10为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同色谱柱考察对比图；
图11为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱不同柱温考察对比图；
图12为本发明提供的钝叶决明药材特征图谱专属性考察；
图13为本发明提供的钝叶决明对照药材指纹图谱；
图14为本发明提供的钝叶决明药材对照指纹图谱；
图15为本发明提供的钝叶决明药材指纹图谱叠加图；
图16为本发明提供的钝叶决明和小决明药材的指纹图谱对比图；
图17为本发明提供的正品与伪品药材的指纹图谱对比图；
图18为本发明提供的炒制钝叶决明饮片对照指纹图谱；
图19为本发明提供的炒制钝叶决明饮片指纹图谱叠加图；
图20为本发明提供的钝叶决明药材与炒制钝叶决明饮片的指纹图谱对比图；
图21为本发明提供的小决明药材与炒制小决明饮片的指纹图谱对比图；
图22为本发明提供的钝叶决明药材的供试品溶液总离子流图及紫外吸收色谱图；
图23为本发明提供的炒制钝叶决明饮片的供试品溶液总离子流图及紫外吸收色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种决明子的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：
取红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷对照品与橙黄决明素对照品，制备混合对照品溶液；
取决明子样品，制备供试品溶液；
将混合对照品溶液与供试品溶液分别进行超高效液相色谱分析，构建决明子的指纹图谱；
其中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈与甲醇的混合溶液，流动相B为磷酸水溶液；采用梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：0min～8min，流动相A的体积百分数为24％；8min～15min，流动相A的体积百分数由24％变化至27％；15min～20min，流动相A的体积百分数由27％变化至33％；20min～25min，流动相A的体积百分数由33％变化至50％；25min～30min，流动相A的体积百分数保持为50％；30min～35min，流动相A的体积百分数从50％变化至65％；35min～40min，流动相A的体积百分数从65％变化至95％；40min～45min，流动相A的体积百分数保持为95％。
在一个具体的示例中，磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.1％～0.3％。优选地，磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.2％。
在一个具体的示例中，流动相A中，乙腈与甲醇的体积比为4:1。
在一个具体的示例中，超高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为28℃～32℃；流速为0.28mL/min～0.32mL/min；波长为280nm～290nm。
优选地，柱温为30℃；流速为0.3mL/min；波长为285nm。
优选地，色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Scepter(150mm×2.1mm,1.9μm)。
在一个具体的示例中，制备混合对照品溶液包括如下步骤：
将红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷对照品、橙黄决明素对照品与甲醇混合。
在一个具体的示例中，制备供试品溶液包括如下步骤：
将决明子样品粉碎并过筛，与70％甲醇混合，加热回流提取，然后过滤，取滤液。
更具体地，制备供试品溶液包括如下步骤：
将决明子样品粉碎并过三号筛，加70％乙醇，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
在一个具体的示例中，决明子的药材来源包括钝叶决明与小决明中的一种或多种。
在一个具体的示例中，决明子样品包括药材(生品)与饮片(炮制品)中的一种或多种。更具体地，饮片为炒决明子饮片。
本发明还提供一种上述决明子的指纹图谱构建方法所构建获得的指纹图谱在鉴别不同基原的决明子、鉴别决明子与望江南或鉴别决明子生品与炮制品中的应用。
在一个具体的示例中，不同基原的决明子包括钝叶决明与小决明中的一种或多种。
在一个具体的示例中，决明子生品为决明子药材。
在一个具体的示例中，炮制品为炒决明子饮片。
本发明还提供一种决明子的检测方法，包括如下步骤：
取决明子样品，制备待测溶液；
将待测溶液进行超高效液相色谱分析；
其中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈与甲醇的混合溶液，流动相B为磷酸水溶液；采用梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：0min～8min，流动相A的体积百分数为24％；8min～15min，流动相A的体积百分数由24％变化至27％；15min～20min，流动相A的体积百分数由27％变化至33％；20min～25min，流动相A的体积百分数由33％变化至50％；25min～30min，流动相A的体积百分数保持为50％；30min～35min，流动相A的体积百分数从50％变化至65％；35min～40min，流动相A的体积百分数从65％变化至95％；40min～45min，流动相A的体积百分数保持为95％。
在一个具体的示例中，决明子样品包括药材(生品)与饮片(炮制品)中的一种或多种。更具体地，饮片为炒决明子饮片。
在一个具体的示例中，决明子样品的药材来源包括钝叶决明与小决明中的一种或多种。
在一个具体的示例中，磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.1％～0.3％。优选地，磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.2％。
在一个具体的示例中，流动相A中，乙腈与甲醇的体积比为4:1。
在一个具体的示例中，超高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为28℃～32℃；流速为0.28mL/min～0.32mL/min；波长为280nm～290nm。
优选地，柱温为30℃；流速为0.3mL/min；波长为285nm。
优选地，色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Scepter(150mm×2.1mm,1.9μm)。
本发明还提供一种决明子的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，包括如下步骤：
取决明子样品，制备供试品溶液；
将供试品溶液进行超高效液相色谱与质谱联用分析；
其中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈与甲醇的混合溶液，流动相B为冰乙酸水溶液；采用梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：0min～8min，流动相A的体积百分数为24％；8min～15min，流动相A的体积百分数由24％变化至27％；15min～20min，流动相A的体积百分数由27％变化至33％；20min～25min，流动相A的体积百分数由33％变化至50％；25min～30min，流动相A的体积百分数保持为50％；30min～35min，流动相A的体积百分数从50％变化至65％；35min～40min，流动相A的体积百分数从65％变化至95％；40min～45min，流动相A的体积百分数保持为95％。
在一个具体的示例中，冰乙酸水溶液中，冰乙酸的体积分数为0.1％～0.3％。优选地，冰乙酸水溶液中，冰乙酸的体积分数为0.2％。
在一个具体的示例中，流动相A中，乙腈与甲醇的体积比为4:1。
在一个具体的示例中，超高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为28℃～32℃；流速为0.28mL/min～0.32mL/min；波长为280nm～290nm。
优选地，柱温为30℃；流速为0.3mL/min；波长为285nm。
优选地，色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Scepter(150mm×2.1mm,1.9μm)。
在一个具体的示例中，制备供试品溶液包括如下步骤：
将决明子样品粉碎并过筛，与70％甲醇混合，加热回流提取，然后过滤，取滤液。
更具体地，制备供试品溶液包括如下步骤：
将决明子样品粉碎并过三号筛，加70％乙醇，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
在一个具体的示例中，质谱分析的条件包括：鞘气流速为30arb～40arb；辅助气流速为8arb～12arb；喷雾电压为3kV～3.5kV；S-lens电压为45V～55V；加热温度为320℃～380℃；毛细管温度为320℃～380℃；
采用正离子模式和/或负离子模式；扫描范围为100m/z～1500m/z；归一化碰撞能量为20eV～40eV。
以下结合具体实施例对本发明的决明子的指纹图谱构建方法做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。
实施例1
本实施例提供一种决明子的指纹图谱构建方法，具体如下：
1、仪器和试药
仪器：Waters高效液相色谱仪(H-Class，沃特世公司)；SHIMADZU Shim-packScepter C18色谱柱(2.1mm×150mm，1.9μm)；万分之一分析天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)；百万分之一分析天平(XP26，梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器(KQ500D，昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(HWS28型，上海一恒科技有限公司型号)；超纯水系统(Milli-Q Direct，默克股份有限公司)。
试剂：乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；乙腈(默克股份有限公司，色谱纯)；甲醇(默克股份有限公司，色谱纯)；水为超纯水(实验室自制)。
试药：异红镰霉素龙胆二糖苷(批号：20072403，含量：98.51％，成都普菲德生物科技有限公司)；决明子苷(批号：wkq17032307，含量：98％，四川维克奇生物科技有限公司)；大黄酚-1-O-β-D-四吡喃葡萄糖苷(批号：18032107，含量：95.03％，成都格利普生物科技有限公司)；决明子苷B2(批号：CFS202002，含量：98％，深圳丽景有限公司)；决明子苷B(批号：19090401，含量：98.86％，成都普菲德生物科技有限公司)；决明子苷C(批号：19081501，含量：99.66％，成都普菲德生物科技有限公司)；橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷(批号：DST211106-234，含量：99.3％，乐天美医药有限公司)；橙黄决明素(批号：111900-201605，含量：98.3％，中国食品药品检定研究院)；大黄酚(批号：110796-201621，含量：99.2％，中国食品药品检定研究院)；钝叶决明素(批号：21060102，含量：99.23％，成都普菲德生物科技有限公司)；决明蒽醌(批号：21032909，含量：99.58％，成都普菲德生物科技有限公司)；黄决明素(批号：wkq18052201，含量：98％，四川维克奇生物科技有限公司)；大黄素(批号：110756-201512，含量：98.7％，中国食品药品检定研究院)；大黄素甲醚(批号：110758-201415，含量：99.1％，中国食品药品检定研究院)；决明子(钝叶决明)对照药材(批号：121011-201807，中国食品药品检定研究院)；决明子(小决明)对照药材(批号：121544-202002，中国食品药品检定研究院)；16批决明子药材经中国中医科学院中药研究所鉴定为豆科植物钝叶决明Cassia obtusifolia L.的干燥成熟种子，1批决明子药材经鉴定为豆科植物小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子。产地及编号见表1。
表1样品信息表
2、色谱条件与供试品溶液制备
2.1色谱条件
采用SHIMADZU Shim-pack Scepter(150mm×2.1mm,1.9μm)色谱柱；以乙腈-甲醇(4:1)为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.30ml；柱温为30℃；检测波长为285nm。
表2梯度洗脱表
2.2对照品溶液的配制
取红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷对照品、橙黄决明素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷200μg、橙黄决明素100μg的混合溶液。
2.3供试品溶液的制备方法
取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％乙醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4测定法
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。
3、供试品溶液制备方法考察
3.1提取溶剂考察
分别取同一批决明子(钝叶决明)药材粉末(批号：S4，过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同溶剂：50％甲醇、70％甲醇、甲醇、50％乙醇、70％乙醇、乙醇各25ml，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.1”项下规定色谱条件进行测定。结果如图1所示，通过对比6种不同提取溶剂的特征图谱可发现，综合考虑峰提取效率，以70％乙醇为提取溶剂时“总峰面积/称样量”最大，因此，选择提取溶剂为70％乙醇。
3.2提取方式考察
分别取决明子(钝叶决明)药材粉末(批号：S4，过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，分别超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，加热回流30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.1”项下规定色谱条件进行测定。结果如图2所示，通过对比2种不同提取方式的特征图谱可发现，不同提取方式色谱峰的数目、峰型、分离效果及“总峰面积/称样量”无明显差异，为保证提取完全，故选择提取方式为加热回流。
3.3提取时间考察
分别取决明子(钝叶决明)药材粉末(批号：S4，过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，分别加热回流30分钟、45分钟以及60分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.1”项下规定色谱条件进行测定。结果如图3所示，不同的提取时间特征图谱影响并不大，因此，从节约能源的角度，选择提取时间为30分钟。
4、色谱条件优化
4.1检测波长的确定
取决明子(钝叶决明)药材粉末(批号：S4，过三号筛)约0.5g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录200nm～400nm范围内的吸收光谱。结果如图4～5所示，通过对比不同检测波长的色谱图，发现在285nm波长下，峰响应和信息量更丰富且干扰小，分离度较好，因此综合考虑，选取285nm作为检测波长。
4.2流动相的优化
取同一批供试品(批号：S4)溶液，通过对比不同流动相的色谱图，发现不同有机相体系和水相体系对各峰分离度及峰型影响较大，而不同浓度酸水溶液流动相对各峰分离度及峰型影响较小，其中以乙腈-甲醇(4:1)-0.2％磷酸作为流动相各特征峰型和分离效果更好，综合考虑选择，乙腈-甲醇(4:1)-0.2％磷酸溶液作为流动相，见图6～9。
4.3不同色谱柱的选择
取同一批供试品(批号：S4)溶液，通过对比不同色谱柱的色谱图，发现不同品牌色谱柱对各峰分离度及峰型影响较大，其中以SHIMADZU Shim-pack Scepter C18(2.1mm×150mm，1.9μm)对各特征峰型和分离效果更好，综合考虑选择，SHIMADZU Shim-packScepter C18(2.1mm×150mm，1.9μm)作为色谱柱，见图10。
4.4不同柱温考察
取同一批供试品(批号：S4)溶液，采用同一色谱柱和液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别在柱温(25℃、30℃、35℃)下进样，记录色谱图。结果表明，通过对比3种不同柱温的色谱图，发现不同柱温对各特征峰分离度影响较大，其中以柱温30℃分离效果更好，综合考虑选择，选择决明子特征图谱的柱温为30℃，见图11。
5、方法学考察
5.1专属性考察
取决明子(钝叶决明)药材粉末(批号：S4，过三号筛)约0.5g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液、“2.3”项下对照品溶液与空白溶剂各1μl，按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果如图12所示，供试品与对照品相应的保留时间处有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，说明建立的方法专属性良好。
5.2精密度考察
取同一批决明子(钝叶决明)药材(S4)约0.5g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样测定6次。以红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷为参照峰S1，计算峰1～峰8与S1峰的相对保留时间及相对峰面积及其RSD值；与橙黄决明素为参照峰S2，计算峰9～峰17的相对保留时间及相对峰面积及其RSD值。结果表明，17个共有峰的相对保留时间RSD值在0.00％～0.18％范围内，其相对保峰面积RSD值在0.00％～2.15％范围内，说明仪器精密度良好。
5.3重现性考察
取同一批决明子(钝叶决明)药材(S4)，按照“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷为参照峰S1，计算峰1～峰8与S1峰的相对保留时间及相对峰面积及其RSD值；与橙黄决明素为参照峰S2，计算峰9～峰17的相对保留时间及相对峰面积及其RSD值。结果表明，17个共有峰的相对保留时间RSD值在0.45％～0.09％范围内，其相对保峰面积RSD值在0.00％～2.43％范围内，说明所建立的方法重现性良好。
5.4稳定性考察
取同一批决明子(钝叶决明)药材(S4)，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、3、6、9、12和24小时分别进样，以红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷为参照峰S1，计算峰1～峰8与S1峰的相对保留时间及相对峰面积及其RSD值；与橙黄决明素为参照峰S2，计算峰9～峰17的相对保留时间及相对峰面积及其RSD值。结果表明，各特征峰的相对保留时间RSD值在0.45％～1.49％范围内，其相对保峰面积RSD值在0.13％～2.31％范围内，表明供试品在24小时内稳定性良好。
5.5中间精密度考察
由不同分析人员在不同实验室和不同品牌仪器上操作。取同一批决明子(钝叶决明)药材(S4)，按照“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷为参照峰S1，计算峰1～峰8与S1峰的相对保留时间及相对峰面积及其RSD值；与橙黄决明素为参照峰S2，计算峰9～峰17的相对保留时间及相对峰面积及其RSD值。结果表明，各特征峰的相对保留时间RSD值在0.05％～1.03％范围内，其相对保峰面积RSD值在0.37％～2.17％范围内，说明所建立的方法能在不同设备和实验室等不同条件下重现，该方法中间精密度良好。
6、决明子(钝叶决明)指纹图谱的建立
6.1决明子(钝叶决明)指纹图谱测定结果
取16批决明子(钝叶决明)药材样品，按上述制备方法和色谱条件测定样品特征图谱，以红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷色谱峰为参照峰S1，以橙黄决明素色谱峰为参照峰S2，计算峰1～峰8与S1峰、峰9～峰17与S2峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算其RSD值，实验结果见表3与表4。结合建立的指纹图谱分析，不同产地的决明子(钝叶决明)的成分种类基本一致。
表3 16批决明子(钝叶决明)药材指纹图谱(相对保留时间)
/>
表4 16批决明子(钝叶决明)药材指纹图谱(相对峰面积)
6.2决明子(钝叶决明)指纹图谱共有模式的建立
取决明子(钝叶决明)对照药材(批号：121011-201807，中国食品药品检定研究院)及16批决明子(钝叶决明)药材，按上述色谱条件与试品溶液制备方法，进样测定，得到决明子(钝叶决明)对照药材指纹图谱，如图13所示；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》按平均数法生成对照图谱，建立决明子(钝叶决明)药材对照指纹图谱，如图14所示。16批决明子(钝叶决明)药材的指纹图谱叠加图如图15所示。
确定决明子(钝叶决明)的特征图谱应呈现17个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的17个特征峰保留时间相对应，其中2个峰应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应；与红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷参照物相对应的峰为S1峰，计算峰1～峰8与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，规定值为：0.45(峰1)、0.48(峰2)、0.95(峰3)、1.18(峰5)、1.22(峰6)、1.45(峰7)、1.47(峰8)；与橙黄决明素参照物相对应的峰为S2峰，计算峰9～峰17与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，规定值为0.75(峰9)、0.83(峰10)、1.11(峰12)、1.28(峰13)、1.30(峰14)、1.33(峰15)、1.36(峰16)、1.41(峰17)。
6.3不同基原及其伪品鉴别
6.3.1不同基原(钝叶决明、小决明)指纹图谱对比
取两种基原(钝叶决明、小决明)的决明子对照药材以及批号为S17的小决明子药材指纹图谱进行对比研究，如图16所示。结果显示，两种不同基原的决明子对照药材指纹图谱基本一致，都有相同的16个特征峰，其中决明子(小决明)对照药材及批号为S17的小决明子药材指纹图谱均缺少特征峰7(决明子苷B)，可以作为决明子(钝叶决明)和决明子(小决明)的区分点。即若存在峰7(决明子苷B)，则判定其基原为钝叶决明，反之不存在峰7判定其基原为小决明。
6.3.2伪品指纹图谱对比
采用决明子(钝叶决明)药材供试品制备方法和指纹图谱检测方法，对批号为S18的望江南进行指纹图谱研究，并对两种基原的决明子对照药材指纹图谱进行对比，结果如图17所示。结果显示，伪品望江南与两种不同基原的决明子对照药材指纹图谱有较大差异，但具有7个与决明子一致的特征峰，能很好与决明子两个基原区别。因此，可以通过色谱峰1、峰2、峰5、峰6、峰8、峰10、峰12、峰13、峰15区分决明子药材及其伪品。因此，制定峰1、峰2、峰5、峰6、峰8、峰10、峰12、峰13、峰15的相对保留时间可以区分决明子伪品。
6.4生品与炮制品鉴别
6.4.1炒决明子饮片炮制
参考中国药典2015年版一部决明子项下炮制规定制成决明子饮片，具体方法为：取净决明子药材，照清炒法(通则0213)炒至微鼓起、有香气。用时捣碎。样品信息表见表5。
表5样品信息表
6.4.2指纹图谱测定结果
对16批炒决明子(钝叶决明)饮片指纹图谱进行分析，以红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷色谱峰为参照峰S1，以橙黄决明素色谱峰为参照峰S2，计算峰1～峰7与S1峰、峰8～峰17与S2峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，实验结果见表6与表7。
表6 16批炒决明子(钝叶决明)饮片指纹图谱(相对保留时间)
表7 16批炒决明子(钝叶决明)饮片指纹图谱(相对峰面积)
/>
6.4.3炒决明子指纹图谱共有模式的建立
取16批炒决明子(钝叶决明)饮片，按“2.1”项下色谱条件与“2.3”项下供试品溶液制备方法，进样测定；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》按平均数法生成对照图谱，建立炒决明子(钝叶决明)饮片对照指纹图谱，如图18所示。通过匹配有17个共有峰，对16批炒决明子(钝叶决明)饮片进行共有峰标识，如图19所示。
6.4.4生品与炮制品指纹图谱对比
(1)决明子(钝叶决明)生品与炮制品对比
将上述建立决明子(钝叶决明)药材和炒决明子(钝叶决明)饮片对照指纹图谱进行对比，通过匹配有16个共有峰，如图20所示。其中炒决明子(钝叶决明)峰8缺失以及增加特征峰18，可以作为决明子(钝叶决明)和炒决明子(钝叶决明)的区分点。
(2)决明子(小决明)生品与炮制品对比
取批号为S17的小决明子药材与其对应的炮制品(批号为CS17)指纹图谱进行对比，通过匹配有16个共有峰，如图21所示。其中炒决明子(小决明)峰8缺失，可以作为决明子(小决明)和炒决明子(小决明)的区分点。
综上所述，通过峰8可以区别不同基原(钝叶决明、小决明)下的生品与炮制品。即若存在峰8，则判定其为生品，反之不存在峰8判定其为炮制品。
实施例2
本实施例提供一种决明子的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，具体如下：
1、液相-质谱条件
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack Scepter C18(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)；以乙腈：甲醇(4:1)为流动相A，以0.2％冰乙酸溶液为流动相B，按表8中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；检测波长为285nm。
质谱条件如表9所示。
表8梯度洗脱表
表9质谱参数表
2、供试品溶液制备方法同实施例1“2.3”项下。
3、指认结果
3.1决明子(钝叶决明)药材质谱指认
采用上述液相色谱和质谱分析条件，对供试品溶液进行检测，得到相应的质谱图与紫外吸收图，见图22；化合物信息见表10与表11。
表10决明子(钝叶决明)中化合物质谱指认结果
/>
表11决明子(钝叶决明)中未知化合物推测结果
3.2决明子(钝叶决明)饮片质谱指认
采用上述液相色谱和质谱分析条件，对供试品溶液进行检测，得到相应的质谱图与紫外吸收图，见图23；化合物信息见表12与表13。
表12炒决明子(钝叶决明)中化合物质谱指认结果
/>
/>
表13炒决明子(钝叶决明)中未知化合物推测结果
/>
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (4)

1.一种基于决明子的指纹图谱鉴别决明子与望江南的方法，其特征在于，所述决明子的指纹图谱的构建包括如下步骤：
取红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷对照品与橙黄决明素对照品，制备混合对照品溶液；
取决明子样品，制备供试品溶液；
将所述混合对照品溶液与所述供试品溶液分别进行超高效液相色谱分析，构建决明子的指纹图谱；
其中，超高效液相色谱分析的条件包括：采用SHIMADZU Shim-pack Scepter C18色谱柱，填料粒径为1.9μm，内径为2.1mm，柱长为150mm；流动相A为乙腈与甲醇的混合溶液，所述乙腈与甲醇的体积比为4:1，流动相B为磷酸水溶液，所述磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.1％～0.3％；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～8min，流动相A的体积百分数为24％；8min～15min，流动相A的体积百分数由24％变化至27％；15min～20min，流动相A的体积百分数由27％变化至33％；20min～25min，流动相A的体积百分数由33％变化至50％；25min～30min，流动相A的体积百分数保持为50％；30min～35min，流动相A的体积百分数从50％变化至65％；35min～40min，流动相A的体积百分数从65％变化至95％；40min～45min，流动相A的体积百分数保持为95％；
制备供试品溶液包括如下步骤：
将所述决明子样品粉碎并过筛，与乙醇体积分数为70％的乙醇水溶液混合，加热回流提取，然后过滤，取滤液；
所述决明子样品的药材来源包括钝叶决明与小决明中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的基于决明子的指纹图谱鉴别决明子与望江南的方法，其特征在于，所述磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.2％。
3.根据权利要求1所述的基于决明子的指纹图谱鉴别决明子与望江南的方法，其特征在于，超高效液相色谱分析的条件还包括：柱温为28℃～32℃；流速为0.28mL/min～0.32mL/min；波长为280nm～290nm。
4.根据权利要求1所述的基于决明子的指纹图谱鉴别决明子与望江南的方法，其特征在于，制备混合对照品溶液包括如下步骤：
将所述红链霉素-6-O-β-D-龙胆双糖苷对照品、所述橙黄决明素对照品与甲醇混合。
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