CN108459038B - 杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，具体涉及蜂胶鉴别技术领域，包括如下步骤：S1、将纯蜂胶样品溶解处理后送入核磁共振波谱仪进行检测，得到纯蜂胶的核磁指纹图谱；S2、重复S1步骤，得到纯杨树胶的核磁指纹图谱；S3、将新鲜杨树芽胶切碾成小颗粒，重复S1步骤，得到杨树芽胶的核磁指纹图谱；S4、将毛胶切碾成小颗粒，重复S1步骤，得到毛胶的核磁指纹图谱；S5、重复S1步骤，得到待验蜂胶的核磁指纹图谱；S6、将待验蜂胶的核磁指纹图谱与纯蜂胶、纯杨树胶、杨树芽胶和毛胶的核磁指纹图谱进行比较,判断真假。本发明具有仪器精密度高，操作简便，样品用量少，检测速度快，溶剂耗量小的优点。
Description
技术领域
本发明属于蜂胶鉴别技术领域，具体涉及一种杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法。
背景技术
蜂胶是蜂蜜采集特定植物分泌的树脂，再混合蜂蜡及腺体分泌物等物质，最终涂抹在蜂箱内壁形成的一种粘性物质。中国蜂胶是杨树型蜂胶，目前国内市场上最普遍的蜂胶掺假有通过提取色形味相似、化学成分基本相似但价格低廉、生理活性差的杨树芽胶来冒充蜂胶，或在蜂胶中加入杨树胶，人为添加黄酮以提高蜂胶产品的总黄酮含量。此外，由于蜂胶组成成分存在高度复杂性(>300种成分)，现报道的有关蜂胶掺假的鉴别方法的基本原理都是研究蜂胶和/或杨树胶中某些组成成分及其含量的差异，通过气相或液相色谱技术寻找可以区分两者的标志性物质。气相色谱主要针对蜂胶中的挥发性组分，检测不全面，因此我国蜂胶行业区分蜂胶与杨树芽胶胶的质量标准则主要依靠高效液相色谱法，但该方法尚存在分离度不够、只检测具有紫外吸收特性的成分、流动相溶剂消耗量大、仪器分析时间长等缺点，因而从环保经济的角度看并不具有优势。此外，色谱方法提供的某些特征标记物一旦被攻破，不良厂家便会以此对假蜂胶做文章，因而掺假检测难度也随之提高。核磁技术与色谱法相比具有仪器精密度高，操作方便，样品用量少，检测速度快等优点，因此可以考虑采用核磁技术进行鉴别检测。
专利一种利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法(申请号为200510060230.8)，公开了一种利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，该方法主要应用于蜂胶与杨树胶的鉴别，用真空干燥法测定蜂胶固形物含量，然后称取适量该蜂胶提取溶液，用流动相进行定容，混匀，用滤膜过滤，上液相色谱仪分析，采集0-20min的色谱图，得到该蜂胶的色谱图，再用同样的方法得到纯蜂胶和杨树胶的色谱图，将三者进行比较，判断蜂胶的真假。该发明方便快捷、效果好、耗费少、准确性高的优点。然而该发明采用液相色谱，仍存在分离度不够、只检测具有紫外吸收特性的成分、流动相溶剂消耗量大、仪器分析时间长等缺点。
因此，急需一种仪器精密度高，操作简便，样品用量少，检测速度快，重现性好，溶剂耗量小的杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法。
发明内容
为了解决现有蜂胶各种鉴别方法存在的分析时间长，溶剂耗量大等问题，本发明的目的是提供一种杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，具有仪器精密度高，操作简便，样品用量少，检测速度快，重现性好，溶剂耗量小的优点。
本发明提供了如下的技术方案：
杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，包括如下步骤：
S1、将纯蜂胶样品用无水乙醇超声溶解，收集上层提取液，并对残渣用无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，收集上层液体，用氮气吹干，称量一定量的吹干提取物，用含0.03％甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至核磁管送入核磁共振波谱仪进行检测，得到纯蜂胶样品的核磁指纹图谱；
S2、用纯杨树胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到纯杨树胶样品的核磁指纹图谱；
S3、将新鲜杨树芽胶切碾成小颗粒，用杨树芽胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到杨树芽胶样品的核磁指纹图谱；
S4、将毛胶切碾成小颗粒，用毛胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到毛胶样品的核磁指纹图谱；
S5、用待验蜂胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到待验蜂胶样品的核磁指纹图谱；
S6、将待验蜂胶样品的核磁指纹图谱与纯蜂胶样品、纯杨树胶样品、杨树芽胶样品和毛胶样品的核磁指纹图谱进行比较，纯蜂胶样品、毛胶样品和纯杨树胶样品在2.59ppm处的单峰特征不明显，杨树芽胶样品在2.59ppm处的单峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征不明显，由此，判断待验蜂胶样品的真假。
待验蜂胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征明显和在5.64-5.66ppm处的双峰特征明显，可证明是假蜂胶，进一步的，在2.59ppm处的单峰特征明显，可证明是掺入了杨树芽胶的假蜂胶，反之，在2.59ppm处的单峰特征不明显、在2.84-2.86ppm处的双峰特征不明显、在5.64-5.66ppm处的双峰特征不明显、在9.1-9.8ppm处的峰特征明显，则证明为真蜂胶。
优选的，所述S1-S5步骤中纯蜂胶样品、纯杨树胶样品、杨树芽胶样品、毛胶样品或待验蜂胶样品的取样质量为1-2g，无水乙醇加入量为10-15ml，超声时间15-20min，样品残渣加入无水乙醇量为10-15ml，合并上层提取液，离心转速9000rpm，离心时间10-15min，氮气吹干时间4-5h，吹干提取物的称取量为20-40mg。
优选的，所述S5步骤的具体步骤如下：将待验蜂胶样品用无水乙醇超声溶解，室温静置1-3天，收集上层提取液，并对残渣用无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，收集上层液体，用氮气吹干，称量一定量的吹干提取物，用含0.03％甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至核磁管送入核磁共振波谱仪进行检测，得到待验蜂胶样品的核磁指纹图谱。
优选的，所述S1-S5步骤使用的核磁共振波谱仪为400MHz核磁共振波谱仪，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s。
蜂胶核磁指纹图谱可以从分子层面给出其中所有组分的核磁共振信息，真假蜂胶因组成成分不同可以给出不同的图谱信息，本发明基于这一原理，分析大量蜂胶样品的核磁指纹图谱，旨在对蜂胶是否掺假实现快速判定，实验过程则利用无水乙醇充分提取试样中的黄酮类、芳香酸、醇和脂类等重要化合物，然后用400MHz核磁共振波谱仪测定分析此提取混合物，并使用直观比对的方法对核磁指纹图谱进行归纳，分析样品不同位置的1H NMR的化学位移异同，找出区分真假蜂胶的特征标记峰，从而对样品质量实现定性鉴别。
本发明的有益效果是：
1、仪器精密度高，操作简便。
2、实验条件可灵活优化，仪器程序参数可设计强。
3、样品用量少，预处理工序简便高效，仅需无水乙醇提取并结合适当的涡旋或超声-离心-氮吹操作，因而属于无损检测。
4、核磁分析所需样品少。
5、检测速度很快，谱图信号的强弱可以直接反映样品中组分的相对含量。
6、实验结果信息很全面，重现性好，对建立真假蜂胶样品的质子指纹图谱非常有利，而图谱结构更为复杂，对掺假不利。
7、检测单个样品仅需600μl氘代溶剂，耗量极小，对环境污染小。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1各原料样品在2.53-2.90ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图2是实施例1各原料样品在5.54-5.84ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图3是实施例1各原料样品在8.8-10.0ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图4是实施例2各原料样品在2.53-2.90ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图5是实施例2各原料样品在5.54-5.84ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图6是实施例2各原料样品在8.8-10.0ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图7是实施例3各原料样品在2.53-2.90ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图8是实施例3各原料样品在5.54-5.84ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图9是实施例3各原料样品在8.8-10.0ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图10是实施例4各原料样品在2.53-2.90ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图11是实施例4各原料样品在5.54-5.84ppm范围内的核磁指纹叠加图；
图12是实施例4各原料样品在8.8-10.0ppm范围内的核磁指纹叠加图；
具体实施方式
实施例1
杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，包括如下步骤：
S1、将1g纯蜂胶样品放入50ml离心管，加入10ml无水乙醇，超声15min溶解，收集上层提取液，并对残渣用10ml无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，转速为9000rpm，离心10min，收集上层液体，用氮气吹干，氮气吹扫4h，称量20mg吹干提取物，用600μl含0.03％四甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至5mm核磁管送入400MHz核磁共振波谱仪进行检测，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s，得到纯蜂胶样品的核磁指纹图谱；
S2、用纯杨树胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到纯杨树胶样品的核磁指纹图谱；
S3、将新鲜杨树芽胶切碾成小颗粒，用杨树芽胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到杨树芽胶样品的核磁指纹图谱；
S4、将毛胶切碾成小颗粒，用毛胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到毛胶样品的核磁指纹图谱；
S5、将1g待验蜂胶样品放入50ml离心管，加入10ml无水乙醇，超声15min溶解，静置1天，收集上层提取液，并对残渣用10ml无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，转速为9000rpm，离心10min，收集上层液体，用氮气吹干，氮气吹扫4h，称量20mg吹干提取物，用600μl含0.03％四甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至5mm核磁管送入400MHz核磁共振波谱仪进行检测，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s，得到待验蜂胶样品的核磁指纹图谱；
S6、1是纯蜂胶样品核磁指纹图谱，2是毛胶样品核磁指纹图谱，3是纯杨树胶样品核磁指纹图谱，4是杨树芽胶样品核磁指纹图谱，5是待验蜂胶样品核磁指纹图谱，将待验蜂胶样品的核磁指纹图谱与纯蜂胶样品、纯杨树胶样品、杨树芽胶样品和毛胶样品的核磁指纹图谱进行比较，由图1看出，纯蜂胶样品、毛胶样品和纯杨树胶样品在2.59ppm处的单峰特征不明显，杨树芽胶样品在2.59ppm处的单峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征明显，由图2看出，纯蜂胶样品和毛胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征明显，由图3看出，纯蜂胶样品和毛胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征不明显，待验蜂胶样品在2.59ppm处的单峰特征不明显，在2.84-2.86ppm处的双峰特征不明显，在5.64-5.66ppm处的双峰特征不明显，在9.1-9.8ppm处的峰特征明显，待验蜂胶样品为真蜂胶。
实施例2
杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，包括如下步骤：
S1、将2g纯蜂胶样品放入50ml离心管，加入15ml无水乙醇，超声20min溶解，收集上层提取液，并对残渣用15ml无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，转速为9000rpm，离心15min，收集上层液体，用氮气吹干，氮气吹扫5h，称量40mg吹干提取物，用600μl含0.03％四甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至5mm核磁管送入400MHz核磁共振波谱仪进行检测，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s，得到纯蜂胶样品核磁指纹图谱；
S2、用纯杨树胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到纯杨树胶样品的核磁指纹图谱；
S3、将新鲜杨树芽胶切碾成小颗粒，用杨树芽胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到杨树芽胶样品的核磁指纹图谱；
S4、将毛胶切碾成小颗粒，用毛胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到毛胶样品的核磁指纹图谱；
S5、将2g待验蜂胶样品放入50ml离心管，加入15ml无水乙醇，超声20min溶解，静置3天，收集上层提取液，并对残渣用15ml无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，转速为9000rpm，离心15min，收集上层液体，用氮气吹干，氮气吹扫5h，称量40mg吹干提取物，用600μl含0.03％四甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至5mm核磁管送入400MHz核磁共振波谱仪进行检测，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s，得到待验蜂胶样品的核磁指纹图谱；
S6、6是纯蜂胶样品核磁指纹图谱，7是毛胶样品核磁指纹图谱，8是纯杨树胶样品核磁指纹图谱，9是杨树芽胶样品核磁指纹图谱，10是待验蜂胶样品核磁指纹图谱，将待验蜂胶样品的核磁指纹图谱与纯蜂胶样品、纯杨树胶样品、杨树芽胶样品和毛胶样品的核磁指纹图谱进行比较，由图4看出，纯蜂胶样品、毛胶样品和纯杨树胶样品在2.59ppm处的单峰特征不明显，杨树芽胶样品在2.59ppm处的单峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征明显，由图5看出，纯蜂胶样品和毛胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征明显，由图6看出，纯蜂胶样品和毛胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征不明显，待验蜂胶样品在2.59ppm处的单峰特征不明显，在2.84-2.86ppm处的双峰特征不明显，在5.64-5.66ppm处的双峰特征不明显，在9.1-9.8ppm处的峰特征明显，待验蜂胶样品为真蜂胶。
实施例3
杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，包括如下步骤：
S1、将1.5g纯蜂胶样品放入50ml离心管，加入13ml无水乙醇，超声18min溶解，收集上层提取液，并对残渣用12ml无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，转速为9000rpm，离心12min，收集上层液体，用氮气吹干，氮气吹扫4.5h，称量30mg吹干提取物，用600μl含0.03％四甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至5mm核磁管送入400MHz核磁共振波谱仪进行检测，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s，得到纯蜂胶样品核磁指纹图谱；
S2、用纯杨树胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到纯杨树胶样品的核磁指纹图谱；
S3、将新鲜杨树芽胶切碾成小颗粒，用杨树芽胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到杨树芽胶样品的核磁指纹图谱；
S4、将毛胶切碾成小颗粒，用毛胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到毛胶样品的核磁指纹图谱；
S5、将1.5g待验蜂胶样品放入50ml离心管，加入13ml无水乙醇，超声18min溶解，静置2天，收集上层提取液，并对残渣用12ml无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，转速为9000rpm，离心12min，收集上层液体，用氮气吹干，氮气吹扫4.5h，称量30mg吹干提取物，用600μl含0.03％四甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至5mm核磁管送入400MHz核磁共振波谱仪进行检测，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s，得到待验蜂胶样品的核磁指纹图谱；
S6、11是纯蜂胶样品核磁指纹图谱，12是毛胶样品核磁指纹图谱，13是纯杨树胶样品核磁指纹图谱，14是杨树芽胶样品核磁指纹图谱，15是待验蜂胶样品核磁指纹图谱，将待验蜂胶样品的核磁指纹图谱与纯蜂胶样品、纯杨树胶样品、杨树芽胶样品和毛胶样品的核磁指纹图谱进行比较，由图7看出，纯蜂胶样品、毛胶样品和纯杨树胶样品在2.59ppm处的单峰特征不明显，杨树芽胶样品在2.59ppm处的单峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征明显，由图8看出，纯蜂胶样品和毛胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征明显，由图9看出，纯蜂胶样品和毛胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征不明显，待验蜂胶样品在2.59ppm处的单峰特征明显，在2.84-2.86ppm处的双峰特征明显，在5.64-5.66ppm处的双峰特征明显，在9.1-9.8ppm处的峰特征不明显，待验蜂胶样品为假蜂胶，且待验蜂胶样品中掺了杨树芽胶。
实施例4
杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，包括如下步骤：
S1、将1g纯蜂胶样品放入50ml离心管，加入12ml无水乙醇，超声15min溶解，收集上层提取液，并对残渣用15ml无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，转速为9000rpm，离心10min，收集上层液体，用氮气吹干，氮气吹扫4h，称量30mg吹干提取物，用600μl含0.03％四甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至5mm核磁管送入400MHz核磁共振波谱仪进行检测，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s，得到纯蜂胶样品核磁指纹图谱；
S2、用纯杨树胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到纯杨树胶样品的核磁指纹图谱；
S3、将新鲜杨树芽胶切碾成小颗粒，用杨树芽胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到杨树芽胶样品的核磁指纹图谱；
S4、将毛胶切碾成小颗粒，用毛胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到毛胶样品的核磁指纹图谱；
S5、将1g待验蜂胶样品放入50ml离心管，加入12ml无水乙醇，超声15min溶解，静置2天，收集上层提取液，并对残渣用15ml无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，转速为9000rpm，离心10min，收集上层液体，用氮气吹干，氮气吹扫4h，称量30mg吹干提取物，用600μl含0.03％四甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至5mm核磁管送入400MHz核磁共振波谱仪进行检测，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s，得到待验蜂胶样品核磁指纹图谱；
S6、16是纯蜂胶样品核磁指纹图谱，17是毛胶样品核磁指纹图谱，18是纯杨树胶样品核磁指纹图谱，19是杨树芽胶样品核磁指纹图谱，20是待验蜂胶样品核磁指纹图谱，将待验蜂胶样品的核磁指纹图谱与纯蜂胶样品、纯杨树胶样品、杨树芽胶样品和毛胶样品的核磁指纹图谱进行比较，由图10看出，纯蜂胶样品、毛胶样品和纯杨树胶样品在2.59ppm处的单峰特征不明显，杨树芽胶样品在2.59ppm处的单峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征明显，由图11看出，纯蜂胶样品和毛胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征明显，由图12看出，纯蜂胶样品和毛胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征不明显，待验蜂胶样品在2.59ppm处的单峰特征明显，在2.84-2.86ppm处的双峰特征明显，在5.64-5.66ppm处的双峰特征明显，在9.1-9.8ppm处的峰特征不明显，待验蜂胶样品为假蜂胶，且待验蜂胶样品中掺了杨树芽胶。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将纯蜂胶样品用无水乙醇超声溶解，收集上层提取液，并对残渣用无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，收集上层液体，用氮气吹干，称量一定量的吹干提取物，用含0.03％甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至核磁管送入核磁共振波谱仪进行检测，得到纯蜂胶样品的核磁指纹图谱；
S2、用纯杨树胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到纯杨树胶样品的核磁指纹图谱；
S3、将新鲜杨树芽胶切碾成小颗粒，用杨树芽胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到杨树芽胶样品的核磁指纹图谱；
S4、将毛胶切碾成小颗粒，用毛胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到毛胶样品的核磁指纹图谱；
S5、用待验蜂胶样品代替纯蜂胶样品，重复S1步骤，得到待验蜂胶样品的核磁指纹图谱；
S6、将待验蜂胶样品的核磁指纹图谱与纯蜂胶样品、纯杨树胶样品、杨树芽胶样品和毛胶样品的核磁指纹图谱进行比较，纯蜂胶样品、毛胶样品和纯杨树胶样品在2.59ppm处的单峰特征不明显，杨树芽胶样品在2.59ppm处的单峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在2.84-2.86ppm处的双峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征不明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在5.64-5.66ppm处的双峰特征明显，纯蜂胶样品和毛胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征明显，纯杨树胶样品和杨树芽胶样品在9.1-9.8ppm处的峰特征不明显，由此，判断待验蜂胶样品的真假。
2.根据权利要求1所述的杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，其特征在于，所述S1-S5步骤中纯蜂胶样品、纯杨树胶样品、杨树芽胶样品、毛胶样品或待验蜂胶样品的取样质量为1-2g，无水乙醇加入量为10-15ml，超声时间15-20min，样品残渣加入无水乙醇量为10-15ml，合并上层提取液，离心转速9000rpm，离心时间10-15min，氮气吹干时间4-5h，吹干提取物的称取量为20-40mg。
3.根据权利要求1所述的杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，其特征在于，所述S5步骤的具体步骤如下：将待验蜂胶样品用无水乙醇超声溶解，室温静置1-3天，收集上层提取液，并对残渣用无水乙醇再次提取，合并上层提取液后进行离心，收集上层液体，用氮气吹干，称量一定量的吹干提取物，用含0.03％甲基硅烷的氘代二甲基亚砜溶剂溶解，溶解后移至核磁管送入核磁共振波谱仪进行检测，得到待验蜂胶样品的核磁指纹图谱。
4.根据权利要求1所述的杨树型蜂胶真伪快速鉴别的核磁指纹图谱法，其特征在于，所述S1-S5步骤使用的核磁共振波谱仪为400MHz核磁共振波谱仪，设定温度294K，主要参数：D1＝2；DS＝2；RG＝32；NS＝64；TD＝64K；SWH＝8012.820Hz；AQ＝4.0894s，检测时间6mim44s。
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