CN117929555A - 一种蛤蚧提取物及其制剂的hplc特征图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱检测方法，包括：A)将蛤蚧原料采用溶剂提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到蛤蚧原料的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈‑0.05％乙酸为流动相进行梯度洗脱，以尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷为参照物，建立了蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对蛤蚧提取物及其制剂的质量进行控制。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及一种蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱检测方法。
背景技术
蛤蚧为壁虎科动物蛤蚧Gekko gecko Linnaeus的干燥体。收载于《中国药典》2020年版一部，具有补肺益肾，纳气定喘，助阳益精的功效。用于肺肾不足，虚喘气促，劳嗽咳血，阳痿，遗精。蛤蚧提取物是由蛤蚧饮片加水煎煮后制得，目前，还未有全面反映和控制蛤蚧提取物的检测方法
因此，建立统一蛤蚧提取物及其制剂特征图谱测定方法，有利于整体评价蛤蚧相关工艺过程的科学性、合理性，更能整体控制蛤蚧提取物及其制剂的内在质量，确保蛤蚧配方颗粒的临床疗效。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱检测方法，本发明构建的蛤蚧提取物的HPLC特征图谱方法稳定，可靠，可以对蛤蚧提取物的质量进行控制。
本技术建立了一种蛤蚧提取物及其制剂的特征图谱鉴别方法，指认出尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷6个特征峰。方法稳定性高，重复性良好，能有效全面反映了蛤蚧提取物及其制剂的状况，为其后续质量标准的制定提供了依据。
《中国药典》2020年版蛤蚧项下规定为壁虎科动物蛤蚧Gekko gecko Linnaeus的干燥体。全年均可捕捉，除去内脏，拭净，用竹片撑开，使全体扁平顺直，低温干燥。在1989年，我国就将蛤蚧列为国家二级保护动物并制定了相关保护措施。目前，药材资源主要来源于国外进口。
本发明提供了一种蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱检测方法，包括：
A)将蛤蚧原料采用溶剂提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到蛤蚧原料的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸水溶液，梯度洗脱。
本发明提供的一种蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱检测方法首先取蛤蚧原料，溶剂提取，得到待测液。所述溶剂优选为10％甲醇。
本发明采用上述提取溶剂色谱峰信息量大，效果好。
本发明所述蛤蚧原料包括蛤蚧提取物或制剂。本发明对其不进行限定，上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性检测。
按照本发明，所述蛤蚧饮片的制备优选为：取蛤蚧药材，除去鳞片及头足，切成小块。
本发明所述蛤蚧提取物优选的制备方法为：
取蛤蚧饮片100g，加水煎煮两次，一煎加10倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮60分钟，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加8倍水，煮沸，保持微沸煎煮40分钟，200目筛网过滤，合并水煎液，立即冷却至室温，浓缩，冷冻干燥，分装，即得。
按照本发明，所述蛤蚧原料的质量g和10％甲醇mL的比为0.5:(10～50)；所述超声功率为600W，频率40kHz。
一些实施例中，所述蛤蚧原料的质量g和10％甲醇mL的比为0.5:25。
在溶剂加入量为25ml时，特征图谱色谱峰面积适中。
本发明超声提取时间为20～40min；优选为30min，在不同提取时间条件下，色谱图效果基本一致。为保障提取充分，提取时间为30min时，色谱图峰形与分离度较好。
上述提取溶剂为10％甲醇。
本发明提取溶剂为10％甲醇时，各特征峰峰形好，分离度适中。
本发明的方法还包括制备对照品参照物溶液的制备和对照药材溶液的制备。
对照品参照物溶液的制备：分别取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷，采用10％甲醇溶解，得到参照物溶液；所述参照物溶液中尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷的浓度均为40μg/mL。上述溶剂为10％的甲醇。10％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量大且各色谱峰分离效果好。
将所述对照品参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对蛤蚧的HPLC特征图谱的成分进行定性测定。
本发明所述流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸水溶液溶液，梯度洗脱。
本发明所述梯度洗脱优选具体为：
0～18min，A相：0％、B相：100％；
18～19min，A相：0％～0.5％、B相：100％～99.5％；
19～24min，A相：0.5％、B相：99.5％；
24～27min，A相：0.5％～3.5％、B相：99.5％～96.5％；
27～50min，A相：3.5％、B相：96.5％。
本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。
C18色谱柱，规格为柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。本发明人发现，C18上述规格的色谱柱都能满足本发明的检测要求。
色谱柱温度20～30℃，优选为25℃。
本发明在柱温为25℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，保留时间较适宜。
本发明流动相流速优选为0.6～0.8ml/min，优选为0.7ml/min。
本发明发现流速0.7ml/min下各色谱峰分离度较好，峰形较好，峰型对称且保留时间合适，作为最优选方案。
本发明检测波长优选为250nm。
本发明人发现，在250nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，色谱峰信息量较大，各峰分离度较好，基线平稳。
本发明进样量为10μL。
本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以指纹图谱控制蛤蚧提取物及其制剂的物质群，以尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对指纹图谱进行定位；能够大大降低检测的成本，实现定性检测。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的蛤蚧的HPLC标准特征图谱，其中峰1：尿嘧啶；峰3：鸟嘌呤；峰5(S)：次黄嘌呤；峰6：黄嘌呤；峰7肌苷；峰8鸟苷。
在所述蛤蚧提取物及其制剂标准特征图谱中，以次黄嘌呤为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：规定值为0.55(峰1)、0.61(峰2)、0.82(峰3)、0.88(峰4)、1.23(峰6)、1.99(峰7)、2.07(峰8)。
在所述蛤蚧提取物及其制剂标准特征图谱中，根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择8个重复性较好的峰作为特征峰。规定为：供试品色谱中应呈现8个特征峰，应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰5应与对照品参照物峰保留时间相对应，与次黄嘌呤对照品参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.55(峰1)、0.61(峰2)、0.81(峰3)、0.89(峰4)、1.23(峰6)、1.97(峰7)、2.06(峰8)。
采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次蛤蚧的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
本发明建立的蛤蚧提取物及其制剂的特征图谱以尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷，为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。
本发明新建的特征图谱方法，可以检测蛤蚧提取物及其制剂的成分。且供试品制备方法简单容易操作，指认特征峰相对较多。可对蛤蚧提取物及其制剂进行准确、可靠的特征图谱检测。对蛤蚧提取物及其制剂的真实性和质量的一致性以及稳定性均可有效地加以检测和控制。为有效控制和较全面评价蛤蚧提取物及其制剂的质量提供依据。确保蛤蚧提取物及其制剂质量的均一、稳定。
本发明适用于蛤蚧提取物及其制剂高效液相特征图谱的检测方法，能整体控制蛤蚧提取物及其制剂中的特征成分，确保蛤蚧提取物及其制剂质量的整体稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。
本发明提供了一种蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱检测方法，包括：A)将蛤蚧原料采用溶剂提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到蛤蚧原料的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸水溶液，梯度洗脱。
本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.05％乙酸为流动相进行梯度洗脱，以尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷为参照物，建立了蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对蛤蚧提取物及其制剂的质量进行控制。
本发明建立高效液相特征图谱方法用于蛤蚧提取物及其相关制剂的检测。
本发明在建立蛤蚧提取物及其制剂的特征图谱过程中，确认了8个共有特征峰，并对其相对保留时间进行了研究，保证了其化学组成稳定性和使用安全性。
本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
本发明具有操作性强、分析便捷、稳定的特点。本发明应用高效液相指纹图谱技术控制蛤蚧提取物及其制剂的质量，使产品质量得到有效控制。本发明能够分析蛤蚧提取物及其制剂的差异与变化，有利于整体评价蛤蚧相关工艺过程的科学性、合理性，更能整体控制蛤蚧提取物及其制剂的内在质量，确保蛤蚧配方颗粒的临床疗效。
附图说明
图1为实施例1提取溶剂考察结果图；
图2为本发明实施例1提取方式考察结果图；
图3为本发明实施例1提取时间考察结果图；
图4为本发明实施例1溶剂加入量考察结果图；
图5为色谱峰指认结果图；
图6为尿嘧啶对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图7为鸟嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图8为次黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图9为黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图10为肌苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图11为鸟苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图12为蛤蚧提取物特征叠加图；
图13蛤蚧提取物对照特征图谱；
图14为尿嘧啶紫外吸收光谱图；
图15为鸟嘌呤紫外吸收光谱图；
图16为次黄嘌呤紫外吸收光谱图；
图17为黄嘌呤紫外吸收光谱图；
图18为肌苷紫外吸收光谱图；
图19为鸟苷紫外吸收光谱图；
图20为蛤蚧配方颗粒不同波长色谱图；
图21柱温考察色谱图；
图22为流速考察结果图；
图23提取溶剂考察；
图24提取方式考察；
图25提取时间考察；
图26溶剂加入量考察；
图27专属性叠加图；
图28尿嘧啶对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图29鸟嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图30次黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图31黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图32肌苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图33鸟苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图34为3批蛤蚧配方颗粒特征图谱验证图；
图35蛤蚧配方颗粒对照特征图谱；
图36为本专利试验条件的色谱图；
图37为对比例试验条件的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱检测方法进行详细描述。
表1-1蛤蚧药材产地信息汇总表
蛤蚧饮片制备
取蛤蚧药材，除去鳞片及头足，切成小块。将16批蛤蚧药材进行炮制16批蛤蚧饮片，具体对应信息见表1-2。
表1-2 16批蛤蚧炮制对应表
蛤蚧提取物的制备
取蛤蚧饮片100g，加水煎煮两次，一煎加10倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮60分钟，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加8倍水，煮沸，保持微沸煎煮40分钟，200目筛网过滤，合并水煎液，立即冷却至室温，浓缩，冷冻干燥，分装，即得。
由16批蛤蚧饮片制得16批蛤蚧提取物，对应信息见下表。
表1-3蛤蚧提取物制备对应表
实施例1蛤蚧提取物特征图谱方法
1.1材料、仪器和试剂
高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
乙酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
尿嘧啶(中国食品药品检定研究院，批号：100469-201302，含量以99.6％计)，
鸟嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140631-202008，含量以98.9％计)，
次黄嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140661-202005，含量以99.4％计)，
黄嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140662-200802，无含量要求)，
肌苷(中国食品药品检定研究院，批号：140669-202007，含量以99.2％计)，
鸟苷(中国食品药品检定研究院，批号：111977-202202，含量以88.6％计)，
蛤蚧对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121587-201802)，
蛤蚧提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：GJ-BT-220201、GJ-BT-220301、GJ-BT-220302、GJ-BT-220303、GJ-BT-220304、GJ-BT-220305、、GJ-BT-220306、GJ-BT-220307、GJ-BT-220308、GJ-BT-220309、GJ-BT-220310、GJ-BT-220311、GJ-BT-220312、GJ-BT-220313、GJ-BT-220314、GJ-BT-220315、GJ-BT-220316)。
1.2色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
流动相梯度见表1-4。
表1-4拟定的流动相梯度
1.3参照物溶液的制备
参照物溶液的制备：取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
1.4供试品溶液的制备
取本品适量，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.5测定法
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
1.6色谱条件与系统适用性试验
1.6.1提取溶剂考察
取本品(批号：GJ-BT-220201)适量，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、甲醇、10％乙醇各25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图1，图1为实施例1提取溶剂考察结果图。
结果表明，提取溶剂中10％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量较大，峰型较好，故供试品提取溶剂确定为10％甲醇。
1.6.2提取方式考察
取本品(批号：GJ-BT-220201)适量，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，密塞，分别对供试品提取方法为回流、超声(功率600W，频率40kHz)进行考察，提取时间30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图2，图2为本发明实施例1提取方式考察结果图。
结果表明，在超声提取与回流提取时，色谱图效果基本一致。本实验选择超声提取作为供试品提取方法。
1.6.3提取时间考察
取本品(批号：GJ-BT-220201)适量，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，密塞，分别对供试品超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图3，图3为本发明实施例1提取时间考察结果图。
结果表明，在不同提取时间条件下，色谱图效果基本一致。为保障提取充分，供试品提取时间确定为30分钟。
1.6.4溶剂加入量考察
取本品(批号：GJ-BT-220201)适量，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入10％甲醇10ml、25ml、50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图4。图4为本发明实施例1溶剂加入量考察结果图。
结果表明，在溶剂加入量为25ml时，特征图谱色谱峰面积适中。故供试品溶剂加入量确定为25ml。
1.6.5确定供试品制备方法
取本品适量，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇溶液25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.7方法学考察
1.7.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备蛤蚧药材供试品溶液。
参照物溶液的制备：取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
蛤蚧对照药材溶液的制备：取蛤蚧对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺蛤蚧提取物阴性对照溶液。
对蛤蚧提取物特征图谱峰进行指认。见图5-11。其中图5为色谱峰指认结果图，图6为尿嘧啶对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图7为鸟嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图8为次黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图9为黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图10为肌苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图11为鸟苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图。
结果表明，尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品的保留时间和光谱图都能和蛤蚧提取物中目标峰的保留时间和光谱图一一对应，且阴性溶液无干扰，该方法专属性良好。
1.7.2精密度试验
取蛤蚧提取物供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间。见表2。
表2精密度考察-保留时间
结果表明，精密度各特征峰保留时间RSD为0.31％-2.48％。该仪器精密度良好。
1.7.3重复性考察
精密称取蛤蚧提取物(批号：GJ-BT-220301)6份，按拟定实验方法(1.6.5进行制备样品，按照1.2～1.5进行测定)进行制备及测定。见表3。
表3重复性考察-相对保留时间
结果表明，重复性各特征峰相对保留时间一致，相对保留时间RSD为0.00％-2.06％。该方法重复性良好。
4.6稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h时测定。见表4。
表4稳定性考察-保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.36％～1.33％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰保留时间/相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。
1.7.4方法学小结
选择峰5为S峰时，各阶段保留时间或相对保留时间的RSD见表5。
表5峰5为S峰时的RSD值汇总
结果表明，各特征峰的保留时间或相对保留时间的RSD值在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述8个特征峰纳入后续考察。
1.7.5特征峰的确定及对照图谱的建立
用拟定的方法对16批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。见图12，表6。图12为蛤蚧提取物特征叠加图(从下到上批号依次为：GJ-BT-230301、GJ-BT-230302、GJ-BT-230303、GJ-BT-230304、GJ-BT-230305、GJ-BT-230306、GJ-BT-230307、GJ-BT-230308、GJ-BT-230309、GJ-BT-230310、GJ-BT-230311、WFG-BT-210912、GJ-BT-230313、GJ-BT-230314、GJ-BT-230315、GJ-BT-230316)；
表6 16批蛤蚧提取物相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择8个重复性较好的峰作为特征峰。规定为：供试品色谱中应呈现8个特征峰，应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰5应与对照品参照物峰保留时间相对应，与次黄嘌呤对照品参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.55(峰1)、0.61(峰2)、0.81(峰3)、0.89(峰4)、1.23(峰6)、1.97(峰7)、2.06(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批蛤蚧提取物进行合成，建立了蛤蚧提取物特征图谱的对照图谱。见图13。图13蛤蚧提取物对照特征图谱；峰1：尿嘧啶；峰3：鸟嘌呤；峰5(S)：次黄嘌呤；峰6：黄嘌呤；峰7：肌苷；峰8：鸟苷。
实施例2蛤蚧配方颗粒
2.1材料、试剂与仪器
同1.1.材料、试剂与仪器。
蛤蚧配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：C1、C2、C3、C4)。
2.2色谱条件与系统适用性试验
同1.2色谱条件与系统适应性试验。
2.3参照物溶液的制备
同1.3参照物溶液的制备。
2.4波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在210nm、230nm、250nm、270nm、290nm、310nm波长下的色谱图，见图14-20。其中图14为尿嘧啶紫外吸收光谱图；图15为鸟嘌呤紫外吸收光谱图；图16为次黄嘌呤紫外吸收光谱图；图17为黄嘌呤紫外吸收光谱图；图18为肌苷紫外吸收光谱图；图19为鸟苷紫外吸收光谱图；图20为蛤蚧配方颗粒不同波长色谱图。
结果表明，在检测波长为250nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为250nm。
2.5柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃时进行考察。见图21。图21柱温考察色谱图。
柱温考察结果表明，在不同柱温下，柱温为25℃分离度好，色谱图峰形较为对称且保留时间合适，故柱温选用25℃。
2.6流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min时进行了考察。见图22，图22为流速考察结果图。
流速考察结果表明，在不同流速下，流速为0.7ml/min分离度好，色谱图峰形较为对称且保留时间合适，故流速选用0.7ml/min。
综上所述，蛤蚧配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
表1-4
2.7供试品溶液的制备
2.7.1提取溶剂考察
取本品(批号：C1)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、甲醇、10％乙醇各25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图23。图23提取溶剂考察。
结果表明，提取溶剂中10％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量较大，峰型较好，故供试品提取溶剂确定为10％甲醇。
2.7.2提取方法考察
取本品(批号：C1)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，密塞，分别对供试品提取方法为回流、超声(功率600W，频率40kHz)进行考察，提取时间30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图24。图24提取方式考察。
结果表明，在超声提取与回流提取时，色谱图效果基本一致。本实验选择超声提取作为供试品提取方法。
2.7.3提取时间考察
取本品(批号：C1)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，密塞，分别对供试品超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图25。图25提取时间考察。
结果表明，在不同提取时间条件下，色谱图效果基本一致。为保障提取充分，供试品提取时间确定为30分钟。
2.7.4提取溶剂加入量考察
取本品(批号：C1)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入10％甲醇10ml、25ml、50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图26。图26溶剂加入量考察。
结果表明，在溶剂加入量为25ml时，特征图谱色谱峰面积适中。故供试品溶剂加入量确定为25ml。
2.7.5确定供试品制备方法
取本品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇溶液25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.7.6特征图谱方法
照高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
表1-4
参照物溶液的制备取蛤蚧对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.8方法学考察
2.8.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备蛤蚧配方颗粒供试品溶液。
参照物溶液的制备：取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
蛤蚧对照药材溶液的制备：取蛤蚧对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺蛤蚧配方颗粒阴性对照溶液。
对蛤蚧配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图27-33。图27专属性叠加图；
图28尿嘧啶对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图29鸟嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图30次黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图31黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图32肌苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图；图33鸟苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图。
结果表明，尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品的保留时间和光谱图都能和蛤蚧配方颗粒中目标峰的保留时间和光谱图一一对应，且阴性溶液无干扰，该方法专属性良好。
2.8.2精密度试验
取蛤蚧配方颗粒供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间见表7。
表7精密度考察-保留时间
结果表明，精密度各特征峰保留时间RSD值为0.42％～1.69％
2.8.3重复性考察
精密称取蛤蚧配方颗粒6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表8。
表8重复性考察-相对保留时间
结果表明，重复性各特征峰保留时间RSD值为0.00％～1.83％，结果表明，该方法重复性良好。
2.8.4稳定性
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，4h，8h，12h，16h，24h时测定。见表9。
表9稳定性考察-保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD值为0.29％～1.38％，样品溶液在24小时内较稳定。
2.8.5方法学小结
选择峰5为S峰时，各阶段保留时间或相对保留时间的RSD见表10。
表10峰5为S峰时的RSD值汇总
结果表明，各特征峰的保留时间或相对保留时间的RSD值在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述8个特征峰纳入后续考察。
2.9特征峰的确定及对照图谱的建立
2.9.1 3批蛤蚧配方颗粒验证结果
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间。见图34，表11。图34为3批蛤蚧配方颗粒特征图谱验证图。
表113批蛤蚧配方颗粒相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰5作为S峰时，3批次蛤蚧配方颗粒8个特征峰相对保留时间RSD均小于2％。
2.9.2相对保留时间规定值限度的制定
故最终规定：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰5应与对照品参照物峰的保留时间相对应，与次黄嘌呤对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.55(峰1)、0.61(峰2)、0.82(峰3)、0.88(峰4)、1.23(峰6)、1.99(峰7)、2.07(峰8)。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批蛤蚧配方颗粒进行合成，建立了蛤蚧配方颗粒特征图谱的对照图谱，见图35。图35蛤蚧配方颗粒对照特征图谱；峰1：尿嘧啶；峰3：鸟嘌呤；峰5(S)：次黄嘌呤；峰6：黄嘌呤；峰7：肌苷；峰8：鸟苷。
对比例1
1、本专利色谱条件的试验结果
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。
表1-4
供试品溶液的制备取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果如图36所示。图36本专利试验条件的色谱图.
2、对比文件色谱条件的试验结果
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为25℃；检测波长为210nm。
供试品溶液的制备取本品粉末2g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)60分钟，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果如图37所示。图37对比例试验条件的色谱图。
3、结论
从图36、图37对比，可以很明显的看出，与对比方法相比，本专利的色谱图分离度更好，基线更平稳，此外，整体美观度也有巨大的优势，更适合作为蛤蚧提取物的特征图谱。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱检测方法，包括：
A)将蛤蚧原料采用溶剂提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到蛤蚧原料的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸水溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括制备对照品参照物溶液的制备；
对照品参照物溶液的制备：分别取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷，采用10％甲醇溶解，得到参照物溶液；所述参照物溶液中尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷的浓度均为40μg/mL；
将所述对照品参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对蛤蚧的HPLC特征图谱的成分进行定性测定。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～18min，A相：0％、B相：100％；
18～19min，A相：0％～0.5％、B相：100％～99.5％；
19～24min，A相：0.5％、B相：99.5％；
24～27min，A相：0.5％～3.5％、B相：99.5％～96.5％；
27～50min，A相：3.5％、B相：96.5％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为C18色谱柱，规格为柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm，理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000；色谱柱温度为25℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.7mL/min；柱温为25℃，检测波长为250nm；进样量为10μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对蛤蚧提取物及其制剂的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的蛤蚧提取物及其制剂的HPLC标准特征图谱，其中峰1：尿嘧啶；峰3：鸟嘌呤；峰5(S)：次黄嘌呤；峰6：黄嘌呤；峰7肌苷；峰8鸟苷。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述蛤蚧提取物及其制剂标准特征图谱中，以次黄嘌呤为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：规定值为0.55(峰1)、0.61(峰2)、0.82(峰3)、0.88(峰4)、1.23(峰6)、1.99(峰7)、2.07(峰8)；
在所述蛤蚧提取物及其制剂标准特征图谱中，以次黄嘌呤为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.55(峰1)、0.61(峰2)、0.81(峰3)、0.89(峰4)、1.23(峰6)、1.97(峰7)、2.06(峰8)。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)具体为：将蛤蚧原料采用10％甲醇超声处理，放冷，过滤，即得。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛤蚧原料的质量g和10％甲醇mL的比为0.5:(10～50)；所述超声功率为600W，频率40kHz。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛤蚧原料包括蛤蚧提取物或制剂。
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