CN115266975B - 一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的含量测定方法，包括以下步骤：采用染料木苷作为鸡内金待测样品的指标性成分，进行超高效液相色谱检测，得到染料木苷含量。与现有技术相比，本发明采用高效液相色谱法(UPLC)首次建立了一种鸡内金及其炮制品中染料木苷的含量测定方法，该方法将染料木苷作为指标性成分，通过测定其含量来衡量鸡内金及其炮制品制剂工艺的稳定性，以保证制剂的质量，达到临床用药安全、有效；本发明方法稳定，操作简单，精密度高，对研究鸡内金及其炮制品具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地说，是涉及一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的含量测定方法。
背景技术
鸡内金为雉科动物家鸡Callus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊内壁。全国各地均产。鸡内金是一味常用中药，收载于历版《中国药典》，供临床使用。味甘，性平。鸡内金归脾、胃、小肠、膀胱经，具有健胃消食，涩精止遗，通淋化石的功效，主要用于治疗食积不消，呕吐泻痢，小儿疳积，遗尿，遗精，石淋涩痛，胆胀胁痛。鸡内金炒后质地酥脆，便于粉碎，并增强健脾消积的作用，用于消化不良、食积不化、肝虚泄泻及小儿疳积。鸡内金炒后喷醋质酥易碎，矫正不良气味，有疏肝助脾的作用，用于脾胃虚弱，脘腹胀满。
目前文献报道已知的鸡内金中主要化学成分有蛋白质、氨基酸、多糖以及微量元素等。但目前鸡内金现有的研究，多为氨基酸、多糖等成分的测定，动物药成分大多都含有氨基酸，因此，以氨基酸为指标进行含量测定，存在一定局限性。且《中国药典》2020年版第一部“鸡内金”项下，仅对鸡内金水分、灰分、浸出物进行了规定，未对炒、醋鸡内金进行规定。
现有的检测方法中鸡内金没有明确的指标性成分，难以有效比较和分析鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒含量的差异与变化，难以深入认识鸡内金及其炮制品药效物质基础在从原料到配方颗粒成品的工艺过程的传递情况，难以整体评价和控制从鸡内金及其炮制品饮片到配方颗粒成品的工艺过程。因此，明确鸡内金中的指标性成分，建立一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒含量测定方法，有利于整体评价鸡内金及其炮制品相关工艺过程的科学性、合理性，更能整体控制鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒的内在质量，确保鸡内金及其炮制品的临床疗效。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的含量测定方法，本发明采用高效液相色谱法 (UPLC)首次建立了一种鸡内金及其炮制品中染料木苷的含量测定方法，该方法将染料木苷作为指标性成分，通过测定其含量来衡量鸡内金及其炮制品制剂工艺的稳定性，以保证制剂的质量，达到临床用药安全、有效；本发明方法稳定，操作简单，精密度高，对研究鸡内金及其炮制品具有重要的意义。
本发明提供了一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的含量测定方法，包括以下步骤：
采用染料木苷作为鸡内金待测样品的指标性成分，进行超高效液相色谱检测，得到染料木苷含量。
优选的，所述鸡内金待测样品包括鸡内金药材、鸡内金饮片、鸡内金标汤、鸡内金配方颗粒、炒鸡内金饮片、炒鸡内金标汤、炒鸡内金配方颗粒、醋鸡内金饮片、醋鸡内金标汤和醋鸡内金配方颗粒中的一种或多种。
优选的，所述鸡内金待测样品制备供试品溶液的方法具体为：
鸡内金药材和鸡内金饮片：取样品粉末1g～3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml～30ml，称定重量，回流提取2.5h～3.5h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
炒鸡内金饮片和醋鸡内金饮片：取样品粉末1g～3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml～30ml，称定重量，回流提取1.5h～2.5h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
鸡内金标汤、炒鸡内金标汤、醋鸡内金标汤及鸡内金配方颗粒、炒鸡内金配方颗粒、醋鸡内金配方颗粒：取样品粉末0.05g～0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇5ml～15ml，称定重量，功率550W～650W、频率 35kHz～45kHz超声处理25min～35min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
优选的，所述进行超高效液相色谱检测的过程中，制备对照品溶液的方法具体为：
精密称取染料木苷对照品，加甲醇制成每1ml含6μg～10μg的溶液。
优选的，所述超高效液相色谱检测的色谱条件包括：
以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.005％～0.02％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
优选的，所述填充剂的柱长为90mm～110mm，内径为2.0mm～2.2mm，粒度为1.5μm～2μm。
优选的，所述梯度洗脱的过程具体为：
0～3min，流动相A：10wt％→30wt％，流动相B：90wt％→70wt％；
3min～10min，流动相A：30wt％→32wt％，流动相B：70wt％→68wt％；
10min～12min，流动相A：32wt％，流动相B：68wt％；
12min～12.01min，流动相A：32wt％→95wt％，流动相B：68wt％→5wt％；
12.01min～15min，流动相A：95wt％，流动相B：5wt％。
优选的，所述超高效液相色谱检测的检测波长为250nm～270nm，流速为0.3ml/min～0.5ml/min，柱温为39℃～41℃，理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
优选的，所述超高效液相色谱检测的过程具体为：
精密吸取对照品溶液、供试品溶液各1.5μL～2.5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明还提供了一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量控制方法，采用上述技术方案所述的含量测定方法，以染料木苷为指标性成分，实现质量控制。
本发明提供了一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的含量测定方法，包括以下步骤：采用染料木苷作为鸡内金待测样品的指标性成分，进行超高效液相色谱检测，得到染料木苷含量。与现有技术相比，本发明采用高效液相色谱法(UPLC)首次建立了一种鸡内金及其炮制品中染料木苷的含量测定方法，该方法将染料木苷作为指标性成分，通过测定其含量来衡量鸡内金及其炮制品制剂工艺的稳定性，以保证制剂的质量，达到临床用药安全、有效；本发明方法稳定，操作简单，精密度高，对研究鸡内金及其炮制品具有重要的意义。
附图说明
图1为染料木苷紫外吸收光谱图；
图2为不同流动相色谱图；
图3为不同柱温色谱图；
图4为不同流速色谱图；
图5为鸡内金药材专属性考察结果图；
图6为染料木苷标准曲线图；
图7为鸡内金药材染料木苷含量分布图；
图8为鸡内金饮片专属性考察结果图；
图9为鸡内金饮片染料木苷含量分布图；
图10为染料木苷紫外吸收光谱图；
图11为不同流动相色谱图；
图12为不同柱温色谱图；
图13为不同流速色谱图；
图14为鸡内金标汤专属性考察结果图；
图15为染料木苷标准曲线图；
图16为鸡内金标准汤剂染料木苷含量分布图；
图17为取溶剂考察结果；
图18为提取方式考察结果；
图19为提取时间考察结果；
图20为溶剂加入量考察结果；
图21为鸡内金配方颗粒专属性考察；
图22为染料木苷标准曲线图；
图23为染料木苷紫外吸收光谱图；
图24为不同流动相色谱图；
图25为不同柱温色谱图；
图26为不同流速色谱图；
图27为炒鸡内金专属性考察结果图；
图28为染料木苷标准曲线图；
图29为炒鸡内金饮片染料木苷含量分布图；
图30为染料木苷紫外吸收光谱图；
图31为不同流动相色谱图；
图32为不同柱温色谱图；
图33为不同流速色谱图；
图34为炒鸡内金标汤专属性考察结果图；
图35为染料木苷标准曲线图；
图36为炒鸡内金标准汤剂染料木苷含量分布图；
图37为染料木苷紫外吸收光谱图；
图38为不同流动相色谱图；
图39为不同流速色谱图；
图40为不同柱温色谱图；
图41为炒鸡内金配方颗粒专属性对比图；
图42为染料木苷标准曲线图；
图43为染料木苷紫外吸收光谱图；
图44为不同流动相色谱图；
图45为不同柱温色谱图；
图46为不同流速色谱图；
图47为醋鸡内金专属性考察结果图；
图48为染料木苷标准曲线图；
图49为醋鸡内金饮片染料木苷含量分布图；
图50为染料木苷紫外吸收光谱图；
图51为不同流动相色谱图；
图52为不同柱温色谱图；
图53为不同流速色谱图；
图54为醋鸡内金标汤专属性考察结果图；
图55为染料木苷标准曲线图；
图56为醋鸡内金标准汤剂染料木苷含量分布图；
图57为染料木苷紫外吸收光谱图；
图58为不同流动相色谱图；
图59为不同流速色谱图；
图60为不同柱温色谱图；
图61为醋鸡内金配方颗粒专属性对比图；
图62为染料木苷标准曲线图；
图63为本发明技术效果比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的含量测定方法，包括以下步骤：
采用染料木苷作为鸡内金待测样品的指标性成分，进行超高效液相色谱检测，得到染料木苷含量。
在本发明中，所述鸡内金待测样品优选包括鸡内金药材、鸡内金饮片、鸡内金标汤、鸡内金配方颗粒、炒鸡内金饮片、炒鸡内金标汤、炒鸡内金配方颗粒、醋鸡内金饮片、醋鸡内金标汤和醋鸡内金配方颗粒中的一种或多种，更优选为鸡内金药材、鸡内金饮片、鸡内金标汤、鸡内金配方颗粒、炒鸡内金饮片、炒鸡内金标汤、炒鸡内金配方颗粒、醋鸡内金饮片、醋鸡内金标汤或醋鸡内金配方颗粒。本发明对所述鸡内金待测样品的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的市售商品即可。
在本发明中，所述鸡内金待测样品制备供试品溶液的方法优选具体为：
鸡内金药材和鸡内金饮片：取样品粉末1g～3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml～30ml，称定重量，回流提取2.5h～3.5h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
炒鸡内金饮片和醋鸡内金饮片：取样品粉末1g～3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml～30ml，称定重量，回流提取1.5h～2.5h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
鸡内金标汤、炒鸡内金标汤、醋鸡内金标汤及鸡内金配方颗粒、炒鸡内金配方颗粒、醋鸡内金配方颗粒：取样品粉末0.05g～0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇5ml～15ml，称定重量，功率550W～650W、频率 35kHz～45kHz超声处理25min～35min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
更优选为：
鸡内金药材和鸡内金饮片：取样品粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，回流提取3h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
炒鸡内金饮片和醋鸡内金饮片：取样品粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，回流提取2h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
鸡内金标汤、炒鸡内金标汤、醋鸡内金标汤及鸡内金配方颗粒、炒鸡内金配方颗粒、醋鸡内金配方颗粒：取样品粉末0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，功率600W、频率40kHz超声处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
在本发明中，所述进行超高效液相色谱检测的过程中，制备对照品溶液的方法优选具体为：
精密称取染料木苷对照品，加甲醇制成每1ml含8μg的溶液；
更优选为：
精密称取染料木苷对照品，加甲醇制成每1ml含8μg的溶液。
在本发明中，所述超高效液相色谱检测的色谱条件优选包括：
以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.005％～0.02％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；
更优选为：
以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
在本发明中，所述填充剂的柱长优选为90mm～110mm，更优选为100mm，内径优选为2.0mm～2.2mm，更优选为2.1mm，粒度优选为1.5μm～2μm，更优选为1.8μm。
在本发明中，所述梯度洗脱的过程优选具体为：
0～3min，流动相A：10wt％→30wt％，流动相B：90wt％→70wt％；
3min～10min，流动相A：30wt％→32wt％，流动相B：70wt％→68wt％；
10min～12min，流动相A：32wt％，流动相B：68wt％；
12min～12.01min，流动相A：32wt％→95wt％，流动相B：68wt％→5wt％；
12.01min～15min，流动相A：95wt％，流动相B：5wt％。
在本发明中，所述超高效液相色谱检测的检测波长优选为250nm～270nm，更优选为260nm，流速优选为0.3ml/min～0.5ml/min，更优选为0.4ml/min，柱温优选为39℃～41℃，更优选为40℃，理论板数按染料木苷峰计算应不低于 5000。
在本发明中，所述超高效液相色谱检测的过程优选具体为：
精密吸取对照品溶液、供试品溶液各1.5μL～2.5μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
更优选为：
精密吸取对照品溶液、供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明公开了鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的UPLC含量测定方法研究，确立了1个新的指标成分染料木苷，且本方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。保证药物的疗效，使药材及其相关制剂得到了更为正规的质量控制，从而能够达到全面、有效地控制鸡内金药材、饮片及其相关制剂的质量。
本发明还提供了一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量控制方法，采用上述技术方案所述的含量测定方法，以染料木苷为指标性成分，实现质量控制。
《中国药典》2020版“鸡内金”项下未规定含量测定项，鸡内金现有的研究未发现其特异的药效成分，已报道的胃蛋白酶、淀粉酶、类角蛋白等成分需要采用电泳检测法，操作繁琐，实验要求高；鸡内金多糖需要用紫外风光光度计测定，灵敏度低。本发明采用超高效液相色谱法首次建立一种鸡内金及其炮制品中染料木苷的含量测定方法，方法稳定性好、精密度高、重现性好、操作便捷且易于掌握；有益效果如下：
本发明首次确定染料木苷作为评价鸡内金的指标成分，并提供上述技术方案，具体为染料木苷作为鸡内金含量测定指标的完整方法学，证明本发明方法稳定、可重复；技术方案中的色谱条件和供试品制备方法目前尚未有人基于用染料木苷作为鸡内金的含量测定指标而提出，未见鸡内金中染料木苷的UPLC含量测定方法报道，上述核心内容为首次考察得到；同时，为了评价药品制剂工艺的稳定性，需要确定一个指标性成分作为衡量标准，选择染料木苷作为鸡内金的指标成分，本发明方法能够测定鸡内金药材、饮片、标准汤剂提取物及配方颗粒制剂中染料木苷的含量，从药材到制剂质量传递保持物料平衡，保证制剂质量安全有效。
本发明提供了一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的含量测定方法，包括以下步骤：采用染料木苷作为鸡内金待测样品的指标性成分，进行超高效液相色谱检测，得到染料木苷含量。与现有技术相比，本发明采用高效液相色谱法(UPLC)首次建立了一种鸡内金及其炮制品中染料木苷的含量测定方法，该方法将染料木苷作为指标性成分，通过测定其含量来衡量鸡内金及其炮制品制剂工艺的稳定性，以保证制剂的质量，达到临床用药安全、有效；本发明方法稳定，操作简单，精密度高，对研究鸡内金及其炮制品具有重要的意义。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例对本发明提供的鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的UPLC含量测定方法进行详细说明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例
1、仪器与试药
1.1仪器
高效液相色谱仪：岛津LC-30AD型超高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E、XPE26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
电子恒温水浴锅：DZKW-4型(北京中兴伟业仪器有限公司)；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 100×2.1mm，1.8μm。
1.2试剂
乙腈、甲醇、醋酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
1.3试药
染料木苷(批号：111709-201702，中国食品药品检定研究院)；
鸡内金药材(XLS201902092、XLS201903100、XLS201903101、 XLS201903102、XLS201903103、XLS201903104、XLS201903105、 XLS201903106、XLS201903107、XLS201903108、XLS201903109、 XLS201903110、XLS201903111、XLS201903166、XLS201903168)；
鸡内金饮片(批号：JNJ190301、JNJ190302、JNJ190303、JNJ190304、 JNJ190305、JNJ190306、JNJ190307、JNJ190308、JNJ190309、JNJ190310、 JNJ190311、JNJ190312、JNJ190313、JNJ190314、JNJ190315)；
炒鸡内金饮片(批号：CJNJ190301、CJNJ190302、CJNJ190303、 CJNJ190304、CJNJ190305、CJNJ190306、CJNJ190307、CJNJ190308、 CJNJ190309、CJNJ190310、CJNJ190311、CJNJ190312、CJNJ190313、 CJNJ190314、CJNJ190315)；
醋鸡内金饮片(批号：CUJNJ190301、CUJNJ190302、CUJNJ190303、 CUJNJ190304、CUJNJ190305、CUJNJ190306、CUJNJ190307、CUJNJ190308、 CUJNJ190309、CUJNJ190310、CUJNJ190311、CUJNJ190312、CUJNJ190313、 CUJNJ190314、CUJNJ190315)；
鸡内金标准汤剂冻干粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：JNJBT190401、JNJBT190402、JNJBT190403、JNJBT190404、JNJBT190405、 JNJBT190406、JNJBT190407、JNJBT190408、JNJBT190409、JNJBT190410、 JNJBT190411、JNJBT190412、JNJBT190413、JNJBT190414、JNJBT190415)；
炒鸡内金标准汤剂冻干粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：CJNJBT190401、CJNJBT190402、CJNJBT190403、CJNJBT190404、 CJNJBT190405、CJNJBT190406、CJNJBT190407、CJNJBT190408、CJNJBT190409、CJNJBT190410、CJNJBT190411、CJNJBT190412、 CJNJBT190413、CJNJBT190414、CJNJBT190415)；
醋鸡内金标准汤剂冻干粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：CUJNJBT190401、CUJNJBT190402、CUJNJBT190403、CUJNJBT190404、 CUJNJBT190405、CUJNJBT190406、CUJNJBT190407、CUJNJBT190408、 CUJNJBT190409、CUJNJBT190410、CUJNJBT190411、CUJNJBT190412、 CUJNJBT190413、CUJNJBT190414、CUJNJBT190415)；
鸡内金配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号： 2103001、2103002、2103003)；
炒鸡内金配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号： 2104001、2104002、2104003)；
醋鸡内金配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号： 2104004、2104005、2104006)。
2、药材含量测定方法建立
2.1鸡内金药材
2.1.1试品溶液的制备
取本品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，回流提取3小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.2对照品溶液的制备
精密称取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含8μg的溶液。
2.1.3色谱条件
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速 0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.1.4色谱条件选择与系统适用性考察
2.1.4.1检测波长确定
对染料木苷对照品溶液进行全波长光谱采集，通过对光谱图的分析，确定鸡内金标准汤剂中染料木苷的含量测定的最佳检查波长为260nm，见图1。
2.1.4.2流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，对流动相分别为：甲醇-水、甲醇-0.01％醋酸、乙腈-0.01％醋酸，进行考察。结果见图2。
结果表明，流动相为甲醇-水、甲醇-0.01％醋酸、乙腈-0.01％醋酸时，染料木苷峰面积差异不大，分离度均能达到要求。暂选择流动相为甲醇-0.01％醋酸溶液梯度洗脱为洗脱条件。
2.1.4.3柱温考察
在甲醇-0.01％醋酸，检测波长260nm条件下，分别在柱温为35℃、40℃、 45℃柱温下分析，以染料木苷色谱峰的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。结果见图3、表1。
表1不同柱温分析结果
结果表明，三种柱温均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着柱温升高，理论塔板数增加。综合考虑，最终确定柱温为40℃。
2.1.4.4流速考察
在拟定柱温的基础上，考察供试品溶液在流速为0.3mL/min、0.4mL/min、 0.4mL/min下进行分析，以染料木苷分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。见图4、表2。
表2不同流速分析结果
结果表明，三种流速均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着流速增加，理论塔板数降低。综合考虑，流速选择0.4mL/min。
2.1.4.5色谱条件和系统适应性试验结果
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
2.1.5供试品溶液制备方法考察
2.1.5.1提取溶剂考察
取供试品10份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇、水25mL，回流提取2小时，放冷，以相应溶剂补足减失重量，滤过，取续滤液2μL注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取染料木苷含量。结果见表3。
表3不同提取溶剂的分析结果
结果表明，以上述溶剂为提取溶媒，用甲醇提取时，样品重染料木苷含量最高，故以甲醇作为含测提取溶剂。
2.1.5.2提取方式考察
取供试品4份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，2份超声提取(功率600W，频率40kHz)、2份回流提取，提取时间均为2h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表4。
表4不同提取方式分析结果
结果表明，回流提取所得染料木苷含量较高，故以回流提取为提取方式。
2.1.5.3提取时间考察
取本品8份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，分别回流提取1h、2h、3h、4h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取时间下染料木苷含量，结果见表5。
表5不同提取时间的分析结果
/>
结果表明，样品中染料木苷在3h时可提取完全，故选择提取时间为3h。
2.1.5.4溶剂加入量量考察
取本品6份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇10mL、 25mL、50mL，密塞，称定重量，回流提取3h，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表6。
表6不同溶剂加入量量的分析结果
结果表明，供试品溶剂加入量为10mL、25mL、50mL时，样品中染料木苷含量差异不大。综合样品峰面积等，暂定提取溶剂加入量为25mL。
2.1.5.5供试品溶液制备方法确定
取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，回流提取3小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.6方法学考察
2.1.6.1专属性实验
按拟定方法制备供试品溶液对照品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图5。
结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
2.1.6.2精密度考察
取对照品溶液连续进样6次，记录染料木苷的峰面积，计算RSD值，结果见表7。
表7精密度考察结果
结果表明，精密度考察中染料木苷的峰面积RSD值为0.53％，本方法的进样精密度良好。
2.1.6.3线性关系
取染料木苷对照品适量，置于5mL容量瓶内，用甲醇配置成 650.7486μg/mL对照品母液。精密量取上述对照品溶液1.0mL至10mL容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，得65.07486μg/mL溶液。以此类推，分别稀释得到 32.1.53743、16.26872、8.134358、4.067179、2.033589μg/mL。分别取上述溶液2μL注入液相色谱仪，分析得到峰面积，以进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表8、图6。
表8染料木苷标准曲线分析结果
结果表明：染料木苷标准曲线为Y＝12024.1159X-5303.3682，R2＝0.9999。表明进样浓度在2.033589～65.07486μg/mL范围内，线性关系良好。
2.1.6.4稳定性实验
取同一供试品溶液，分别在0、2h、4h，8h，12h，24h测定染料木苷色谱峰面积，结果见表9。
表9染料木苷稳定性实验结果
结果表明，在本实验条件下，染料木苷的峰面积RSD值为0.84％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.1.6.5重复性试验
取同一供试品2g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见表10。
表10重复性实验结果
结果表明，染料木苷的含量RSD值为1.04％，本方法重复性良好。
2.1.6.6中间精密度
2.1.6.6.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取样品制备供试品溶液，分别在安捷伦1290、Waters、岛津LC-30AD超高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为Waters ACQUITYUPLC HSS T3 1.8μm 2.1×100mm)。结果见表11。
表11不同仪器考察结果
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，染料木苷含量的RSD 值为1.02％。
2.1.6.6.2不同人员时间考察
取同一供试品(批号：XLS201903107)由不同人员(A、B)在不同时间 (I、II)制备供试品溶液分别在仪器a、b进行分析，计算供试品中染料木苷的含量，结果见表12。
表12不同人员时间考察结果
结果表明，染料木苷的含量测定结果RSD值为0.72％，本方法中间精密度良好。
2.1.6.7加样回收率
取已知含量的供试品约1g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的染料木苷对照品(纯度：99.9％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表13。计算公式如下：
表13加样回收实验结果
结果表明，回收率结果的RSD值为1.48％，本方法准确度良好。
2.1.6.8耐用性考察
采用不同品牌C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18 100×2.1mm，1.8μm、 DIMKAEndenvoril C18 100×2.1mm，1.8μm、Waters ACQUITY UPLC HSS T3100×2.1mm，1.8μm)在同一仪器对同一供试品进行检测，结果见表14。
表14耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱的分析色谱指标良好，测量结果的RSD值为2.65％，本方法耐用性良好。
2.1.7样品含量测定验证
以15批鸡内金药材为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算染料木苷的含量，结果见表15、图7。
表15 15批鸡内金标准汤剂含量测定结果
结果表明，鸡内金药材染料木苷的平均含量为0.012％，SD为0.002％。本品按干燥品计算，含量测定平均值的70％～130％限量为含染料木苷 (C21H20O10)0.008％～0.016％；含量测定均值加减3倍SD的限量范围为含染料木苷(C21H20O10)0.006％～0.018％。故建议鸡内金药材染料木苷含量不低于 0.006％。
2.2鸡内金饮片
2.2.1专属性实验
按拟定方法制备供试品溶液对照品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图8。
2.2.2样品含量测定验证
以15批鸡内金饮片为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算染料木苷的含量，结果见表16、图9。
表16 15批鸡内金标准汤剂含量测定结果
检测的15批鸡内金饮片按干燥品计算的染料木苷(C21H20O10)含量范围为0.008％～0.016％，平均值为0.012％，SD为0.003，平均值的70％～130％的范围为0.008％～0.016％，平均值加减3倍SD范围为0.003％～0.016％。故建议鸡内金饮片染料木苷含量不低于0.003％。
2.3鸡内金标汤
2.3.1供试品溶液的制备
取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.2对照品溶液的制备
精密称取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含8μg的溶液。
2.3.3色谱条件
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速 0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.3.4色谱条件选择与系统适用性考察
2.3.4.1检测波长确定
对染料木苷对照品溶液进行全波长光谱采集，通过对光谱图的分析，确定鸡内金标准汤剂中染料木苷的含量测定的最佳检查波长为260nm，见图10。
2.3.4.2流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，对流动相分别为：甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸、甲醇-0.01％甲酸、乙腈-0.01％醋酸，进行考察。结果见图11。
结果表明，流动相为甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸、甲醇 -0.01％甲酸时差异不大。参考鸡内金标汤特征图谱流动相考察结果，选择流动相甲醇-0.01％醋酸溶液为梯度洗脱为洗脱条件。
2.3.4.3柱温考察
在甲醇-0.01％醋酸，检测波长260nm条件下，分别在柱温为35℃、40℃、 45℃柱温下分析，以染料木苷色谱峰的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。结果见图12、表17。
表17不同柱温分析结果
结果表明，三种柱温均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着柱温升高，理论塔板数增加。综合考虑，最终确定柱温为40℃。
2.3.4.4流速考察
在拟定柱温的基础上，考察供试品溶液在流速为0.35mL/min、0.4mL/min、0.45mL/min下进行分析，以染料木苷分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。见图13、表18。
表18不同流速分析结果
结果表明，三种流速均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着流速增加，理论塔板数降低。综合考虑，流速选择0.4mL/min。
2.3.4.5色谱条件和系统适应性试验结果
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速 0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
2.3.5供试品溶液制备方法考察
2.3.5.1提取溶剂考察
取供试品10份各约0.1g，精密称定，分别加50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇、水10mL，超声提取30min，放冷，以相应溶剂补足减失重量，滤过，取续滤液2μL注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取染料木苷含量。结果见表 19。
表19不同提取溶剂的分析结果
结果表明，50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇作提取溶剂，样品中染料木苷含量差异不大，标汤特征以甲醇为提取溶剂，故以甲醇作为含测提取溶剂。
2.3.5.2提取方式考察
取供试品4份各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，2份超声提取、2份回流提取，提取时间均为30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表20。
表20不同提取方式分析结果
结果表明，回流提取和超声提取所得染料木苷含量均为0.12％，二者无显著差异，以操作简捷的超声提取为提取方式。
2.3.5.3提取时间考察
取本品6份各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，分别超声提取15min、30min、45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取时间下染料木苷含量，结果见表21。
表21不同提取时间的分析结果
结果表明，提取时间为15min、30min时提取效率较高，为保证样品充分提取，选择提取时间为30min。
2.3.5.4溶剂加入量量考察
取本品(批号：JNJBT190409)6份各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇5mL、10mL、25mL，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表22。
表22不同溶剂加入量量的分析结果
结果表明，供试品溶剂加入量为10mL时，样品中染料木苷含量最高。故确定提取溶剂加入量为10mL。
2.3.5.5供试品溶液制备方法确定
取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.6方法学考察
2.3.6.1专属性实验
按拟定方法制备供试品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图14。
结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
2.3.6.2精密度考察
取对照品溶液连续进样6次，记录染料木苷的峰面积，计算RSD值，结果见表23。
表23精密度考察结果
结果表明，精密度考察中染料木苷的峰面积RSD值为0.18％，本方法的进样精密度良好。
2.3.6.3线性关系
取染料木苷对照品适量，置于5mL容量瓶内，用甲醇配置成 650.7486μg/mL对照品母液。精密量取上述对照品溶液1.0mL至10mL容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，得65.07486μg/mL溶液。以此类推，分别稀释得到32.1.53743、16.26872、8.134358、4.067179、2.033589μg/mL。分别取上述溶液2μL注入液相色谱仪，分析得到峰面积，以进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表24、图15。
表24染料木苷标准曲线分析结果
结果表明：染料木苷标准曲线为Y＝12024.1159X-5303.3682，R2＝0.9999。表明进样浓度在2.03～65.07μg/mL范围内，线性关系良好。
2.3.6.4稳定性实验
取同一供试品溶液，分别在0、2h、4h，8h，12h，16h，24h测定染料木苷色谱峰面积，结果见表25。
表25染料木苷稳定性实验结果
结果表明，在本实验条件下，染料木苷的峰面积RSD值为0.86％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.3.6.5重复性
取同一供试品0.1g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见表26。
表26重复性实验结果
结果表明，染料木苷的含量RSD值为1.19％，本方法重复性良好。
2.3.6.6中间精密度
2.3.6.6.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取鸡内金标汤，制备供试品溶液，分别在安捷伦1290、Waters、岛津LC-30AD超高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为WatersACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 2.1×100mm)。结果见表27。
表27不同仪器考察结果
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，染料木苷含量的RSD 在2.16％。
2.3.6.6.2不同人员时间考察
取同一供试品由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)制备供试品溶液分别在仪器a、b进行分析，计算供试品中染料木苷的含量，结果见表28。
表28不同人员时间考察结果
结果表明，染料木苷的含量测定结果RSD值为0.83％，本方法中间精密度良好。
2.3.6.7加样回收率
取已知含量的供试品(批号：JNJBT190409)约0.05g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的染料木苷对照品(纯度：99.9％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表29。计算公式如下：
表29加样回收实验结果
结果表明，回收率结果的RSD值为1.97％，本方法准确度良好。
2.3.6.8耐用性考察
采用不同品牌C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18 100×2.1mm，1.8μm、 DIMKAEndenvoril C18 100×2.1mm，1.8μm、Waters ACQUITY UPLC HSS T3100×2.1mm，1.8μm)在同一仪器对同一供试品(批号：JNJBT190410)进行检测，结果见表30。
表30耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱的分析色谱指标良好，测量结果的RSD值为2.97％，本方法耐用性良好。
2.3.7样品含量测定验证
以15批鸡内金标准汤剂冻干粉为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算染料木苷的含量，结果见表31、图16。
表31 15批鸡内金标准汤剂含量测定结果
结果表明，鸡内金标准汤剂染料木苷的平均含量为0.099％，SD为0.021％。本品按干燥品计算，含量测定平均值的70％～130％限量为含染料木苷 (C21H20O10)0.069％～0.129％；含量测定均值加减3倍SD的限量范围为含染料木苷(C21H20O10)0.036％～0.162％。
2.4鸡内金配方颗粒
2.4.1供试品溶液的制备
取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4.2对照品溶液的制备
精密称取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含8μg的溶液。
2.4.3色谱条件
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速 0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.4.4供试品溶液制备考察
2.4.4.1提取溶剂考察
取本品颗粒约0.1g，精密称定，分别加50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇、水10mL，超声提取(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，以相应溶剂补足减失重量，滤过，取续滤液2μL注入色谱仪。分析计算不同溶剂提取染料木苷含量。结果见表32，图17。
表32提取溶剂考察结果
结果表明，50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇为提取溶剂，检测染料木苷含量差异不大，甲醇的提取效率最高，因此选择甲醇作为鸡内金配方颗粒检测染料木苷的提取溶剂。
2.4.4.2提取方式考察
取本品颗粒约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取30 分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪。分别计算不同提取方式染料木苷的含量。结果见表33，图18。
表33提取方式考察结果
结果表明，超声提取和回流提取所得染料木苷含量接近，故选择操作简捷的超声提取。
2.4.4.3提取时间考察
取本品颗粒约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取15min、30min、45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪。分析计算不同提取时间下染料木苷含量，结果见表34，图19。
表34提取时间考察结果
结果表明，当提取时间为30分钟时，即可充分提取。故供试品提取时间确定为30分钟。
2.4.4.4溶剂加入量考察
取本品颗粒约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇10mL、 25mL、50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。分别精密吸取供试品溶液2μL，注入液相色谱仪，即得。以染料木苷含量作为评价指标，见表35，图20。
表35溶剂加入量含量结果
结果表明，当精密加入10mL时，染料木苷提取率最高，提取较为完全。故供试品溶剂加入量确定为10mL。
综上所述，鸡内金配方颗粒含量测定供试品制备方法确定为：取本品颗粒约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
2.4.5方法学考察
2.4.5.1专属性考察
按拟定方法制备对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图21。
结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
2.4.5.2精密度考察
取对照品溶液连续进样6次，记录染料木苷的峰面积，计算RSD值，结果见表36。
表36精密度考察结果
结果表明，精密度考察中染料木苷的峰面积RSD值为0.27％，表明仪器进样精密度良好。
2.4.5.3线性关系
分别精密吸取鸡内金对照品溶液(65.07486μg/mL)各稀释0倍、2倍、4 倍、8倍、16倍、32倍，分别取上述溶液2μL注入液相色谱仪，得到峰面积，以进样量(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表37，图22。
表37染料木苷标准曲线分析结果
结果表明：染料木苷进样量范围在65.07486～2.033589μg/mL时，线性关系为y＝12024.1161x-5303.3814，R2＝0.9999。表明进样量在 65.07486～2.033589μg/mL时，呈良好的线性关系。
2.4.5.4重复性
取本品颗粒约0.1g，精密称定6份，由同一操作人员按照确定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的染料木苷含量，结果见表38。
表38重复性实验结果
结果表明，染料木苷含量的RSD值为1.04％，表明本方法重复性良好。
2.4.5.5中间精密度
2.4.5.5.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，本品颗粒(批号：SY1807001)约0.2g，精密称取两份，制备供试品溶液，分别在岛津30AD、安捷伦1290、 WatersAcquity型超高效液相色谱仪上进行考察(色谱柱均为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 2.1×100mm)。计算染料木苷含量，所得结果，见表39。
表39不同仪器试验结果
结果表明，在岛津30AD、安捷伦1290、Waters Acquity型超高效液相色谱仪上进行考察，染料木苷的含量测定结果RSD值为1.2％，说明本方法中间精密度良好。
2.4.5.5.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、 T2)分别取本品颗粒(批号：YYS02292101001G)约0.1g，各精密称定二份，制备供试品，进行测定。计算所得染料木苷含量结果，见表40。
表40不同人员与时间考察结果
结果表明，不同人员在不同时间检测，染料木苷的含量测定结果RSD值为0.7％，本方法中间精密度良好。
2.4.5.6加样回收率
取已知含量的供试品(染料木苷的含量0.108％)，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的染料木苷对照品(纯度99.9％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表41。计算公式如下：
表41加样回收实验结果
结果表明，回收率平均值为94.04％，结果的RSD值为1.5％，本方法准确度良好。
2.4.5.7耐用性考察
2.4.5.7.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对Agilent ZORBAX SB-C18 100×2.1mm，1.8μm、DIMKA Endenvoril C18 100×2.1mm，1.8μm、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 100×2.1mm，1.8μm的色谱柱进行考察，结果见表 42。
表42耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱的分析色谱指标良好，6个测量结果的RSD值为 1.1％，本方法色谱柱耐用性良好。
2.4.5.8稳定性实验
取本品颗粒(批号：YYS02292101001G)约0.1g，精密称定一份，制备供试品溶液，分别在0h、6h、8h、12h、16h、24h测定染料木苷峰面积，结果见表43。
表43染料木苷稳定性实验结果
/>
结果表明，在本实验条件下，染料木苷含量的RSD值为1.2％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.4.6样品含量测定验证
以鸡内金配方颗粒为供试品，按拟定的方法对三批鸡内金配方颗粒进行检验，结果见表44。
表44三批鸡内金配方颗粒含量检验结果
结论：鸡内金配方颗粒剂的含量测定方法能够对鸡内金配方颗粒进行有效的检测。三批鸡内金成品含量分别为：0.112％、0.135％、0.142％；平均值加减30％的限量为0.091％～0.169％，SD值为0.016，平均值加减3SD的限量为0.082％～0.178％。故建议鸡内金配方颗粒的染料木苷含量测定范围为 0.082％～0.178％。修订为0.080％～0.180％。
由以上数据暂将鸡内金配方颗粒的染料木苷含量测定范围确定为“本品每1g含染料木苷(C21H20O10)应为0.80mg～1.8mg”。
2.5炒鸡内金饮片
2.5.1供试品溶液的制备
取本品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，回流提取2小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.5.2对照品溶液的制备
精密称取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含8μg的溶液。
2.5.3色谱条件
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.5.4色谱条件选择与系统适用性考察
2.5.4.1检测波长确定
对染料木苷对照品溶液进行全波长光谱采集，通过对光谱图的分析，确定炒鸡内金标汤中染料木苷的含量测定的最佳检查波长为260nm，见图23。
2.5.4.2流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，对流动相分别为：甲醇-水、甲醇-0.01％醋酸、乙腈-0.01％醋酸，进行考察。结果见图24。
结果表明，流动相为甲醇-水、甲醇-0.01％醋酸、甲醇-0.01％磷酸时差异不大，暂选择流动相为甲醇-0.01％醋酸溶液梯度洗脱为洗脱条件。
2.5.4.3柱温考察
在甲醇-0.01％醋酸，检测波长260nm条件下，分别在柱温为35℃、40℃、 45℃柱温下分析，以染料木苷色谱峰的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。结果见图25、表45。
表45不同柱温分析结果
结果表明，三种柱温均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着柱温升高，理论塔板数增加。综合考虑，最终确定柱温为40℃。
2.5.4.4流速考察
在拟定柱温的基础上，考察供试品溶液在流速为0.3mL/min、0.4mL/min、 0.4mL/min下进行分析，以染料木苷分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。见图26、表46。
表46不同流速分析结果
结果表明，三种流速均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着流速增加，理论塔板数降低。综合考虑，流速选择0.4mL/min。
2.5.4.5色谱条件和系统适应性试验结果
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速 0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.5.5供试品溶液制备方法考察
2.5.5.1提取溶剂考察
取供试品10份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇、水25mL，回流提取1小时，放冷，以相应溶剂补足减失重量，滤过，取续滤液2μL注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取染料木苷含量。结果见表47。
表47不同提取溶剂的分析结果
结果表明，以70％甲醇、甲醇、乙醇为提取溶媒提取时，样品中染料木苷含量差异不大，暂以甲醇作为含测提取溶剂。
2.5.5.2提取方式考察
取供试品4份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，2份超声提取(功率600W，频率40kHz)、2份回流提取，提取时间均为1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表48。
表48不同提取方式分析结果
结果表明，回流提取所得染料木苷含量较高，故提取方式选择回流提取。
2.5.5.3提取时间考察
取本品10份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，分别回流提取30min、1h、2h、3h、4h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取时间下染料木苷含量，结果见表49。
表49不同提取时间的分析结果
结果表明，样品中染料木苷在2h时可提取完全，故选择提取时间为2h。
2.5.5.4溶剂加入量量考察
取本品6份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇10mL、25mL、50mL，密塞，称定重量，回流提取2h，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表50。
表50不同溶剂加入量量的分析结果
结果表明，供试品溶剂加入量为10mL、25mL、50mL时，样品中染料木苷含量差异不大。综合样品峰面积等，暂定提取溶剂加入量为25mL。
2.5.5.5供试品溶液制备方法确定
取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.5.6方法学考察
2.5.6.1专属性实验
按拟定方法制备供试品溶液对照品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图27。
结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
2.5.6.2精密度考察
取对照品溶液连续进样6次，记录染料木苷的峰面积，计算RSD值，结果见表51。
表51精密度考察结果
结果表明，精密度考察中染料木苷的峰面积RSD值为1.45％，本方法的进样精密度良好。
2.5.6.3线性关系
取染料木苷对照品适量，置于5mL容量瓶内，用甲醇配置成 650.7486μg/mL对照品母液。精密量取上述对照品溶液1.0mL至10mL容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，得65.07486μg/mL溶液。以此类推，分别稀释得到32.53743、16.26872、8.134358、4.067179、2.033589μg/mL。分别取上述溶液 2μL注入液相色谱仪，分析得到峰面积，以进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表52、图28。
表52染料木苷标准曲线分析结果
结果表明：染料木苷标准曲线为Y＝12024.1159X-5303.3682，R2＝0.9999。表明进样浓度在2.033589～65.07486μg/mL范围内，线性关系良好。
2.5.6.4稳定性实验
取同一供试品溶液，分别在0、2h、4h，8h，12h，24h测定染料木苷色谱峰面积，结果见表53。
表53炒鸡内金稳定性实验结果
结果表明，在本实验条件下，染料木苷的峰面积RSD值为0.44％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.5.6.5重复性试验
取同一供试品(批号：CJNJ190308)2g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见表54。
表54重复性实验结果
结果表明，染料木苷的含量RSD值为0.59％，本方法重复性良好。
2.5.6.6中间精密度
2.5.6.6.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取本品(批号：CJNJ190308)，制备供试品溶液，分别在安捷伦1290、Waters、岛津LC-30AD超高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 2.1×100mm)。结果见表55。
表55不同仪器考察结果
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，染料木苷含量的RSD 值为2.23％。
2.5.6.6.2不同人员时间考察
取同一供试品由不同人员(A、B)在不同时间(I、II制备供试品溶液分别在仪器a、b进行分析，计算供试品中染料木苷的含量，结果见表56。
表56不同人员时间考察结果
结果表明，染料木苷的含量测定结果RSD值为1.10％，本方法中间精密度良好。
2.5.6.6.3加样回收率
取已知含量的供试品(染料木苷含量：0.011％)约1g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的染料木苷对照品(纯度：99.9％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表57。计算公式如下：
表57加样回收实验结果
结果表明，回收率结果的RSD值为1.43％，本方法准确度良好。
2.5.6.6.4耐用性考察
采用不同品牌C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18 100×2.1mm，1.8μm、 DIMKAEndenvoril C18 100×2.1mm，1.8μm、Waters ACQUITY UPLC HSS T3100×2.1mm，1.8μm)在同一仪器对同一供试品进行检测，结果见表58。
表58耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱的分析测量结果的RSD值为2.62％，本方法耐用性良好。
2.5.7样品含量测定验证
以15批炒鸡内金为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算染料木苷的含量，结果见表59、图29。
表59 15批炒鸡内金含量测定结果
结果表明，炒鸡内金中染料木苷的平均含量为0.008％，SD为0.002。本品按干燥品计算，含量测定平均值的70％～130％限量为含染料木苷(C21H20O10) 0.006％～0.010％；含量测定均值加减3倍SD的限量范围为含染料木苷 (C21H20O10)0.002％～0.014％。
2.6炒鸡内金标汤
2.6.1供试品溶液的制备
取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.6.2对照品溶液的制备
精密称取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含8μg的溶液。
2.6.3色谱条件
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以0.01％醋酸为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速0.4mL/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.6.4色谱条件选择与系统适用性考察
2.6.4.1检测波长确定
对染料木苷对照品溶液进行全波长光谱采集，通过对光谱图的分析，确定炒鸡内金标汤中染料木苷的含量测定的最佳检查波长为260nm，见图30。
2.6.4.2流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，对流动相分别为：甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸、乙腈-0.01％醋酸，进行考察。结果见图31。
结果表明，流动相为甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸时差异不大。暂选择流动相甲醇-0.01％醋酸溶液为梯度洗脱为洗脱条件。
2.6.4.3柱温考察
在甲醇-0.01％醋酸，检测波长260nm条件下，分别在柱温为35℃、40℃、 45℃柱温下分析，以染料木苷色谱峰的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。结果见图32、表60。
表60不同柱温分析结果
结果表明，三种柱温均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着柱温升高，理论塔板数增加。综合考虑，最终确定柱温为40℃。
2.6.4.4流速考察
在拟定柱温的基础上，考察供试品溶液在流速为0.3mL/min、0.4mL/min、 0.4mL/min下进行分析，以染料木苷分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。见图33、表61。
表61不同流速分析结果
结果表明，三种流速均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着流速增加，理论塔板数降低。综合考虑，流速选择0.4mL/min。
2.6.4.5色谱条件和系统适应性试验结果
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以以0.01％醋酸为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为260nm，流速为0.4mL/min，柱温40℃，理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
2.6.5供试品溶液制备方法考察
2.6.5.1提取溶剂考察
取供试品10份各约0.1g，精密称定，分别加50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇、水10mL，超声提取30min，放冷，以相应溶剂补足减失重量，滤过，取续滤液2μL注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取染料木苷含量。结果见表 62。
表62不同提取溶剂的分析结果
/>
结果表明，50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇作提取溶剂，样品中染料木苷含量差异不大，暂以甲醇作为含测提取溶剂。
2.6.5.2提取方式考察
取供试品4份各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，2份超声提取、2份回流提取，提取时间均为30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表63。
表63不同提取方式分析结果
结果表明，回流提取和超声提取所得染料木苷含量无显著差异，以操作简捷的超声提取为提取方式。
2.6.5.3提取时间考察
取本品6份各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，分别超声提取15min、30min、45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取时间下染料木苷含量，结果见表64。
表64不同提取时间的分析结果
结果表明，提取时间为15min、30min、45min时样品中染料木苷含量差异不大，为保证样品充分提取，选择提取时间为30min。
2.6.5.4溶剂加入量量考察
取本品6份各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇 5mL、10mL、25mL，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表65。
表65不同溶剂加入量量的分析结果
结果表明，供试品溶剂加入量为5mL、10mL、25mL时，样品中染料木苷含量差异不大。暂定提取溶剂加入量为10mL。
2.6.5.5供试品溶液制备方法确定
取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.6.6方法学考察
2.6.6.1专属性实验
按拟定方法制备供试品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图34。
结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
2.6.6.2精密度考察
取对照品溶液连续进样6次，记录染料木苷的峰面积，计算RSD值，结果见表66。
表66精密度考察结果
结果表明，精密度考察中染料木苷的峰面积RSD值为0.59％，本方法的进样精密度良好。
2.6.6.3线性关系
取染料木苷对照品适量，置于5mL容量瓶内，用甲醇配置成 650.7486μg/mL对照品母液。精密量取上述对照品溶液1.0mL至10mL容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，得65.07486μg/mL溶液。以此类推，分别稀释得到 32.53743、16.26872、8.134358、4.067179、2.033589μg/mL。分别取上述溶液 2μL注入液相色谱仪，分析得到峰面积，以进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表67、图35。
表67染料木苷标准曲线分析结果
结果表明：染料木苷标准曲线为Y＝12024.1159X-5303.3682，R2＝0.9999。表明进样浓度在2.033589～65.07486μg/mL范围内，线性关系良好。
2.6.6.4稳定性实验
取同一供试品溶液，分别在0、2h、4h，8h，12h，16h，24h测定染料木苷色谱峰面积，结果见表68。
表68炒鸡内金标汤稳定性实验结果
结果表明，在本实验条件下，染料木苷的峰面积RSD值为1.13％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.6.6.5重复性
取同一供试品0.1g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见表69。
表69重复性实验结果
结果表明，染料木苷的含量RSD值为1.27％，本方法重复性良好。
2.6.6.6中间精密度
2.6.6.6.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取炒鸡内金标汤样品制备供试品溶液，分别在安捷伦1290、Waters、岛津LC-30AD超高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 2.1×100mm)。结果见表70。
表70不同仪器考察结果
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，染料木苷含量的RSD 值为2.42％。
2.6.6.6.2不同人员时间考察
取同一供试品由不同人员(A、B)在不同时间(I、II)制备供试品溶液分别在仪器a、b进行分析，计算供试品中染料木苷的含量，结果见表71。
表71不同人员时间考察结果
结果表明，染料木苷的含量测定结果RSD值为0.53％，本方法中间精密度良好。
2.6.6.7加样回收率
取已知含量的供试品(染料木苷含量：0.124％)约0.05g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的染料木苷对照品(纯度：99.9％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表72。计算公式如下：
表72加样回收实验结果
/>
结果表明，回收率结果的RSD值为1.55％，本方法准确度良好。
2.6.6.8耐用性考察
采用不同品牌C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18 100×2.1mm，1.8μm、 DIMKAEndenvoril C18 100×2.1mm，1.8μm、Waters ACQUITY UPLC HSS T3100×2.1mm，1.8μm)在同一仪器对同一供试品进行检测，结果见表73。
表73耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱测量结果的RSD值为4.47％。
2.6.7样品含量测定验证
以15批炒鸡内金标准汤剂冻干粉为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算染料木苷的含量，结果见表74、图36。
表74 15批炒鸡内金标准汤剂含量测定结果
/>
结果表明，炒鸡内金标准汤剂染料木苷的平均含量为0.104％，SD为 0.024％。本品按干燥品计算，含量测定平均值的70％～130％限量为含染料木苷(C21H20O10)0.073％～0.135％；含量测定均值加减3倍SD的限量范围为含染料木苷(C21H20O10)0.032％～0.176％。
2.7炒鸡内金配方颗粒
2.7.1供试品溶液的制备
取本品粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.7.2对照品溶液的制备
精密称取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含8μg的溶液。
2.7.3色谱条件
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以0.01％醋酸为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速0.4mL/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.7.4色谱条件考察
2.7.4.1检测波长确定
对染料木苷对照品溶液进行全波长光谱采集，通过对光谱图的分析，确定炒鸡内金标准汤剂中染料木苷的含量测定的最佳检查波长为260nm，见图 37。
2.7.4.2流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，对流动相分别为：甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸、乙腈-0.01％醋酸，进行考察。结果见图38。
结果表明，流动相为甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸、甲醇-0.01％甲酸时差异不大。选择流动相甲醇-0.01％醋酸溶液进行梯度洗脱。
2.7.4.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别考察在0.3mL/min、0.4mL/min、 0.5mL/min流速下，以染料木苷色谱峰的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。结果见图39、表75。
表75不同流速分析结果
结果表明，当流速为0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min时，染料木苷分离度和峰形均较好，选择0.4mL/min作为后续考察流速。
2.7.4.4柱温考察
在上述条件下，考察供试品溶液在35℃、40℃、45℃柱温下分析情况，以染料木苷的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。见图40、表 76。
表76柱温考察
结果表明，在各柱温条件下，染料木苷分离度和峰形均较好，选择40℃作为后续考察柱温。
综上所述，炒鸡内金配方颗粒含量测定色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒度为1.6μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。检测波长为260nm，流速0.4mL/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
2.7.5供试品溶液制备方法考察
2.7.5.1提取溶剂考察
取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、70％甲醇、 50％甲醇、乙醇、水各10mL，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。注入色谱仪，分析计算不同提取溶剂染料木苷含量。结果见表77。
表77不同提取溶剂分析结果
结果表明，当以50％甲醇、70％甲醇、甲醇、水为提取溶剂时，染料木苷含量差异不大，综合考虑，以甲醇作为其提取溶剂。
2.7.5.2提取方式考察
取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇10mL，称定重量，分别超声、回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表78。
表78不同提取溶剂的分析结果
结果表明，超声与回流提取染料木苷含量无显著性差异，故选择超声提取为提取方式。
2.7.5.3提取时间考察
取本品细粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，分别超声处理15min、30min、45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。取2μL 注入色谱仪，分析计算不同提取时间染料木苷含量。结果见表79。
表79不同提取时间的分析结果
结果表明，提取时间为30min时，即可充分提取。故选择提取时间为 30min。
2.7.5.4提取溶剂加入量考察
取本品细粉各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇5、10、 25mL，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见表80。
表80溶剂加入量考察
结果表明，加入甲醇5、10、25mL时，染料木苷含量差异不大，拟选定溶剂加入量为10mL。
综上所述，通过对提取方式、提取溶剂、提取时间、取样量的考察，确定炒鸡内金配方颗粒供试品溶液的制备方法为：取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，超声处理(功率600W，频率 40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.7.6方法学考察
2.7.6.1专属性实验
按拟定方法制备供试品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图41。
结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
2.7.6.2精密度考察
取染料木苷对照品溶液连续进样6次，记录的峰面积，计算RSD值，结果见表81。
表81精密度考察结果
/>
结果表明，精密度考察中染料木苷的峰面积RSD值为0.14％，该仪器的精密度良好。
2.7.6.3线性关系
分别精密吸取鸡内金对照品溶液(65.07486μg/mL)各稀释0倍、2倍、4 倍、8倍、16倍、32倍，分别取上述溶液2μL注入液相色谱仪，得到峰面积，以进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表82、图42。
表82染料木苷标准曲线分析结果
结果表明：染料木苷标准曲线为Y＝12024.1159X-5303.3682，R2＝0.9999。表明进样浓度在2.033589～65.07486μg/mL范围内，线性关系良好。
2.7.6.4重复性
取同一供试品6份，分别精密称定0.1g，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的染料木苷含量，结果见表83。
表83重复性实验结果
结果表明，染料木苷含量的RSD值为0.42％，本方法重复性良好
2.7.6.5加样回收率
取已知含量的供试品(染料木苷的含量0.091％)约0.05g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的染料木苷对照品(纯度：99.9％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表84。计算公式如下：
表84加样回收实验结果
结果表明，染料木苷的回收率平均值为98.91％，结果的RSD值为2.45％，本方法准确度良好。
2.7.6.6中间精密度
2.7.6.6.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，精密称取炒鸡内金配方颗粒两份，制备供试品溶液，分别在赛默飞、安捷伦1290、Waters Acquity UPLC H-Class型高效液相色谱仪上进行考察(色谱柱均为Waters Acquity UPLC HSS T3 2.1×100mm，1.8μm)。计算染料木苷含量，所得结果，见表85。
表85不同仪器实验结果
结果表明，不同仪器染料木苷的含量测定结果RSD值为1.30％，本方法不同仪器耐用性良好。
2.7.6.6.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、 T2)分别精密称取炒鸡内金配方颗粒，制备供试品，进行测定。计算所得染料木苷含量结果，见表86。
表86不同人员与时间考察结果
结果表明，染料木苷的含量测定结果RSD值为1.81％，本方法中间精密度良好。
2.7.6.7耐用性考察
2.7.6.7.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18 100×2.1mm，1.8μm、Waters ACQUITY UPLC HSS C18 SB 2.1×100mm，1.8μm、WatersACQUITY UPLC HSS T3 2.1×100mm，1.8μm) 进行考察。结果见表87。
表87耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱染料木苷测量结果的RSD值为4.07％，本方法色谱柱耐用性良好。
2.7.6.7.2稳定性实验
取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h测定染料木苷色谱峰面积，结果见表88。
表88染料木苷稳定性实验结果
结果表明，在本实验条件下，染料木苷含量的RSD值为0.55％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.7.7验证
以炒鸡内金配方颗粒为供试品，按拟定的方法对三批炒鸡内金配方颗粒进行检验，结果见表89。
表89三批炒鸡内金配方颗粒含量检验结果
结论：炒鸡内金配方颗粒剂的含量测定方法能够对炒鸡内金配方颗粒进行有效的检测。三批炒鸡内金成品含量分别为：0.120％、0.156％、0.160％；平均值加减30％的限量为0.102％～0.189％，SD值为0.022，平均值加减3SD 的限量为0.079％～0.211％。故建议炒鸡内金配方颗粒的染料木苷含量测定范围为0.079％～0.211％。修订为0.080％-0.210％。
由以上数据暂将炒鸡内金配方颗粒的染料木苷含量测定范围确定为“本品每1g含染料木苷(C21H20O10)应为0.80mg～2.10mg”。
2.8醋鸡内金饮片
2.8.1供试品溶液的制备
取本品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，回流提取2小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.8.2对照品溶液的制备
精密称取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含8μg的溶液。
2.8.3色谱条件
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速 0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.8.4色谱条件选择与系统适用性考察
2.8.4.1检测波长确定
对染料木苷对照品溶液进行全波长光谱采集，通过对光谱图的分析，确定醋鸡内金标汤中染料木苷的含量测定的最佳检查波长为260nm，见图43。
2.8.4.2流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，对流动相分别为：甲醇-水、甲醇-0.01％醋酸、乙腈-0.01％醋酸，进行考察。结果见图44。
结果表明，流动相为甲醇-水、甲醇-0.01％醋酸、甲醇-0.01％磷酸时差异不大，暂选择流动相为甲醇-0.01％醋酸溶液梯度洗脱为洗脱条件。
2.8.4.3柱温考察
在甲醇-0.01％醋酸，检测波长260nm条件下，分别在柱温为35℃、40℃、 45℃柱温下分析，以染料木苷色谱峰的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。结果见图45、表90。
表90不同柱温分析结果
结果表明，三种柱温均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着柱温升高，理论塔板数增加。综合考虑，最终确定柱温为40℃。
2.8.4.4流速考察
在拟定柱温的基础上，考察供试品溶液在流速为0.3mL/min、0.4mL/min、 0.4mL/min下进行分析，以染料木苷分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。见图46、表91。
表91不同流速分析结果
结果表明，三种流速均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着流速增加，理论塔板数降低。综合考虑，流速选择0.4mL/min。
2.8.4.5色谱条件和系统适应性试验结果
以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒度为 1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
2.8.5供试品溶液制备方法考察
2.8.5.1提取溶剂考察
取供试品10份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇、水25mL，回流提取1小时，放冷，以相应溶剂补足减失重量，滤过，取续滤液2μL注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取染料木苷含量。结果见表92。
表92不同提取溶剂的分析结果
结果表明，以70％甲醇、甲醇、乙醇为提取溶媒提取时，样品中染料木苷含量差异不大，暂以甲醇作为含测提取溶剂。
2.8.5.2提取方式考察
取供试品4份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，2份超声提取(功率600W，频率40kHz)、2份回流提取，提取时间均为1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表93。
表93不同提取方式分析结果
结果表明，回流提取所得染料木苷含量较高，故提取方式选择回流提取。
2.8.5.3提取时间考察
取本品10份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，分别回流提取30min、1h、2h、3h、4h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取时间下染料木苷含量，结果见表94。
表94不同提取时间的分析结果
结果表明，样品中染料木苷在2h时可提取完全，故选择提取时间为2h。
2.8.5.4溶剂加入量量考察
取本品6份各约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇10mL、 25mL、50mL，密塞，称定重量，回流提取2h，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表95。
表95不同溶剂加入量量的分析结果
结果表明，供试品溶剂加入量为10mL、25mL、50mL时，样品中染料木苷含量差异不大。综合样品峰面积等，暂定提取溶剂加入量为25mL。
2.8.5.5供试品溶液制备方法确定
取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.8.6方法学考察
2.8.6.1专属性实验
按拟定方法制备供试品溶液对照品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图47。
结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
2.8.6.2精密度考察
取对照品溶液连续进样6次，记录染料木苷的峰面积，计算RSD值，结果见表96。
表96精密度考察结果
结果表明，精密度考察中染料木苷的峰面积RSD值为1.45％，本方法的进样精密度良好。
2.8.6.3线性关系
取染料木苷对照品适量，置于5mL容量瓶内，用甲醇配置成 650.7486μg/mL对照品母液。精密量取上述对照品溶液1.0mL至10mL容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，得65.07486μg/mL溶液。以此类推，分别稀释得到32.53743、16.26872、8.134358、4.067179、2.033589μg/mL。分别取上述溶液 2μL注入液相色谱仪，分析得到峰面积，以进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表97、图48。
表97染料木苷标准曲线分析结果
结果表明：染料木苷标准曲线为Y＝12024.1159X-5303.3682，R2＝0.9999。表明进样浓度在2.033589～65.07486μg/mL范围内，线性关系良好。
2.8.6.4稳定性实验
取同一供试品溶液，分别在0、2h、4h，8h，12h，24h测定染料木苷色谱峰面积，结果见表98。
表98醋鸡内金稳定性实验结果
结果表明，在本实验条件下，染料木苷的峰面积RSD值为0.44％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.8.6.5重复性试验
取同一供试品2g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见表99。
表99重复性实验结果
结果表明，染料木苷的含量RSD值为1.15％，本方法重复性良好。
2.8.6.6中间精密度
2.8.6.6.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取本品，制备供试品溶液，分别在安捷伦1290、Waters、岛津LC-30AD超高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为Waters ACQUITYUPLC HSS T3 1.8μm 2.1×100mm)。结果见表100。
表100不同仪器考察结果
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，染料木苷含量的RSD 值为1.35％。
2.8.6.6.2不同人员时间考察
取同一供试品，由不同人员(A、B)在不同时间(I、II)制备供试品溶液分别在仪器a、b进行分析，计算供试品中染料木苷的含量，结果见表101。
表101不同人员时间考察结果
结果表明，染料木苷的含量测定结果RSD值为0.91％，本方法中间精密度良好。
2.8.6.6.3加样回收率
取已知含量的供试品(染料木苷含量：0.009％)约1g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的染料木苷对照品(纯度：99.9％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表102。计算公式如下：
表102加样回收实验结果
/>
结果表明，回收率结果的RSD值为0.86％，本方法准确度良好。
2.8.6.6.4耐用性考察
采用不同品牌C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18 100×2.1mm，1.8μm、 WatersACQUITY UPLC HSS C18 SB 100×2.1mm，1.8μm、Waters ACQUITY UPLC HSS T3100×2.1mm，1.8μm)在同一仪器对同一供试品进行检测，结果见表103。
表103耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱的分析测量结果的RSD值为5.53％。
2.8.7样品含量测定验证
以15批醋鸡内金为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算染料木苷的含量，结果见表104、图49。
表104 15批醋鸡内金含量测定结果
/>
结果表明，醋鸡内金中染料木苷的平均含量为0.008％，SD为0.002％。本品按干燥品计算，含量测定平均值的70％～130％限量为含染料木苷 (C21H20O10)0.006％～0.010％；含量测定均值加减3倍SD的限量范围为含染料木苷(C21H20O10)0.002％～0.014％。
2.9醋鸡内金标汤
2.9.1供试品溶液的制备
取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.9.2对照品溶液的制备
精密称取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含8μg的溶液。
2.9.3色谱条件
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速 0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.9.4色谱条件选择与系统适用性考察
2.9.4.1检测波长确定
对染料木苷对照品溶液进行全波长光谱采集，通过对光谱图的分析，确定醋鸡内金标汤中染料木苷的含量测定的最佳检查波长为260nm，见图50。
2.9.4.2流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，对流动相分别为：甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸、乙腈-0.01％醋酸，进行考察。结果见图51。
结果表明，流动相为甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸时差异不大。暂选择流动相甲醇-0.01％醋酸溶液为梯度洗脱为洗脱条件。
2.9.4.3柱温考察
在甲醇-0.01％醋酸，检测波长260nm条件下，分别在柱温为35℃、40℃、 45℃柱温下分析，以染料木苷色谱峰的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。结果见图52、表105。
表105不同柱温分析结果
结果表明，三种柱温均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着柱温升高，理论塔板数增加。综合考虑，最终确定柱温为40℃。
2.9.4.4流速考察
在拟定柱温的基础上，考察供试品溶液在流速为0.3mL/min、0.4mL/min、 0.4mL/min下进行分析，以染料木苷分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。见图53、表106。
表106不同流速分析结果
结果表明，三种流速均能对染料木苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。随着流速增加，理论塔板数降低。综合考虑，流速选择0.4mL/min。
2.9.4.5色谱条件和系统适应性试验结果
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
2.9.5供试品溶液制备方法考察
2.9.5.1提取溶剂考察
取供试品10份各约0.1g，精密称定，分别加50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇、水10mL，超声提取30min，放冷，以相应溶剂补足减失重量，滤过，取续滤液2μL注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取染料木苷含量。结果见表 107。
表107不同提取溶剂的分析结果
结果表明，50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇作提取溶剂，样品中染料木苷含量差异不大，暂以甲醇作为含测提取溶剂。
2.9.5.2提取方式考察
取供试品4份各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，2份超声提取、2份回流提取，提取时间均为30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表108。
表108不同提取方式分析结果
/>
结果表明，回流提取和超声提取所得染料木苷含量无显著差异，以操作简捷的超声提取为提取方式。
2.9.5.3提取时间考察
取本品6份各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，分别超声提取15min、30min、45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取时间下染料木苷含量，结果见表109。
表109不同提取时间的分析结果
结果表明，提取时间为15min、30min、45min时样品中染料木苷含量差异不大，为保证样品充分提取，选择提取时间为30min。
2.9.5.4溶剂加入量量考察
取本品6份各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇 5mL、10mL、25mL，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表110。
表110不同溶剂加入量量的分析结果
结果表明，供试品溶剂加入量为5mL、10mL、25mL时，样品中染料木苷含量差异不大。暂定提取溶剂加入量为10mL。
2.9.5.5供试品溶液制备方法确定
取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.9.6方法学考察
2.9.6.1专属性实验
按拟定方法制备供试品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图54。
结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
2.9.6.2精密度考察
取对照品溶液连续进样6次，记录染料木苷的峰面积，计算RSD值，结果见表111。
表111精密度考察结果
结果表明，精密度考察中染料木苷的峰面积RSD值为0.59％，本方法的进样精密度良好。
2.9.6.3线性关系
取染料木苷对照品适量，置于5mL容量瓶内，用甲醇配置成 650.7486μg/mL对照品母液。精密量取上述对照品溶液1.0mL至10mL容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，得65.07486μg/mL溶液。以此类推，分别稀释得到 32.53743、16.26872、8.134358、4.067179、2.033589μg/mL。分别取上述溶液 2μL注入液相色谱仪，分析得到峰面积，以进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表112、图55。
表112染料木苷标准曲线分析结果
结果表明：染料木苷标准曲线为Y＝12024.1159X-5303.3682，R2＝0.9999。表明进样浓度在2.033589～65.07486μg/mL范围内，线性关系良好。
2.9.6.4稳定性实验
取同一供试品溶液，分别在0、2h、4h，8h，12h，16h，24h测定染料木苷色谱峰面积，结果见表113。
表113醋鸡内金标汤稳定性实验结果
结果表明，在本实验条件下，染料木苷的峰面积RSD值为0.77％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.9.6.5重复性
取同一供试品0.1g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见表114。
表114重复性实验结果
结果表明，染料木苷的含量RSD值为0.57％，本方法重复性良好。
2.9.6.6中间精密度
2.9.6.6.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取鸡内金配方颗粒，制备供试品溶液，分别在安捷伦1290、Waters、岛津LC-30AD超高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 2.1×100mm)。结果见表115。
表115不同仪器考察结果
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，染料木苷含量的RSD 值为2.35％。
2.9.6.6.2不同人员时间考察
取同一供试品由不同人员(A、B)在不同时间(I、II)制备供试品溶液分别在仪器a、b进行分析，计算供试品中染料木苷的含量，结果见表116。
表116不同人员时间考察结果
结果表明，染料木苷的含量测定结果RSD值为0.94％，本方法中间精密度良好。
2.9.6.7加样回收率
取已知含量的供试品(染料木苷含量：0.084％)约0.05g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的染料木苷对照品(纯度：99.9％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表117。计算公式如下：
表117加样回收实验结果
结果表明，回收率结果的RSD值为0.82％，本方法准确度良好。
2.9.6.8耐用性考察
采用不同品牌C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18 100×2.1mm，1.8μm、WatersACQUITY UPLC HSS C18 SB 100×2.1mm，1.8μm、Waters ACQUITY UPLC HSS T3100×2.1mm，1.8μm)在同一仪器对同一供试品进行检测，结果见表118。
表118耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱测量结果的RSD值为4.47％。
2.9.7样品含量测定验证
以15批醋鸡内金标准汤剂冻干粉为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算染料木苷的含量，结果见表119、图56。
表119 15批醋鸡内金标准汤剂含量测定结果
/>
结果表明，醋鸡内金标准汤剂染料木苷的平均含量为0.100％，SD为 0.020％。本品按干燥品计算，含量测定平均值的70％～130％限量为含染料木苷(C21H20O10)0.070％～0.130％；含量测定均值加减3倍SD的限量范围为含染料木苷(C21H20O10)0.040％～0.160％。
2.10醋鸡内金配方颗粒
2.10.1供试品溶液的制备
取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.10.2对照品溶液的制备
精密称取染料木苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含8μg的溶液。
2.10.3色谱条件
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长 100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速 0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.10.4色谱条件考察
2.10.4.1检测波长确定
对染料木苷对照品溶液进行全波长光谱采集，通过对光谱图的分析，确定醋鸡内金标准汤剂中染料木苷的含量测定的最佳检查波长为260nm，见图 57。
2.10.4.2流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，对流动相分别为：甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸、乙腈-0.01％醋酸，进行考察。结果见图58。
结果表明，流动相为甲醇-0.01％醋酸、甲醇-水、甲醇-0.01％磷酸、甲醇 -0.01％甲酸时差异不大。选择流动相甲醇-0.01％醋酸溶液进行梯度洗脱。
2.10.4.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别考察在0.3mL/min、0.4mL/min、 0.5mL/min流速下，以染料木苷色谱峰的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。结果见图59、表120。
表120不同流速分析结果
结果表明，当流速为0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min时，染料木苷分离度和峰形均较好，暂选择0.4mL/min作为后续考察流速。
2.10.4.4柱温考察
在上述条件下，考察供试品溶液在35℃、40℃、45℃柱温下分析情况，以染料木苷的分离度、理论塔板数、拖尾因子等作为评价指标。见图60、表 121。
表121柱温考察
结果表明，在各柱温条件下，染料木苷分离度和峰形均较好，暂选择40℃作为后续考察柱温。
2.10.4.5色谱条件和系统适应性试验结果
综上所述，醋鸡内金配方颗粒含量测定色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒度为 1.8μm)；以甲醇为流动相A，以0.01％醋酸溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱。检测波长260nm，流速0.4ml/min，柱温40℃。理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
2.10.5供试品溶液制备方法考察
2.10.5.1提取溶剂考察
取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、70％甲醇、 50％甲醇、乙醇、水各10mL，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。注入色谱仪，分析计算不同提取溶剂染料木苷含量。结果见表122。
表122不同提取溶剂分析结果
/>
结果表明，当以甲醇、50％甲醇为提取溶剂时，染料木苷含量较高，综合考虑，以甲醇作为其提取溶剂。
2.10.5.2提取方式考察
取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇10mL，称定重量，分别超声、回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。取2μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下染料木苷含量，结果见表123。
表123不同提取溶剂的分析结果
结果表明，超声与回流提取染料木苷含量无显著性差异，故选择超声提取为提取方式。
2.10.5.3提取时间考察
取本品细粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，分别超声处理15min、30min、45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。取2μL 注入色谱仪，分析计算不同提取时间染料木苷含量。结果见表124。
表124不同提取时间的分析结果
结果表明，提取时间为30min时，即可充分提取。故选择提取时间为 30min。
2.10.5.4提取溶剂加入量考察
取本品细粉各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇5、10、 25mL，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见表125。
表125溶剂加入量考察
结果表明，加入甲醇5、10、25mL时，染料木苷含量差异不大，拟选定溶剂加入量为10mL。
综上所述，通过对提取方式、提取溶剂、提取时间、取样量的考察，确定醋鸡内金配方颗粒供试品溶液的制备方法为：取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.10.6方法学考察
2.10.6.1专属性实验
按拟定方法制备供试品溶液及阴性对照溶液，进行检测。结果见图61。
结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
2.10.6.2精密度考察
取染料木苷对照品溶液连续进样6次，记录的峰面积，计算RSD值，结果见表126。
表126精密度考察结果
结果表明，精密度考察中染料木苷的峰面积RSD值为0.14％，该仪器的精密度良好。
2.10.6.3线性关系
分别精密吸取鸡内金对照品溶液(65.07486μg/mL)各稀释0倍、2倍、4 倍、8倍、16倍、32倍，分别取上述溶液2μL注入液相色谱仪，得到峰面积，以进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表127、图62。
表127染料木苷标准曲线分析结果
结果表明：染料木苷标准曲线为Y＝12024.1159X-5303.3682，R2＝0.9999。表明进样浓度在2.033589～65.07486μg/mL范围内，线性关系良好。
2.10.6.4重复性
取同一供试品6份，分别精密称定0.1g，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的染料木苷含量，结果见表128。
表128重复性实验结果
结果表明，染料木苷含量的RSD值为1.83％，本方法重复性良好
2.10.6.5加样回收率
取已知含量的供试品(染料木苷含量0.117％)约0.05g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的染料木苷对照品(纯度：99.9％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表129。计算公式如下：
表129加样回收实验结果
结果表明，染料木苷的回收率平均值为100.51％，结果的RSD值为1.50％，本方法准确度良好。
2.10.6.6中间精密度
2.10.6.6.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，精密称取醋鸡内金配方颗粒两份，制备供试品溶液，分别在赛默飞世尔vanquish、安捷伦1290、Waters Acquity UPLC H-Class型高效液相色谱仪上进行考察(色谱柱均为Waters Acquity UPLC HSS T3 2.1×100mm，1.8μm)。计算染料木苷含量，所得结果，见表130。
表130不同仪器实验结果
结果表明，不同仪器染料木苷的含量测定结果RSD值为1.34％，本方法不同仪器耐用性良好。
2.10.6.6.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、 T2)分别精密称取醋鸡内金配方颗粒，制备供试品，进行测定。计算所得染料木苷含量结果，见表131。
表131不同人员与时间考察结果
结果表明，染料木苷的含量测定结果RSD值为0.87％，本方法中间精密度良好。
2.10.6.7耐用性考察
2.10.6.7.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18 100×2.1mm，1.8μm、Waters ACQUITY UPLC HSSC18 SB 2.1×100mm，1.8μm、WatersACQUITY UPLC HSS T32.1×100mm，1.8μm)时进行考察。结果见表132。
表132耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱染料木苷测量结果的RSD值为4.31％，本方法色谱柱耐用性良好。
2.10.6.7.2稳定性实验
取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h测定染料木苷色谱峰面积，结果见表133。
表133染料木苷稳定性实验结果
结果表明，在本实验条件下，染料木苷含量的RSD值为1.16％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.10.7验证
以醋鸡内金配方颗粒为供试品，按拟定的方法对三批醋鸡内金配方颗粒进行检验，结果见表134。
表134三批醋鸡内金配方颗粒含量检验结果
结论：醋鸡内金配方颗粒剂的含量测定方法能够对醋鸡内金配方颗粒进行有效的检测。三批醋鸡内金成品含量分别为：0.148％、0.156％、0.150％；平均值加减30％的限量为0.106％～0.196％，SD值为0.003，平均值加减3SD 的限量为0.142％～0.160％。故建议醋鸡内金配方颗粒的染料木苷含量测定范围为0.106％～0.196％。修订为0.110％～0.200％。
由以上数据暂将醋鸡内金配方颗粒的染料木苷含量测定范围确定为“本品每1g含染料木苷(C21H20O10)应为1.10mg～2.00mg”。
综上，相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明建立了鸡内金及其炮制品、提取物及制剂的含量测定方法，确立了1个新的指标成分，可以从整体上、宏观上控制鸡内金及其相关制剂的内在质量，保证了药物的疗效，使药材及其相关制剂得到了更为正规的质量控制。且方法稳定性好、精密度高、重现性好、操作便捷且易于掌握；如图63。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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Claims (4)
1.一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒中染料木苷的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用染料木苷作为鸡内金待测样品的指标性成分，进行超高效液相色谱检测，得到染料木苷含量；
所述鸡内金待测样品包括鸡内金药材、鸡内金饮片、鸡内金标汤、鸡内金配方颗粒、炒鸡内金饮片、炒鸡内金标汤、炒鸡内金配方颗粒、醋鸡内金饮片、醋鸡内金标汤和醋鸡内金配方颗粒中的一种或多种；
所述鸡内金待测样品制备供试品溶液的方法具体为：
鸡内金药材和鸡内金饮片：取样品粉末1g~3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml~30ml，称定重量，回流提取2.5h~3.5h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
炒鸡内金饮片和醋鸡内金饮片：取样品粉末1g~3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml~30ml，称定重量，回流提取1.5h~2.5h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
鸡内金标汤、炒鸡内金标汤、醋鸡内金标汤及鸡内金配方颗粒、炒鸡内金配方颗粒、醋鸡内金配方颗粒：取样品粉末0.005g~0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇5ml~15ml，称定重量，功率550W~650W、频率35kHz~45kHz超声处理25min~35min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
所述超高效液相色谱检测的色谱条件包括：
以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.005%~0.02%醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述填充剂的柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm；
所述梯度洗脱的过程具体为：
0~3min，流动相A：10wt%→30wt%，流动相B：90wt%→70wt%；
3min~10min，流动相A：30wt%→32wt%，流动相B：70wt%→68wt%；
10min~12min，流动相A：32wt%，流动相B：68wt%；
12min~12.01min，流动相A：32wt%→95wt%，流动相B：68wt%→5wt%；
12.01min~15min，流动相A：95wt%，流动相B：5wt%；
所述超高效液相色谱检测的检测波长为250nm~270nm，流速为0.3ml/min~0.5ml/min，柱温为39℃~41℃，理论板数按染料木苷峰计算应不低于5000。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述进行超高效液相色谱检测的过程中，制备对照品溶液的方法具体为：
精密称取染料木苷对照品，加甲醇制成每1ml含6μg~10μg的溶液。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的过程具体为：
精密吸取对照品溶液、供试品溶液各1.5μL~2.5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
4.一种鸡内金及其炮制品饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量控制方法，其特征在于，采用权利要求1~3任一项所述的含量测定方法，以染料木苷为指标性成分，实现质量控制。
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| GR01 | Patent grant | ||
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