CN110749673B - 一种初榨橄榄油对照指纹图谱及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种初榨橄榄油对照指纹图谱及其构建方法与应用，属于检测技术领域。本发明采用超高效液相色谱‑荧光检测对系列特级初榨橄榄油进行分析，获得了特级初榨橄榄油中各种成分的色谱信息，突破了传统使用GC‑MS方法、基于对食用油脂肪酸组成而构建指纹图谱的局限性，还解决了传统指纹图谱仅使用单一成分进行判别而导致假阳性的问题。同时，对系列特级初榨橄榄油色谱信息进行相似度计算，建立初榨橄榄油对照指纹图谱，强化了指纹图谱信息的多态性，从初榨橄榄油物质组成、分布和含量多角度反映与食用油之间的差异，有利于提高鉴别的准确性，能够方便、快捷、准确地鉴别初榨橄榄油的好坏。

Description

一种初榨橄榄油对照指纹图谱及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种初榨橄榄油对照指纹图谱及其构建方法与应用。
背景技术
橄榄油是指以油橄榄鲜果为原料制取的油脂(不包含溶剂浸提或重酯化过程获得的油脂)，并且不掺杂其他种类的油脂。初榨橄榄油具有最高的品质和营养价值，含有丰富的不饱和脂肪酸、角鲨烯、多酚、维生素等天然活性物质，具有抗氧化、调节胆固醇、预防癌症、美容等功效，价格比其他食用植物油高很多。由于橄榄油以其独特的理化特性和极佳的营养保健功效受到人们的青睐，鉴于此，部分商人受经济利益驱使，橄榄油掺假问题一直较为严重。目前最普遍的橄榄油掺伪掺假主要分为两种：一种是在高价橄榄油中掺入低价植物油；另一种是将低级别的初榨橄榄油或橄榄果渣油添加到特级初榨橄榄油中。
由于橄榄油掺假鉴定难度大，相关检测和贸易标准也远远不能满足实际需求。传统的初榨橄榄油掺伪鉴别检测方法是通过检测橄榄油的质量指标和特征指标(酸值、过氧化值、溶剂残留、脂肪酸组成、不皂化物和紫外吸光度等)来对其质量或真伪进行判断。此外，国际上最常用的一种鉴定橄榄油掺假情况的标准方法是甾醇分析法。然而，该方法存在样品前处理过程复杂、干扰因素多、重复性差、检测周期长等问题。已有报道的橄榄油鉴定方法包括近红外光谱法、蜡含量法、核磁共振波谱法和气相色谱-质谱联用法等。这些方法都在一定程度上发挥了积极作用，但由于橄榄油掺假的复杂性和掺入其他植物油指标不同，使上述分析方法受到挑战，常给鉴定带来很大的困惑。因此，有必要构建一种较为稳定的、实用性及准确性较高的、基于初榨橄榄油指纹图谱的掺假鉴定方法，用以打击橄榄油以次充好和掺假等不良现象。
标准指纹图谱是代表一批同类样品指纹图谱共同特征的图谱。以往对初榨橄榄油指纹图谱的研究侧重在单个成分。目前研究最为广泛和深入的是脂肪酸指纹图谱的研究。但是一些研究表明，部分植物油的脂肪酸组成比较相似，所以通过脂肪酸的指纹图谱识别和鉴定这些相似脂肪酸组成的油脂是有一定风险的，并且掺假的种类和掺入量范围也比较大，因此仅仅利用脂肪酸指纹图谱来鉴别掺假油存在误判的可能性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种初榨橄榄油对照指纹图谱及其构建方法与应用。本发明提供的初榨橄榄油对照指纹谱图能够快速、准确地评价初榨橄榄油的品质。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种初榨橄榄油对照指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
将10～30批次的特级初榨橄榄油与溶剂混合，进行提取，得到系列特级初榨橄榄油样品；
对所述系列特级初榨橄榄油样品超高效液相色谱-荧光检测，得到系列特级初榨橄榄油样品色谱信息；
对所述系列特级初榨橄榄油样品色谱信息进行相似度计算，并得到所述初榨橄榄油对照指纹图谱。
优选地，所述溶剂为甲醇、乙腈或乙醇。
优选地，所述特级初榨橄榄油与溶剂的用量比为1.0～5.0g:5～20mL。
优选地，所述超高效液相色谱-荧光检测的条件包括：
色谱柱：RP-C18色谱柱或SEVA C18色谱柱；
流速：0.1～0.4mL/min；
激发波长：300nm；
发射波长：350nm；
柱温：25～40℃；
进样量：0.1～3.0μL；
流动相：A为体积浓度为0.0～0.3％的甲酸甲醇溶液或体积浓度为0.0～0.3％的甲酸乙腈溶液；B为体积浓度为0.05～0.3％的甲酸水溶液；
梯度洗脱程序为：
0～3min：10％A，90％B；
3～45min：55％A，45％B。
优选地，所述相似度计算所用软件为国家药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》A版。
优选地，所述初榨橄榄油对照指纹图谱中指纹峰的峰面积大于5％。
本发明还提供了上述技术方案所述的构建方法得到的初榨橄榄油对照指纹图谱。
本发明还提供了上述技术方案所述的初榨橄榄油对照指纹图谱在检测初榨橄榄油品质领域中的应用。
优选地，所述应用包括以下步骤：
将初榨橄榄油与溶剂混合，进行提取，得到初榨橄榄油溶液；
对所述初榨橄榄油溶液进行超高效液相色谱-荧光检测，得到初榨橄榄油溶液色谱信息；
以所述初榨橄榄油对照指纹图谱为基准，对所述初榨橄榄油溶液色谱信息相似度计算，以达到评价初榨橄榄油品质的目的。
优选地，所述应用还包括：
将香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸标准品用溶剂溶解，得到包含香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸的混合标准溶液；
对所述混合标准溶液进行超高效液相色谱-荧光检测，得到混合标准溶液色谱信息；
以所述混合标准溶液色谱信息为基准，对所述初榨橄榄油溶液的色谱信息进行归属。
本发明提供了一种初榨橄榄油对照指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：将10～30批次的特级初榨橄榄油与溶剂混合，进行提取，得到系列特级初榨橄榄油样品；对所述系列特级初榨橄榄油样品进行超高效液相色谱-荧光检测，得到系列特级初榨橄榄油样品色谱信息；对所述系列特级初榨橄榄油样品色谱信息进行相似度计算，并得到所述初榨橄榄油对照指纹图谱。本发明采用超高效液相色谱-荧光检测对系列特级初榨橄榄油样品进行分析，获得了特级初榨橄榄油中各种成分的色谱信息，突破了传统使用GC-MS方法、基于对食用油脂肪酸组成而构建指纹图谱的局限性，还解决了传统指纹图谱中仅使用单一成分进行判别而导致假阳性的问题。同时，对系列特级初榨橄榄油进行相似度计算，建立基于共有峰的初榨橄榄油对照指纹图谱，强化了对照指纹图谱信息的多态性，从初榨橄榄油物质组成、分布和含量多角度反映与食用油之间的差异，有利于提高鉴别的准确性，能够方便、快捷、准确地鉴别初榨橄榄油的好坏。对初榨橄榄油日常质量分析、市场监督和工业化生产等的检测具有很高的应用价值。
本发明还提供了上述技术方案所述的初榨橄榄油对照指纹谱图在检测初榨橄榄油品质领域中的应用。由于本发明建立的初榨橄榄油对照指纹图谱可参照峰数量多，能够更加灵敏、准确地评价出初榨橄榄油的品质。
附图说明
图1为9个特级初榨橄榄油色谱信息重叠图；
图2为初榨橄榄油对照指纹图谱(a)和混合标准溶液色谱图(b)；
图3为特级初榨橄榄油和大豆油的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种初榨橄榄油对照指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
将10～30批次的特级初榨橄榄油与溶剂混合，进行提取，得到系列特级初榨橄榄油样品；
对所述系列特级初榨橄榄油样品进行超高效液相色谱-荧光检测，得到系列特级初榨橄榄油样品色谱信息；
对所述系列特级初榨橄榄油样品色谱信息进行相似度计算，得到所述初榨橄榄油对照指纹图谱。
本发明将10～30批次的特级初榨橄榄油与溶剂混合，进行提取，得到系列特级初榨橄榄油样品。
在本发明中，所述特级初榨橄榄油为不添加任何其他物质的初榨橄榄油，这样的特级初榨橄榄油得到的初榨橄榄油对照指纹峰准确度最高。本发明对所述特级初榨橄榄油的来源不做具体限定，采用本领域技术人员能够获取的不添加任何其它物质的初榨橄榄油即可。
在本发明中，所述特级初榨橄榄油与溶剂的用量比优选为1.0～5.0g:5～20mL；所述溶剂优选为甲醇、乙腈或乙醇。
在本发明中，所述混合优选在聚乙烯管中进行。在本发明中，所述提取的方式优选为涡旋提取；所述涡旋提取的时间优选为2～120s，进一步优选为120s。
提取结束后，本发明优选还包括将所得提取液进行离心后，取上清液过滤，得到所述特级初榨橄榄油样品。在本发明中，所述离心的转速优选为5000～15000r/min，进一步优选为10000r/min，时间优选为10～30min，进一步优选为20min；所述过滤用滤膜优选为0.22μm有机相微孔滤膜。
得到系列特级初榨橄榄油样品后，本发明对所述系列特级初榨橄榄油样品进行超高效液相色谱-荧光检测，得到系列特级初榨橄榄油样品色谱信息。
在本发明中，所述超高效液相色谱-荧光检测的条件包括：
色谱柱优选为RP-C18色谱柱或SEVA C18色谱柱，进一步优选为SEVA C18色谱柱；
流速优选为0.1～0.4mL/min，进一步优选为0.3mL/min；
激发波长优选为300nm；
发射波长优选为350nm；
柱温优选为25～40℃，进一步优选为30℃；
进样量优选为0.1～3.0μL，进一步优选为0.1μL；
流动相：A优选为体积浓度为0.0～0.3％的甲酸甲醇或体积浓度为0.0～0.3％的甲酸甲醇甲酸乙腈溶液，进一步优选为体积浓度为0.1％甲酸甲醇；B优选为体积浓度为0.05～0.3％的甲酸水溶液，进一步优选为体积浓度为0.1％甲酸水溶液；
梯度洗脱程序优选为：
0～3min：10％A，90％B；
3～45min：55％A，45％B。
得到系列特级初榨橄榄油样品色谱信息后，本发明对所述系列特级初榨橄榄油样品色谱信息进行相似度计算，并得到所述初榨橄榄油对照指纹图谱。
在本发明中，所述相似度计算所用软件优选为国家药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》A版。
在本发明中，所述初榨橄榄油对照指纹图谱中指纹峰的峰面积优选大于5％。在本发明中，所述初榨橄榄油对照指纹图谱中指纹峰的峰面积大于5％，保证了对照指纹图谱中具有更多的色谱信息，且峰面积大于5％，避免了杂质峰的影响，提高了对照指纹图谱的准确度。
本发明还提供了上述技术方案所述的构建方法得到的初榨橄榄油对照指纹图谱。在本发明中，所述初榨橄榄油对照指纹图谱中指纹峰的峰面积优选大于5％。
本发明提供的初榨橄榄油对照指纹图谱是基于超高效液相色谱-荧光检测对特级初榨橄榄油进行分析，获得特级初榨橄榄油中众多物质的色谱信息，然后对系列特级初榨橄榄油色谱信息进行相似度计算，获得共有模式作为初榨橄榄油对照指纹图谱；同时，特级初榨橄榄油对照指纹图谱中只要峰面积大于5％的色谱信息，均会体现在初榨橄榄油对照指纹图谱中，提高了对照指纹图谱的准确性。
本发明还提供了上述技术方案所述的初榨橄榄油对照指纹图谱在检测初榨橄榄油品质领域中的应用。
在本发明中，所述应用包括以下步骤：
将初榨橄榄油与溶剂混合，进行提取，得到初榨橄榄油溶液；
对所述初榨橄榄油溶液进行超高效液相色谱-荧光检测，得到初榨橄榄油溶液色谱信息；
以所述初榨橄榄油对照指纹图谱为基准，对所述初榨橄榄油溶液色谱信息进行相似度计算，以达到评价初榨橄榄油品质的目的。
本发明将初榨橄榄油与溶剂混合，进行提取，得到初榨橄榄油溶液。
在本发明中，所述溶剂的种类、用量、混合及提取的方式优选与构建所述初榨橄榄油对照指纹图谱时配制系列特级初榨橄榄油样品时的参数一致，在此不再赘述。
得到初榨橄榄油溶液，本发明对所述初榨橄榄油溶液进行超高效液相色谱-荧光检测，得到初榨橄榄油溶液色谱信息。
在本发明中，所述超高效液相色谱-荧光检测的参数与构建所述初榨橄榄油对照指纹图谱时进行超高效液相色谱-荧光检测时的参数一致，在此不再赘述。
得到初榨橄榄油溶液色谱信息后，本发明以所述初榨橄榄油对照指纹图谱为基准，对所述初榨橄榄油溶液色谱信息进行相似度计算，以达到评价初榨橄榄油品质的目的。
在本发明中，所述相似度计算所用软件优选与构建所述初榨橄榄油对照指纹图谱时采用的相似度软件一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述应用优选还包括：
将香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸标准品用溶剂溶解，得到包含香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸的混合标准溶液；
对所述混合标准溶液进行超高效液相色谱-荧光检测，得到混合标准溶液色谱信息；
以所述混合标准溶液色谱信息为基准，对所述初榨橄榄油溶液的色谱信息进行归属。
在本发明中，所述香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸混合标准溶液中香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸的浓度均优选为50～5000mg/L，进一步优选为100mg/L。
在本发明中，所述超高效液相色谱-荧光检测的参数与构建所述初榨橄榄油对照指纹图谱时进行的超高效液相色谱-荧光检测时的参数一致，在此不再赘述。
采用本发明提供的初榨橄榄油对照指纹图谱可以全面、客观、准确地检测初榨橄榄油产品的品质，不仅可以有效的评价初榨橄榄油的整体质量，保证消费者的合法权益；还能对其活性成分进行定量检测，提供理论及数据支持。
下面结合实施例对本发明提供的初榨橄榄油对照指纹图谱及其构建方法与应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中进行超高效液相色谱-荧光检测的参数为：
色谱柱：SVEAC18；流动相：A为0.1％甲酸甲醇，B为0.1％甲酸水溶液；流速为0.3mL/min；激发波长300nm；发射波长350nm；柱温：30℃；进样量为0.1μL。梯度洗脱条件见表1，运行结束后，初始条件下平衡3～10min。
表1梯度洗脱条件
Figure BDA0002247499730000071
实施例1
1.1初榨橄榄油对照指纹图谱的建立
1.1.1、取17批次特级初榨橄榄油10.0g，精密称重，置50mL聚乙烯管中，精密加入甲醇20mL，涡旋提取1.0min，10000r/min离心后，取上清液1.5mL，用0.22μm有机相微孔滤膜过滤，得到17个特级初榨橄榄油样品。
1.1.2、对17个特级初榨橄榄油样品进行超高效液相色谱-荧光检测，得到17个特级初榨橄榄油样品色谱信息，图1为17个特级初榨橄榄油样品色谱信息中的9个特级初榨橄榄油样品色谱信息重叠图；
1.1.3、对17个特级初榨橄榄油样品色谱信息进行相似度计算，获得初榨橄榄油对照指纹图谱，设定17个特级初榨橄榄油样品色谱信息中峰面积大于5％的色谱峰作为指纹峰，最终选择了13个共有的指纹峰构建了初榨橄榄油对照指纹图谱；
精密称取香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸标准品各10.0mg，用甲醇溶解，定容于100mL容量瓶中，配置成香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸浓度均为100mg/L的混合标准溶液；对所述混合标准溶液进行超高效液相色谱-荧光检测，得到混合标准溶液色谱图。
图2为初榨橄榄油对照指纹图谱(a)和混合标准溶液色谱图(b)，从图2可以看出：初榨橄榄油对照指纹图谱中编号为2的峰为羟基酪醇；编号为3的峰为香草酸；编号为6的峰为水杨酸；编号为7的峰为香豆素。
表2为17个特级初榨橄榄油样品色谱信息的相似度数据。
表2 17个特级初榨橄榄油样品色谱信息的相似度数据
Figure BDA0002247499730000081
Figure BDA0002247499730000091
R：为指纹图谱软件生成的对照指纹图谱
1.2、初榨橄榄油对照指纹图谱的应用
对掺入不同浓度大豆油(5％～50％，v/v)的初榨橄榄油进行超高效液相色谱-荧光检测，得到掺入不同浓度大豆油(5％～50％，v/v)的初榨橄榄油的色谱信息；
以步骤1.1.3得到的初榨橄榄油对照指纹图谱为基准，采用相似度软件，对所述掺入不同浓度大豆油(5％～50％，v/v)的初榨橄榄油的色谱信息进行相似度计算，结果见表3。
表3掺入不同大豆油浓度(5～50％，v/v)的初榨橄榄油相似度数据
Figure BDA0002247499730000092
从表3可以看出：掺入不同浓度大豆油(5～50％，v/v)的初榨橄榄油的色谱信息与步骤1.1.3得到的榨橄榄油对照指纹图谱的相似度相差较大，这说明，此法可以为鉴定掺入不同浓度大豆油(5～50％，v/v)的初榨橄榄油数据参考。
对特级初榨橄榄油和大豆油进行超高效液相色谱-荧光检测，得到特级初榨橄榄油和大豆油的色谱图，结果如图3所示。从图3可以看出：大豆油和特级初榨橄榄油的色谱信息具有较大的区别。
1.3、精密度考察
量取特级初榨橄榄油10.0g，按照“1.1.1”进行样品处理，然后进行超高效液相色谱-荧光检测，连续进样6次，主要色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.90％～2.91％和2.44％～3.91％，数据表明，仪器的精密度可以满足实验要求。
1.4、重现性实验
量取特级初榨橄榄油10.0g，按照“1.1.1”进行样品处理，然后进行超高效液相色谱-荧光检测；主要色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.83％～2.02％和1.83％～3.13％，数据表明，本方法的重现性良好，可以满足实验要求。
1.5、稳定性实验
量取特级初榨橄榄油10.0g，按照“1.1.1”进行样品处理，得到特级初榨橄榄油样品；室温条件下，将特级初榨橄榄油样品在处理后的第0、4、8、16、24、48h进行超高效液相色谱-荧光检测，主要色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为2.14％～3.06％和1.91％～3.85％，表明特级初榨橄榄油样品在48h内稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种初榨橄榄油对照指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将10~30批次的特级初榨橄榄油与溶剂混合，进行提取，得到系列特级初榨橄榄油样品；
对所述系列特级初榨橄榄油样品进行超高效液相色谱-荧光检测，得到系列特级初榨橄榄油样品色谱信息；
对所述系列特级初榨橄榄油样品色谱信息进行相似度计算，并得到所述初榨橄榄油对照指纹图谱；
所述超高效液相色谱-荧光检测出的特级初榨橄榄油的特征峰为羟基酪醇、香草酸、水杨酸和香豆素；
所述溶剂为甲醇；
所述特级初榨橄榄油与溶剂的用量比为1.0~5.0g:5~20mL；
所述超高效液相色谱-荧光检测的条件包括：
色谱柱：RP-C18色谱柱或SVEA C18色谱柱；
流速：0.1~0.4 mL/min；
激发波长：300 nm；
发射波长：350 nm；
柱温：25~40℃；
进样量：0.1~3.0 μL；
流动相：A为体积浓度为0.1%的甲酸甲醇溶液；B为体积浓度为0.1%的甲酸水溶液；
梯度洗脱程序为：
0~3min：10%A，90%B；
3~45min：55%A，45%B；
所述相似度计算用软件为国家药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》A版。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述初榨橄榄油对照指纹图谱中指纹峰的峰面积大于5%。
3.一种权利要求1~2任一项所述的构建方法得到的初榨橄榄油对照指纹图谱在检测初榨橄榄油品质领域中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将初榨橄榄油与溶剂混合，进行提取，得到初榨橄榄油溶液；
对所述初榨橄榄油溶液进行超高效液相色谱-荧光检测，得到初榨橄榄油溶液色谱信息；
以所述初榨橄榄油对照指纹图谱为基准，对所述初榨橄榄油溶液色谱信息相似度计算，以达到评价初榨橄榄油品质的目的。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，还包括：
将香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸标准品用溶剂溶解，得到包含香豆素、羟基酪醇、香草酸和水杨酸的混合标准溶液；
对所述混合标准溶液进行超高效液相色谱-荧光检测，得到混合标准溶液色谱信息；
以所述混合标准溶液色谱信息为基准，对所述初榨橄榄油溶液色谱信息进行归属。
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