CN118090933A - 羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，包括：制备参照物溶液，所述参照物溶液包括对照药材溶液和对照品溶液，所述对照品溶液包括阿魏酸对照品溶液、羌活醇和异欧前胡素混合对照品溶液、紫花前胡苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液；取羌活药材或羌活标准汤剂制得供试品溶液；取预设量的参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，建立特征图谱。本发明可为羌活药材、羌活标准汤剂质量控制提供数据基础，有效保证产品质量的稳定性和可控性。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量分析检测技术领域，尤其涉及一种羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法。
背景技术
在市场上，羌活不同的商品规格有蚕羌、竹节羌、条羌、大头羌，其中条羌、大头羌被归类于宽叶羌活，而在临床中常使用蚕羌和竹节羌，因蚕羌和竹节羌的质量较佳，临床使用效果较好。中国药典2020年版羌活的鉴别、含量测定及特征图谱项下并未对不同基原的样品进行区分，而现有的专利研究中关于不同基原羌活的研究内容则更少，仅有部分研究内容涉及到其质量控制方法的研究；而在文献研究中，有部分文献涉及到不同基原羌活样品的研究，但其特征峰的分离度较差，且指认特征峰的数目较少，并未将药典中规定的4个特征峰纳入研究中，并且特征图谱信息也缺少药典项下羌活薄层鉴别项下的紫花前胡苷的参照物，所建立的特征图谱信息不够全面，并且在现有的研究中并未涉及到其标准汤剂的研究，在标准汤剂方面研究的内容，还处于技术空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，该方法重现性良好，准确可靠，可为羌活药材或羌活标准汤剂大生产质量控制提供数据基础，保证产品质量的稳定性和可控性。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
制备参照物溶液，所述参照物溶液包括对照药材溶液和对照品溶液，所述对照品溶液包括阿魏酸对照品溶液、羌活醇和异欧前胡素混合对照品溶液、紫花前胡苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液；
取羌活药材或羌活标准汤剂制得供试品溶液；
取预设量的参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，建立特征图谱。
在一种实施方式中，所述梯度洗脱按下述程序进行：
0～9min，流动相A为25％→28.5％，流动相B为75％→71.5％；
9～25min，流动相A从28.5％→33.5％，流动相B从71.5％→66.5％；
25～30min，流动相A从33.5％→70％，流动相B从66.5％→30％；
30～31min，流动相A从70％→75％，流动相B从30％→25％；
31～45min，流动相A从75％→78％，流动相B从25％→22％。
在一种实施方式中，所述磷酸溶液的体积浓度为0.1～0.25％。
所述参照物溶液和供试品溶液的预设量为1μL～3μL；
所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm，柱温为29℃～31℃；
所述进行梯度洗脱时，流动相的流速为0.24～0.26mL/min；
所述液相色谱仪的紫外检测波长为245nm～247nm。
优选地，所述磷酸溶液的体积浓度为0.2％。
所述参照物溶液和供试品溶液的预设量为2μL；
所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm，柱温为30℃；
所述进行梯度洗脱时，流动相的流速为0.25mL/min；
所述液相色谱仪的紫外检测波长为246nm。
需要说明的是，本发明分别不同色谱柱、不同柱温、不同流速对特征图谱的影响，以确定上述条件为优选的测试条件。进一步地，本发明提供的特征图谱构建方法经专属性、精密度、重复性和稳定性验证，均符合规定，经中间精密度考察，相对保留时间及相对峰面积均较稳定。峰4、峰5分离度受柱温影响较大，建议固定柱温30℃。
在一种实施方式中，采用下述方法完成所述取羌活药材制得供试品溶液：
取羌活药材，研磨后过45目～55目筛网，然后称取0.4g～0.6g与70％的甲醇混合，所述甲醇的加入量为20mL～30mL，加热回流处理25min～35min后，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
需要说明的是，本发明通过单因素分析，分别考察提取溶剂、提取溶剂用量、提取方式及提取时间对羌活特征图谱的影响，以确定上述条件为优选的羌活药材供试品溶液的前处理方法。
在一种实施方式中，采用下述方法完成所述取羌活标准汤剂制得供试品溶液：
取羌活标准汤剂，研磨后称取0.05g～0.15g与70％的甲醇混合，所述甲醇的加入量为20mL～30mL，超声处理25min～35min后，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
所述超声处理的功率为200W～300W，频率为35kHz～45kHz。
需要说明的是，本发明分别考察提取溶剂、提取溶剂用量、提取时间及提取方式对特征图谱的影响，以确定上述条件为优选的羌活标准汤剂供试品溶液的前处理方法。
在一种实施方式中，所述阿魏酸对照品溶液采用下述方法制得：
精密称取阿魏酸2.215mg，置25ml量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含87.714μg的溶液，摇匀，即得；
和/或，所述羌活醇和异欧前胡素混合对照品溶液采用下述方法制得：
精密称取羌活醇2.888mg、异欧前胡素2.339mg置25ml量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含羌活醇115.405μg和异欧前胡素92.999μg混合对照品溶液，摇匀，即得；
和/或，所述紫花前胡苷对照品溶液采用下述方法制得：
精密称取紫花前胡苷2.252mg置20ml量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含112.150μg的紫花前胡苷对照品溶液；
和/或，所述绿原酸对照品溶液采用下述方法制得：
精密吸取绿原酸对照品2.214mg置50ml量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含绿原酸42.863mg的对照品溶液；
和/或，所述对照药材溶液采用下述方法制得：
取羌活对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得。
在一种实施方式中，所述特征图谱包括羌活药材的特征图谱、羌活标准汤剂的特征图谱，所述特征图谱包括9个共有峰；其中与阿魏酸对应的为3号峰，与羌活醇对应的为7号峰。
在一种实施方式中，所述羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱中，以3号峰为参照峰S1，1号峰、2号峰与S1峰的相对保留时间符合：1号峰0.306～0.374，2号峰0.648～0.792；
以7号峰为参照峰S2，4号峰、5号峰、6号峰、8号峰、9号峰与S2峰的相对保留时间符合：4号峰0.621～0.759，5号峰0.648～0.792，6号峰0.873～1.067，8号峰0.936～1.144，9号峰0.954～1.166。
相应地，本发明提供了一种羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱，所述羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱采用上述的羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法获得。
相应地，所述羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱在(1)、(2)或(3)中的应用：
(1)羌活药材或羌活标准汤剂的真伪鉴别和成分检测；
(2)羌活药材和宽叶羌活药材的区分；
(3)羌活标准汤剂和宽叶羌活标准汤剂的区分。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明通过所述特征图谱的构建方法方法，首次建立了羌活药材、羌活标准汤剂的特征图谱，该特征图谱可充分展示羌活药材或羌活标准汤剂的化学成分特征，特征峰信息量丰富，可全面地反映羌活药材或羌活标准汤剂的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制羌活药材或羌活标准汤剂质量的目的。并且能够实现对羌活药材和宽叶羌活药材、及羌活标准汤剂和宽叶羌活标准汤剂的鉴别区分，保证特征图谱在药材和标准汤剂中能够得到一致性的传递，确保临床使用中药材的基原的准确性。
附图说明
图1是本发明羌活药材特征图谱提取溶剂考察色谱图；
图2是本发明羌活药材特征图谱提取溶剂用量考察色谱图；
图3是本发明羌活药材特征图谱提取方式考察色谱图；
图4是本发明羌活药材特征图谱提取时间考察图；
图5是本发明羌活对照药材特征图谱，其中峰1：绿原酸，峰3(S1)：阿魏酸，峰4：紫花前胡苷，峰6：阿魏酸苯乙醇酯，峰7(S2)：羌活醇，峰8：异欧前胡素，峰9：镰叶芹二醇；
图6是本发明15批羌活药材特征图谱，其中，峰1：绿原酸；峰3(S1)：阿魏酸；峰4：紫花前胡苷；峰6：阿魏酸苯乙醇酯；峰7(S2)：羌活醇；峰8：异欧前胡素；峰9：镰叶芹二醇；
图7是本发明羌活药材与宽叶羌活药材特征图谱对比图；
图8是本发明羌活药材与宽叶羌活药材特征图谱对比图的峰7、峰8放大图；
图9是本发明羌活药材与宽叶羌活药材的对照药材特征图谱对比图；
图10是本发明羌活标准汤剂特征图谱提取溶剂考察色谱图；
图11是本发明羌活标准汤剂特征图谱提取方式考察色谱图；
图12是本发明羌活标准汤剂特征图谱提取时间考察色谱图；
图13是本发明羌活标准汤剂特征图谱提取溶剂用量考察色谱图；
图14是本发明羌活标准汤剂特征图谱专属性考察；
图15是本发明羌活标准汤剂特征图中间精密度图谱；
图16是本发明羌活标准汤剂特征图谱不同色谱柱考察色谱图；
图17是本发明羌活标准汤剂特征图谱不同柱温考察色谱图；
图18是本发明羌活标准汤剂特征图谱不同流速考察色谱图；
图19是本发明羌活标准汤剂特征图谱的叠加图；
图20是本发明羌活标准汤剂对照特征图谱，其中，峰1：绿原酸；峰3(S1)：阿魏酸；峰4：紫花前胡苷；峰6：阿魏酸苯乙醇酯；峰7(S2)：羌活醇；峰8：异欧前胡素；峰9：镰叶芹二醇；
图21是本发明羌活标准汤剂对照品特征图谱；
图22是本发明羌活标准汤剂与宽叶羌活标准汤剂特征图谱对比图；
图23是本发明羌活标准汤剂与宽叶羌活标准汤剂特征图谱对比图的峰7、峰8放大图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
为了全面地反映羌活药材或羌活标准汤剂的质量信息，实现全面、有效地控制羌活药材或羌活标准汤剂的质量，本发明提供了一种羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，以下对其进行详细说明：
1、仪器、试剂与试药
仪器：Thermo超高效液相色谱仪(Vanquish，赛默飞公司)，Waters超高效液相色谱仪(H-Class，沃特世公司)，Agilent SB C18(2.1mm×150mm，1.8μm；内部编号：BH-101、BH-169、BH-142)，百分之一电子分析天平(JJ600，常熟市双杰测试仪器厂)，万分之一电子分析天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)，百万分之一电子分析天平(XP26，梅特勒-托利多公司)，数控超声清洗器(KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司)，电热恒温水浴锅(HWS-28，上海一恒科技有限公司)，超纯水系统(Milli-Q Direct，默克股份有限公司)。
试剂：乙醇(西陇科技股份有限公司)、甲醇(西陇科技股份有限公司)分析纯；液相用磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、甲醇(默克股份有限公司)为HPLC色谱级，水为超纯水(实验室自制)。
试药：绿原酸对照品(批号：110753-201817，含量：96.8％，中国食品药品检定研究院)；阿魏酸对照品(批号：110773-201614，含量：99.0％，中国食品药品检定研究院)；紫花前胡苷对照品(批号：111821-201604，含量：99.0％，中国食品药品检定研究院)；羌活醇对照品(批号：110827-201611，含量：99.9％，中国食品药品检定研究院)；异欧前胡素对照品(批号：110820-201705，含量：99.4％，中国食品药品检定研究院)；羌活对照药材(批号：120935-201408，中国食品药品检定研究院)。羌活及宽叶羌活药材信息详见表1。
表1羌活及宽叶羌活药材信息表
2色谱条件
采用Agilent SB C18色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml；柱温为30℃；检测波长为246nm；进样量为2μl。
表2洗脱梯度表
3参照物溶液的制备
精密称取阿魏酸对照品2.215mg，置25ml量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含87.714μg的溶液，摇匀，即得；
精密称取羌活醇对照品2.888mg、异欧前胡素2.339mg置25ml量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含羌活醇115.405μg、异欧前胡素92.999μg混合对照品溶液，摇匀，即得；
精密称取紫花前胡苷对照品2.252mg置20ml量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含112.150μg的紫花前胡苷对照品溶液。
精密吸取绿原酸对照品2.214mg置50ml量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含绿原酸42.863mg的对照品溶液。
取羌活对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。
4不同基原羌活药材研究内容
4.1供试品溶液的制备
通过单因素分析，分别考察提取溶剂、提取溶剂用量、提取方式及提取时间对羌活特征图谱的影响，以确定最佳样品前处理方法。
(1)提取溶剂考察
本次实验考察了不同提取溶剂对羌活药材特征图谱的影响，选取甲醇、50％甲醇、70％甲醇、乙醇、50％乙醇、70％乙醇作为提取溶剂，通过观察与标准汤剂特征峰保留时间相一致的9个特征峰的峰型和分离度，并计算9个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同提取溶剂对羌活药材特征图谱的影响，选择最佳提取溶剂。
取批号为G1803064的羌活药材研磨成粉末并过50目筛网，取粉末0.5g，平行6组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、50％甲醇、70％甲醇、乙醇、50％乙醇、70％乙醇25ml，称定重量，加热回流处理30min后，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”，结果见表3、图1。
表3羌活药材特征图谱提取溶剂考察结果表
结果显示，通过对比6种不同提取溶剂的特征图谱可发现，70％甲醇、70％乙醇作为提取溶剂时“总峰面积/称样量”为最大，提取效率优于其他四种溶剂，但70％乙醇的峰形较差，70％甲醇峰型较好，故选取70％甲醇作为羌活药材特征图谱的提取溶剂。
(2)提取溶剂用量考察
本次实验考察了不同提取溶剂用量对羌活药材特征图谱的影响，通过计算与标准汤剂特征峰保留时间相一致的9个特征峰的“总峰面积/称样量×溶剂用量”来比较不同提取溶剂用量对羌活药材特征图谱的影响。
取批号为G1803064的羌活药材研磨成粉末并过50目筛网，取粉末0.5g，平行3组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇15ml、25ml、50ml，称定重量，分别加热回流处理30min后，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量×溶剂用量”，结果见表4，图2。
表4羌活药材特征图谱提取溶剂用量考察结果表
结果显示，以“总峰面积/称样量×溶剂用量”为指标，不同的提取溶剂用量对羌活药材特征图谱影响并不大，为保证整体色谱峰的响应值，选择提取溶剂用量为25ml。
(3)提取方式考察
本次实验考察了不同提取方式对羌活药材特征图谱的影响，选取超声处理、加热回流作为提取方式，观察与标准汤剂特征峰保留时间相一致的9个特征峰的峰型和分离度，并计算9个色谱峰“总峰面积/称样量”来比较不同提取方式对羌活药材特征图谱的影响。
取批号为G1803064的羌活药材研磨成粉末并过50目筛网，取粉末0.5g，平行2组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，分别超声处理30分钟，超声功率为250W，超声频率为40kHz、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”，结果见表5，图3。
表5羌活药材特征图谱提取方式考察结果表
结果显示，以“总峰面积/称样量”为指标，加热回流时“总峰面积/称样量”值高于超声处理，因此选择加热回流提取作为羌活药材特征图谱的提取方式。
(4)提取时间考察
本次实验考察了不同提取时间对羌活药材特征图谱的影响，通过计算与标准汤剂特征峰保留时间相一致的9个特征峰的“峰面积/称样量”来比较不同的回流时间对羌活药材特征图谱的影响。
取批号为G1803064的羌活药材研磨成粉末并过50目筛网，取粉末0.5g，平行3组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，分别加热回流15分钟、30分钟、60分钟，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”，结果见表6，图4。
表6羌活药材特征图谱提取时间考察结果表
结果显示，以“总峰面积/称样量”为指标，不同的提取时间对羌活药材特征图谱影响并不大，为保证提取完全，选择加热回流提取30分钟。
小结：
根据上述实验结果，羌活药材特征图谱样品前处理方法可确定为：取羌活药材，研磨成粉末，过50目筛网后称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.2羌活药材特征峰的确定及特征图谱测定结果
取羌活对照药材(批号：120935-201408)、15批羌活药材，按上述色谱条件与上述确定的羌活药材供试品制备方法，进样测定，得到羌活对照药材特征图谱如图5，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对15批羌活药材进行共有峰标识，选择9个共有峰作为羌活药材特征图谱的特征峰，如图6所示，并与对照药材参照物色谱中的9个特征峰保留时间相对应。
对15批羌活药材特征图谱进行分析，得到的所述羌活药材特征图谱包括9个共有峰；其中与阿魏酸对应的为3号峰，与羌活醇对应的为7号峰。以阿魏酸峰为参照峰S1，计算峰1、峰2相对保留时间及相对峰面积，以羌活醇峰为参照峰S2，计算峰4、峰5、峰6、峰8、峰9相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。
在一种实施方式中，所述羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱中，以3号峰为参照峰S1，1号峰、2号峰与S1峰的相对保留时间符合：1号峰0.306～0.374，2号峰0.648～0.792；
以7号峰为参照峰S2，4号峰、5号峰、6号峰、8号峰、9号峰与S2峰的相对保留时间符合：4号峰0.621～0.759，5号峰0.648～0.792，6号峰0.873～1.067，8号峰0.936～1.144，9号峰0.954～1.166。
相应地，具体实验结果见表7、表8
表7 15批羌活药材特征图谱的相对保留时间
表8 15批羌活药材特征图谱的相对峰面积
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4.3不同基原羌活药材特征图谱比较
取3批羌活药材、2批宽叶羌活药材，按上述色谱条件与上述确定的供试品制备方法，进样测定，得到羌活与宽叶羌活特征图谱，见图7，局部放大图见图8。并将羌活对照药材、宽叶羌活对照药材按上述色谱条件与上述确定的供试品制备方法，进样测定，其特征图谱见图9。
结果显示：通过羌活药材与宽叶羌活药材特征图谱的比较发现，在宽叶羌活药材特征图谱中，峰5、峰6之间出现峰型明显高于峰6的峰10、峰11。而羌活药材峰5、峰6之间没有出现峰面积比峰6大的峰10、峰11，该区别也能在羌活对照药材与宽叶羌活对照药材中体现，说明所建立的所述羌活特征图谱可用于区别宽叶羌活药材和羌活药材。
5不同基原羌活标准汤剂研究内容
5.1标准汤剂的制备
取羌活饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入9倍量水中，武火(500W)煮沸后文火(200W)保持微沸20分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加7倍量水，武火(500W)煮沸后文火(200W)保持微沸15分钟，煎液用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至5000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.10MPa)至200ml；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为2ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧上铝盖，即得。
5.2标准汤剂供试品溶液前处理方法考察
对羌活标准汤剂特征图谱的样品前处理进行考察，重点考察提取溶剂、提取溶剂用量、提取时间及提取方式对特征图谱的影响。
(1)提取溶剂考察
本次实验考察了不同提取溶剂对羌活标准汤剂特征图谱的影响，选取甲醇、70％甲醇、50％甲醇、乙醇、70％乙醇、50％乙醇作为提取溶剂，通过观察暂定的9个特征峰的峰型和分离效果，并计算9个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同提取溶剂对羌活标准汤剂特征图谱的影响。
取羌活标准汤剂(GT1803064)适量，研细，取约0.1g，平行6组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、乙醇、70％乙醇、50％乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，超声功率为250W，超声频率为40kHz，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照上述确定的色谱条件，进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”，结果见表10，图10。
表10羌活标准汤剂特征图谱提取溶剂考察结果表
结果显示，当提取溶剂为70％甲醇时“总峰面积/称样量”为最大，并且70％甲醇作为提取溶剂各色谱峰的峰形较好。综上所述，采用70％甲醇为提取溶剂可充分表现羌活标准汤剂特征图谱，因此采用70％甲醇作为羌活标准汤剂特征图谱提取溶剂。
(2)提取方式考察
本次实验考察了不同提取方式对羌活标准汤剂特征图谱的影响，通过观察暂定的9个特征峰的峰型和分离效果，并计算9个特征峰的“总峰面积/称样量”，比较不同提取方式对羌活标准汤剂特征图谱的影响。
取羌活标准汤剂(GT1803064)适量，研细，取约0.1g，平行2组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，超声功率为250W，超声频率为40kHz；或者加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照上述确定的色谱条件，进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”，结果见表11，图11。
表11羌活标准汤剂特征图谱提取方式考察结果表
结果显示，采用不同的提取方式，各特征峰的峰型、分离效果、“总峰面积/称样量”都无明显区别，考虑到操作简便，选择超声提取。
(3)提取时间考察
本次实验考察了不同提取时间对羌活标准汤剂特征图谱的影响，通过计算暂定的9个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同提取时间对羌活标准汤剂特征图谱的影响，选择最佳提取时间。
取羌活标准汤剂(GT1803064)适量，研细，取约0.1g，平行3组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)15分钟、30分钟、60分钟，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照上述确定的色谱条件，进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”，结果见表12，图12。
表12羌活标准汤剂特征图谱提取时间考察结果表
结果显示，不同的超声时间，9个特征峰的“总峰面积/称样量”无明显差别，说明超声15分钟已能完全提取，考虑到实验环境的影响，为保证方法的耐用性，选择超声提取时间为30分钟。
(4)提取溶剂用量考察
本次实验考察了不同提取溶剂用量对羌活标准汤剂特征图谱的影响，通过计算暂定的9个特征峰的“总峰面积/称样量×溶剂用量”来比较不同提取溶剂用量对羌活标准汤剂特征图谱的影响，选择最佳提取溶剂用量。
取羌活标准汤剂(GT1803064)适量，研细，取约0.1g，平行3组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇15ml、25ml、50ml，称定重量，超声处理30分钟，超声功率为250W，超声频率为40kHz，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照上述确定的色谱条件，进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量×溶剂用量”，结果见表13，图13。
表13羌活标准汤剂特征图谱提取溶剂用量考察结果表
结果显示，随着提取溶剂用量的增加，提取效率略有增加，且25ml已经提取完全，为保证方法的耐用性，选择溶剂用量为25ml。
小结：
根据上述实验结果，羌活标准汤剂特征图谱样品前处理方法可确定为：
取羌活标准汤剂适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，超声功率为250W，超声频率为40kHz，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.3标准汤剂特征图谱方法学考察
(1)专属性考察
精密吸取羌活标准汤剂(GT1803064)“5.3”项下供试品溶液、参照物溶液与空白溶剂各2μl，注入液相色谱仪，按“2”项下色谱条件测定。结果见图14。
结果显示，供试品色谱在与对照品色谱相应的保留时间处有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，说明该方法专属性良好。
(2)精密度考察
取羌活标准汤剂(GT1803064)适量，研细，取约0.1g，精密称定，按照“5.3”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2”项下确定的色谱条件重复进样6次。以阿魏酸峰为参照峰S1，计算峰1、峰2的相对保留时间及相对峰面积，以羌活醇峰参照峰S2，计算峰4、峰5、峰6、峰8、峰9的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值，实验结果见表14、表15。
表14羌活标准汤剂特征图谱精密度考察结果表(相对保留时间)
表15羌活标准汤剂特征图谱精密度考察结果表(相对峰面积)
结果显示，同一份供试品溶液连续进样6次，各特征峰的相对保留时间RSD值在0.00％～0.44％范围内，相对峰面积RSD值在0.21％～0.42％范围内，均小于3.0％，表明仪器精密度良好。
(3)稳定性考察
取羌活标准汤剂(GT1803064)适量，研细，取约0.1g，精密称定，按“5.3”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2”项下确定的色谱条件，分别在0、2、7、14、19、26小时进样分析。以阿魏酸峰为参照峰S1，计算峰1、峰2的相对保留时间及相对峰面积，以羌活醇峰参照峰S2，计算峰4、峰5、峰6、峰8、峰9的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值，结果见表16、表17。
表16羌活标准汤剂特征图谱稳定性结果表(相对保留时间)
表17羌活标准汤剂特征图谱稳定性结果表(相对峰面积)
结果显示，同一份供试品溶液连续分别在0、2、7、14、19、26小时进样分析，各特征峰相对保留时间RSD值在0.06％～0.53％范围内，相对峰面积RSD值在0.23％～0.84％范围内，均小于3.0％，表明供试品溶液在26小时内稳定性良好。
(4)重复性考察
取同一批羌活标准汤剂(GT1803064)约0.1g，精密称定，平行6份，按“5.3”项下确定的供试品溶液制备方法，制备6份供试品溶液，按“2”项下确定的色谱条件，进样分析，以阿魏酸峰为参照峰S1，计算峰1、峰2的相对保留时间及相对峰面积，以羌活醇峰参照峰S2，计算峰4、峰5、峰6、峰8、峰9的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值，实验结果见表18、表19。
表18羌活标准汤剂特征图谱重复性结果表(相对保留时间)
表19羌活标准汤剂特征图谱重复性结果表(相对峰面积)
结果显示，同一批供试品溶液重复测定6次，各特征峰的相对保留时间RSD值在0.00％～0.28％范围内，相对峰面积RSD值在0.23％～0.97％范围内，均小于3.0％，表明该方法重复性良好。
(5)中间精密度考察
由本项目组其他分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，取同一批羌活标准汤剂(GT1803064)约0.1g，精密称定，平行6份，按“5.3”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2”项下确定的色谱条件，进样分析。以阿魏酸峰为参照峰S1，计算峰1、峰2的相对保留时间及相对峰面积，以羌活醇峰参照峰S2，计算峰4、峰5、峰6、峰8、峰9的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值，实验结果见表20、表21。其中序号1～6表示重复性测试，序号1#～6#表示中间精密度测试。
表20羌活标准汤剂特征图谱中间精密度结果表(相对保留时间)
表21羌活标准汤剂特征图谱中间精密度结果表(相对峰面积)
注：人员1，操作时间：2018/08/07；色谱仪：Waters H-Class；设备编码：208014；
人员2；操作时间：2018/08/01；色谱仪：Thermo Vanquish；设备编码：209012；
结果显示，由不同的分析人员在不同时间于不同的仪器上操作，同一批供试品溶液重复测定6次，各特征峰的相对保留时间RSD值在0.04％～0.29％范围内，相对峰面积RSD值在0.43％～1.86％范围内；均小于3.0％，各特征峰的相对保留时间与重复性试验6个数据RSD值在0.12％～2.80％范围内，相对峰面积RSD值在0.90％～2.59％范围内，均小于3.0％，说明该特征图谱方法中间精密度良好。
(6)耐用性考察
①不同色谱柱的考察
由于在方法优化过程中发现，不同品牌色谱对各色谱峰分离度影响较大，不同品牌色谱柱耐用性较差。因此，建议固定Agilent SB C18色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm)。为保证该特征图谱方法在不同批次的Agilent SB C18色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm)上能够重现，因此，本实验比较同一品牌不同批次的3根色谱柱，编号分别为：BH-101、BH-169、BH-142，对羌活标准汤剂特征图谱的影响。
取羌活标准汤剂(GT1803064)约0.1g，精密称定，按“5.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，除了色谱柱不同外，其他色谱条件均同“2”项下的规定，进样分析。以阿魏酸峰为参照峰S1，计算峰1、峰2的相对保留时间及相对峰面积，以羌活醇峰参照峰S2，计算峰4、峰5、峰6、峰8、峰9的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值，实验结果见表22、表23。
表22羌活标准汤剂特征图谱不同色谱柱考察结果表(相对保留时间)
表23羌活标准汤剂特征图谱不同色谱柱考察结果表(相对峰面积)
结果显示，同一型号不同色谱柱，各特征峰的相对保留时间RSD值在0.09％～2.39％范围内，相对峰面积RSD值在1.52％～2.99％范围内，均小于3.0％，说明同一型号色谱柱的耐用性良好。
②不同柱温的考察
比较不同的柱温，分别为28℃、30℃和32℃对羌活标准汤剂特征图谱耐用性影响。
取羌活标准汤剂(GT1803064)约0.1g，精密称定，按“5.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，除柱温分别为28℃、30℃和32℃之外，其余色谱条件均同“2”项下的规定，进样分析。以阿魏酸峰为参照峰S1，计算峰1、峰2的相对保留时间及相对峰面积，以羌活醇峰参照峰S2，计算峰4、峰5、峰6、峰8、峰9的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值。实验结果见表24、25。
表24羌活标准汤剂特征图谱不同柱温考察结果表(相对保留时间)
表25羌活标准汤剂特征图谱不同柱温考察结果表(相对峰面积)
结果显示，不同的柱温下，各特征峰的相对保留时间RSD值在0.00％～4.67％范围内，相对峰面积RSD值在0.92％～2.96％范围内，均小于5.0％，但柱温为32℃时，峰4、峰5分离度较差，建议固定柱温30℃。
③不同流速的考察
比较不同流速，分别为0.24ml/min、0.25ml/min、0.26ml/min对羌活标准汤剂特征图谱耐用性影响。
取羌活标准汤剂(GT1803064)约0.1g，精密称定，按“5.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，除流速分别为0.24ml/min、0.25ml/min和0.26ml/min之外，其余色谱条件均同“2”项下的规定，进样分析。以阿魏酸峰为参照峰S1，计算峰1、峰3的相对保留时间及相对峰面积，以羌活醇峰参照峰S2。计算峰4、峰6、峰7的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值。实验结果见表26、表27。
表26羌活标准汤剂特征图谱不同流速考察结果表(相对保留时间)
表27羌活标准汤剂特征图谱不同流速考察结果表(相对峰面积)
结果显示，在不同的流速下，各特征峰的相对保留时间RSD值在0.03％～1.87％范围内，相对峰面积RSD值在0.28％～2.92％范围内，说明该分析方法在该分析方法不同流速耐用性较好。
小结：
该特征图谱方法经专属性、精密度、重复性和稳定性验证，均符合规定，经中间精密度考察，相对保留时间及相对峰面积均较稳定。峰4、峰5分离度受柱温影响较大，建议固定柱温30℃。
5.4羌活标准汤剂特征图谱样品测定结果
按照羌活标准汤剂特征图谱的测定方法，详见“2”特征图谱分析方法的建立”，以对照药材为参照，测定15批羌活标准汤剂样品特征图谱，以阿魏酸峰为参照峰S1，计算峰1、峰2的相对保留时间及相对峰面积；以羌活醇峰为参照峰S2。计算峰4、峰5、峰6、峰8、峰9的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，15批羌活标准汤剂特征图谱叠加图见图19。
将15批羌活标准汤剂UPLC特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行匹配，按平均数法生成对照图谱，建立羌活标准汤剂对照特征图谱，如图20，该特征图谱共有9个特征峰，并与羌活对照药材参照物色谱中9个特征峰相对应，羌活对照药材特征图谱见图21。
所述羌活标准汤剂的特征图谱包括9个共有峰；其中与阿魏酸对应的为3号峰，与羌活醇对应的为7号峰。
在一种实施方式中，所述羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱中，以3号峰为参照峰S1，1号峰、2号峰与S1峰的相对保留时间符合：1号峰0.306～0.374，2号峰0.648～0.792；
以7号峰为参照峰S2，4号峰、5号峰、6号峰、8号峰、9号峰与S2峰的相对保留时间符合：4号峰0.621～0.759，5号峰0.648～0.792，6号峰0.873～1.067，8号峰0.936～1.144，9号峰0.954～1.166。
具体结果见表28和表29。
表28 15批羌活标准汤剂特征图谱的相对保留时间
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表29 15批羌活标准汤剂特征图谱的相对峰面积
5.5羌活与宽叶羌活标准汤剂特征图谱比较研究
按照羌活标准汤剂特征图谱的测定方法，详见“2”特征图谱分析方法的建立”，分别测定3批羌活标准汤剂、2批宽叶羌活标准汤剂样品特征图谱，其特征图谱叠加图见图22，局部放大图见图23。
结果显示，羌活和宽叶羌活标准汤剂特征图谱差异比较明显，通过对比羌活标准汤剂与宽叶羌活标准汤剂特征图谱，发现宽叶羌活标准汤剂峰5、峰6之间出现峰型明显高于峰6的峰10、峰11。而羌活标准汤剂峰5、峰6之间没有出现峰面积比峰6大的峰10、峰11，说明所建立的羌活特征图谱可用于区别宽叶羌活标准汤剂和羌活标准汤剂。
综上，本发明通过所述特征图谱的构建方法方法，首次建立了羌活药材、羌活标准汤剂的特征图谱，该特征图谱可充分展示羌活药材或羌活标准汤剂的化学成分特征，特征峰信息量丰富，可全面地反映羌活药材或羌活标准汤剂的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制羌活药材或羌活标准汤剂质量的目的。并且能够实现对羌活药材和宽叶羌活药材、及羌活标准汤剂和宽叶羌活标准汤剂的鉴别区分，保证特征图谱在药材和标准汤剂中能够得到一致性的传递，确保临床使用中药材的基原的准确性。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备参照物溶液，所述参照物溶液包括对照药材溶液和对照品溶液，所述对照品溶液包括阿魏酸对照品溶液、羌活醇和异欧前胡素混合对照品溶液、紫花前胡苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液；
取羌活药材或羌活标准汤剂制得供试品溶液；
取预设量的参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，建立特征图谱。
2.如权利要求1所述的羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱按下述程序进行：
0～9min，流动相A为25％→28.5％，流动相B为75％→71.5％；
9～25min，流动相A从28.5％→33.5％，流动相B从71.5％→66.5％；
25～30min，流动相A从33.5％→70％，流动相B从66.5％→30％；
30～31min，流动相A从70％→75％，流动相B从30％→25％；
31～45min，流动相A从75％→78％，流动相B从25％→22％。
3.如权利要求1所述的羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述磷酸溶液的体积浓度为0.1～0.25％；
所述参照物溶液和供试品溶液的预设量为1μL～3μL；
所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm，柱温为29℃～31℃；
所述进行梯度洗脱时，流动相的流速为0.24～0.26mL/min；
所述液相色谱仪的紫外检测波长为245nm～247nm。
4.如权利要求1所述的羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，采用下述方法完成所述取羌活药材制得供试品溶液：
取羌活药材，研磨后过45目～55目筛网，然后称取0.4g～0.6g与70％的甲醇混合，所述甲醇的加入量为20mL～30mL，加热回流处理25min～35min后，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.如权利要求1所述的羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，采用下述方法完成所述取羌活标准汤剂制得供试品溶液：
取羌活标准汤剂，研磨后称取0.05g～0.15g与70％的甲醇混合，所述甲醇的加入量为20mL～30mL，超声处理25min～35min后，放冷，再称定重量，用70％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
所述超声处理的功率为200W～300W，频率为35kHz～45kHz。
6.如权利要求1所述的羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述特征图谱包括羌活药材的特征图谱、羌活标准汤剂的特征图谱，所述特征图谱包括9个共有峰；其中与阿魏酸对应的为3号峰，与羌活醇对应的为7号峰。
7.如权利要求6所述的羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱中，以3号峰为参照峰S1，1号峰、2号峰与S1峰的相对保留时间符合：1号峰0.306～0.374，2号峰0.648～0.792；
以7号峰为参照峰S2，4号峰、5号峰、6号峰、8号峰、9号峰与S2峰的相对保留时间符合：4号峰0.621～0.759，5号峰0.648～0.792，6号峰0.873～1.067，8号峰0.936～1.144，9号峰0.954～1.166。
8.一种羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱，其特征在于，所述羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱采用如权利要求1～7任一项所述的羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱的构建方法获得。
9.权利要求8所述羌活药材或羌活标准汤剂的特征图谱在(1)、(2)或(3)中的应用：
(1)羌活药材或羌活标准汤剂的真伪鉴别和成分检测；
(2)羌活药材和宽叶羌活药材的区分；
(3)羌活标准汤剂和宽叶羌活标准汤剂的区分。
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