CN116879456A - 一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法及其应用，方法包括：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到虻虫及其制剂特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C 18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈‑0.05％乙酸为流动相进行梯度洗脱，以次黄嘌呤为参照物，建立了虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒的质量进行控制。

Description

一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法及其应用。
背景技术
虻虫为虻科昆虫黄绿原虻Arylotus bivittateinus Takahasi、华广原虻Tabanussignatipennis Portsch.、指角原虻Tabanus yao Macquart.或三重原虻Tabanustrigeminus Coquillett.的雌性成虫的干燥体。收载于《卫生部药品标准中药材第一册》(1992年版)，具有逐淤、破积、通经的功效。用于癥瘕积聚、少腹蓄血、血滞经闭、扑损瘀血。
有关虻虫的质量检测，目前仅限于形状，还未有全面反映和控制虻虫的检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法及其应用，该方法可用于虻虫药材-饮片-提取物及配方颗粒的质量检测，结果可靠，为虻虫的质量控制提供了新方法。
本发明提供了一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法，包括以下步骤：
A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到虻虫及其制剂特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸溶液，梯度洗脱。
本发明将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液。所述供试品原料为虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒。在本发明中，提取的溶剂为10％甲醇；10％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量较大，峰型较好，分离度好。
在本发明中，10％甲醇，0.05％乙酸溶液均为体积分数。本发明中10％甲醇，0.05％乙酸溶液均为水溶液。
提取的方式为超声提取；超声提取的功率为580～620W，超声提取的频率为35～45kHz；超声提取的时间为20～40min；所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比为(0.5～1)：(20～25)。
具体的，若供试品原料为虻虫药材或饮片，供试品溶液的制备过程具体为：
取本品粉末(过三号筛)适量，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
若供试品原料为虻虫配方颗粒或提取物，供试品溶液的制备过程具体为：
取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
本发明将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到虻虫及其制剂特征图谱；流动相的流速为每分钟0.6～0.8ml；柱温为20～30℃；具体实施例中，流动相的流速为每分钟0.7ml；柱温为25℃；
所述检测波长为240～260nm；在检测波长为250nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，因此，本发明检测波长优选为250nm。
本发明理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
本发明进样量为5～10μL；优选为10μL。
在本发明中，所述梯度洗脱具体为：
0～15min，A相：0％，B相：100％；
15～16min，A相：0～0.5％，B相：100～99.5％；
16～25min，A相：0.5％，B相：99.5％；
25～28min，A相：0.5～3％，B相：99.5～97％；
28～35min，A相：3％，B相：97％。
本发明还包括制备对照品参照物溶液：取尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤，分别采用甲醇溶解，得到参照物溶液；所述参照物溶液的浓度为40μg/mL；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对虻虫及其制剂特征图谱的成分进行定性。
具体的，所述参照物溶液的制备过程为：
取尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
取虻虫对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，称定重量，超声(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以特征图谱控制虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒的物质群，以次黄嘌呤对特征图谱进行定位；能够大大降低检测的成本，实现定性检测。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对虻虫及其制剂的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的虻虫药材HPLC标准特征图谱，其中次黄嘌呤参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.27(峰1)、0.54(峰2)、0.72(峰3)、0.78(峰4)、0.91(峰5)、1.25(峰7)、1.30(峰8)。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对虻虫及其制剂的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的虻虫饮片、提取物HPLC标准特征图谱，其中次黄嘌呤参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.27(峰1)、0.54(峰2)、0.71(峰3)、0.78(峰4)、0.92(峰5)、1.25(峰7)、1.30(峰8)。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对虻虫及其制剂的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的虻虫配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中次黄嘌呤参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.26(峰1)、0.53(峰2)、0.72(峰3)、0.78(峰4)、0.92(峰5)、1.26(峰7)、1.30(峰8)。
质量判断标准：取虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒样品，按上述同法操作，得到虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对虻虫药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。
采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
本发明建立的虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒特征图谱以迷迭香酸为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。
本发明提供了一种虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用上述技术方案所述方法进行检测，分析检测结果。
本发明提供了一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法，包括以下步骤：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到虻虫及其制剂特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.05％乙酸为流动相进行梯度洗脱，以次黄嘌呤为参照物，建立了虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒的质量进行控制。
附图说明
图1为本发明实施例1中虻虫药材提取方法的考察；
图2为本发明实施例1中色谱峰指认；
图3为22批虻虫药材特征图谱；
图4为虻虫药材对照特征图谱，其中，峰2为尿嘧啶，峰3为腺嘌呤，峰4为鸟嘌呤，峰6(S)为次黄嘌呤；
图5为22批虻虫饮片特征图谱；
图6为虻虫饮片对照特征图谱，其中，峰2为尿嘧啶，峰3为腺嘌呤，峰4为鸟嘌呤，峰6(S)为次黄嘌呤；
图7为本发明实施例3中色谱峰指认；
图8为虻虫提取物特征叠加图；
图9为虻虫提取物对照特征图谱，其中，峰2为尿嘧啶，峰3为腺嘌呤，峰4为鸟嘌呤，峰6(S)为次黄嘌呤；
图10为虻虫配方颗粒不同波长色谱图；
图11为虻虫配方颗粒柱温考察；
图12为虻虫配方颗粒流速考察；
图13为虻虫配方颗粒提取溶剂考察；
图14为虻虫配方颗粒提取方式考察；
图15为虻虫配方颗粒提取时间考察；
图16为虻虫配方颗粒溶剂加入量考察；
图17为专属性叠加图；
图18为3批虻虫配方颗粒特征图谱验证图；
图19为虻虫配方颗粒对照特征图谱。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1虻虫药材特征图谱检测
《四川省中药饮片炮制规范》2002年版虻虫项下规定为虻科昆虫黄绿原虻Arylotus bivittateinus Takahasi、华广原虻Tabanus signatipennis Portsch.、指角原虻Tabanus yao Macquart.或三重原虻Tabanus trigeminus Coquillett.的雌性成虫的干燥体。夏、秋二季捕捉，沸水烫死或用线穿起，干燥。主产于陕西、河北、贵州等地。
为保证建立的虻虫质量标准具有可靠性，共收集了22批次分别来自陕西省、河北省、贵州省的虻虫药材，具体的产地信息见表1。
表1虻虫(指角原虻)药材产地信息汇总表
1.1仪器及材料
高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
1.2试剂与试药
乙腈、乙酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯，
尿嘧啶(中国食品药品检定研究院，批号：100469-201302，含量以99.6％计)，
鸟嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140631-202008，含量以98.9％计)，
腺嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：110886-202203，含量以99.8％计)，
次黄嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140661-202005，含量以99.4％计)，
虻虫对照药材(上海鸿永生物科技有限公司，批号：320074-202112)。
22批虻虫药材(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：MC-01～MC-22
1.3特征检测方法
虻虫药材特征图谱方法如下：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
表2梯度洗脱程序
供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)适量，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.4供试品制备提取方法考察
取本品粉末(批号：MC-22)适量，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，当供试品提取方法为回流、超声(功率600W，频率40kHz)时加入10％甲醇25ml进行考察，提取时间30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。当为水提时，加入25ml水，煮沸半小时，过滤，蒸干，加入10％甲醇25ml，超声(功率600W，频率40kHz)30min放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图1。
结果表明，对供试品分别进行超声提取、水提时由上图可知基本没有差别，考虑超声处理方式较为便捷。本实验选择超声的提取方法作为虻虫药材的提取方法。
1.5方法学考察
1.5.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备虻虫提取物供试品溶液。
参照物溶液的制备：取尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
取虻虫对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，称定重量，超声(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺虻虫药材阴性对照溶液。
对虻虫药材特征图谱峰进行指认。见图2。
结果表明，阴性溶液无干扰，该方法专属性良好。
1.5.2精密度试验
取虻虫饮片供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间。见表3。
表3精密度考察-保留时间
结果表明，精密度各特征峰保留时间RSD为0.07％-0.41％。该仪器精密度良好。
1.5.3重复性考察
精密称取虻虫药材(批号：MC-22)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表4。
表4重复性考察-相对保留时间比值
结果表明，重复性各特征峰相对保留RSD为0％-0.57％。该方法重复性良好。
1.5.4稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h时测定。见表5。
表5稳定性考察-保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.16％～0.42％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。
1.5.5特征峰的确定及对照图谱的建立
1.5.5.1相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表6。
表6方法学各项目结果RSD％汇总标准-保留时间-相对保留时间
结果表明，各特征峰相对保留时间均较稳定，峰1至峰8的RSD范围为0.00％-0.57％，将各峰的相对保留时间规定值暂定为±10％。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现8个特征峰，其中与次黄嘌呤对照品参照物峰相应的峰为S峰。
1.5.5.1.2 22批虻虫药材验证结果
采用此方法，在22批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间。见图3(各图谱从下往上代表批次号为S1：MC-01～MC-22，表7。
表7 22批虻虫药材相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择8个重复性较好的峰作为特征峰。规定为：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中与次黄嘌呤对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.27(峰1)、0.54(峰2)、0.72(峰3)、0.78(峰4)、0.91(峰5)、1.25(峰7)、1.30(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对上述样品进行合成，建立了虻虫药材特征图谱的对照特征图谱，见图4。
实施例2虻虫饮片特征图谱检测
2.1实验材料
虻虫饮片(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：MC-230101；MC-230102；MC-230103；MC-230104；MC-230105；MC-230106；MC-230107；MC-230108；MC-230109；MC-230110；MC-230111；MC-23012；MC-23013；MC-23014；MC-23015；MC-23016；MC-230117；MC-230118；MC-230119；MC-230120；MC-230121；MC-230122)。
2.2色谱条件
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按上表2中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟0.7ml；柱温25℃；检测波长为250nm。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备 取虻虫对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)适量，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.3 22批虻虫饮片验证结果
采用此方法，在22批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间。见图5，表8。
表8 22批虻虫饮片相对保留时间
/>
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择8个重复性较好的峰作为特征峰。规定为：供试品色谱中应呈现8个特征峰，应与对照药材色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中与次黄嘌呤对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为0.27(峰1)、0.54(峰2)、0.71(峰3)、0.78(峰4)、0.92(峰5)、1.25(峰7)、1.30(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对22批虻虫饮片进行合成，建立了虻虫饮片特征图谱的对照图谱，见图6。
实施例3虻虫提取物特征图谱检测
3.1实验材料
虻虫提取物提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：MC-BT-230101；MC-BT-230102；MC-BT-230103；MC-BT-230104；MC-BT-230105；MC-BT-230106；MC-BT-230107；MC-BT-230108；MC-BT-230109；MC-BT-230110；MC-BT-230111；MC-BT-230112；MC-BT-230113；MC-BT-230114；MC-BT-230115；MC-BT-230116；MC-BT-230117；MC-BT-230118；MC-BT-230119；MC-BT-230120；MC-BT-230121；MC-BT-230122)。
3.2特征方法
虻虫提取物特征方法如下：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按上表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml；柱温25℃；检测波长为250nm。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
供试品溶液的制备取本品适量，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3方法学考察
3.3.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备虻虫提取物供试品溶液。
参照物溶液的制备：取尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
取虻虫对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，称定重量，超声(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺虻虫提取物阴性对照溶液。
对虻虫提取物特征图谱峰进行指认。见图7。结果表明，阴性溶液无干扰，该方法专属性良好。
3.3.2精密度试验
取虻虫提取物(批号：MC-BT-230101)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间。见表9。
表9精密度考察-保留时间
结果表明，精密度各特征峰保留时间RSD为0.06％-0.58％。该仪器精密度良好。
3.3.3重复性考察
精密称取虻虫提取物(批号：MC-BT-230101)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表10。
表10重复性考察-相对保留时间
结果表明，重复性各特征峰相对保留时间一致，相对保留时间的RSD为0.00％～0.77％。该方法重复性良好。
3.3.4稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h时测定。见表11。
表11稳定性考察-保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.16％～0.36％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。
3.3.5特征峰的确定及对照图谱的建立
3.3.5.1相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表12。
表12方法学各项目结果RSD％汇总标准-保留时间-相对保留时间
/>
结果表明，各特征峰相对保留时间均较稳定，峰1至峰8的RSD范围为0.00％-0.77％，将各峰的相对保留时间规定值暂定为±10％。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现8个特征峰，其中与次黄嘌呤参照物相应的峰为S峰。
3.3.6 22批虻虫提取物验证结果
采用此方法，在22批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间。见图8(从下到上批号依次为：MC-BT-230101；MC-BT-230102；MC-BT-230103；MC-BT-230104；MC-BT-230105；MC-BT-230106；MC-BT-230107；MC-BT-230108；MC-BT-230109；MC-BT-230110；MC-BT-230111；MC-BT-230112；MC-BT-230113；MC-BT-230114；MC-BT-230115；MC-BT-230116；MC-BT-230117；MC-BT-230118；MC-BT-230119；MC-BT-230120；MC-BT-230121；MC-BT-230122)和表13。
表13 22批虻虫提取物相对保留时间
/>
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择8个重复性较好的峰作为特征峰。规定为：供试品色谱中应呈现8个特征峰，应与对照药材色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中与次黄嘌呤参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为0.27(峰1)、0.54(峰2)、0.71(峰3)、0.78(峰4)、0.92(峰5)、1.25(峰7)、1.30(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对22批虻虫提取物进行合成，建立了虻虫提取物特征图谱的对照图谱，见图9。
实施例4虻虫配方颗粒特征图谱检测
4.1实验材料
虻虫配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：S1、S2、S3)。
4.2色谱条件
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按上表2中的规定进行梯度洗脱；检测波长为250nm。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
4.2.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在210nm、230nm、250nm、254nm、270nm、290nm波长下的色谱图，见图10。结果表明，在检测波长为250nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为250nm。
4.2.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃时进行考察，见图11。
柱温考察结果表明，在柱温25℃下，色谱图峰形分离度好且基线平整，故柱温选用25℃。
4.2.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min时进行了考察，见图12。
结果表明，在流速0.7ml/min下，色谱图峰形分离度好且基线平整，保留时间适中。故流速选用0.7ml/min。
综上所述，虻虫配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按上表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
4.3供试品制备考察
4.3.1提取溶剂考察
取本品(批号：S1)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入水、10％甲醇、50％甲醇、甲醇、50％乙醇各25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图13，结果表明，提取溶剂中10％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量较大，峰型较好，分离度好，故供试品提取溶剂确定为10％甲醇。
4.3.2提取方式考察
取本品(批号：S1)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，密塞，分别对供试品提取方法为回流、超声(功率600W，频率40kHz)进行考察，提取时间30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图14，结果表明，在超声提取与回流提取时，色谱图效果基本一致。本实验选择超声提取作为供试品提取方法。
4.3.3提取时间考察
取本品(批号：S1)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图15，结果表明，在不同提取时间条件下，色谱图效果基本一致。为保障提取充分，供试品提取时间确定为30分钟。
4.3.4溶剂加入量考察
取本品(批号：S1)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入10％甲醇10ml、25ml、50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图16，结果表明，在溶剂加入量为25ml时，特征图谱色谱峰面积适中。故供试品溶剂加入量确定为25ml。
4.3.5确定供试品制备方法
取本品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇溶液25ml，密塞，超声(功率600W，频率40kHz)提取30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.3.6特征图谱方法
照高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按上表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
照物溶液的制备取虻虫对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
4.4方法学考察
4.4.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备虻虫配方颗粒供试品溶液。
参照物溶液的制备：取尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
取虻虫对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，称定重量，超声(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺虻虫配方颗粒阴性对照溶液。
对虻虫配方颗粒特征图谱峰进行定位，见图17，结果表明，阴性溶液无干扰，该方法专属性良好。
4.4.2精密度试验
取虻虫配方颗粒供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间。见表14。
表14精密度考察-保留时间
/>
结果表明，精密度各特征峰保留时间RSD值为0.13％～0.55％。该仪器精密度良好。
4.4.3重复性考察
精密称取虻虫配方颗粒6份，按拟定实验方法进行制备及测定，见表15。
表15重复性考察-相对保留时间比值
结果表明，重复性各特征峰相对保留时间RSD值为0.00％～0.52％，结果表明，该方法重复性良好。
4.4.6稳定性
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，12h，16h，24h时测定。见表16。
表16稳定性考察-保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD值为0.15％～0.39％，样品溶液在24小时内较稳定。
4.4.7方法学小结
选择峰6为S峰时，各阶段保留时间或相对保留时间的RSD见表17。
表17峰6为S峰时的RSD值汇总
结果表明，各特征峰的保留时间或相对保留时间的RSD值在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述8个特征峰纳入后续考察。
4.4.8特征峰的确定及对照图谱的建立
4.4.8.1 3批虻虫配方颗粒验证结果
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间。见图18，表18。
表18 3批虻虫配方颗粒相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰6作为S峰时，3批次虻虫配方颗粒8个特征峰相对保留时间RSD均小于2％。
4.4.8.2相对保留时间规定值限度的制定
故最终规定：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰6应与对照品参照物峰的保留时间相对应，与次黄嘌呤对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.26(峰1)、0.53(峰2)、0.72(峰3)、0.78(峰4)、0.92(峰5)、1.26(峰7)、1.30(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批虻虫配方颗粒进行合成，建立了虻虫配方颗粒特征图谱的对照图谱，见图19。
由以上实施例可知，本发明提供了一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法，包括以下步骤：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到虻虫及其制剂特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.05％乙酸为流动相进行梯度洗脱，以次黄嘌呤为参照物，建立了虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对虻虫药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种虻虫及其制剂特征图谱的检测方法，包括以下步骤：
A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到虻虫及其制剂特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括制备对照品参照物溶液：取尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤，分别采用甲醇溶解，得到参照物溶液；所述参照物溶液的浓度为40μg/mL；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对虻虫及其制剂特征图谱的成分进行定性。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～15min，A相：0％，B相：100％；
15～16min，A相：0～0.5％，B相：100～99.5％；
16～25min，A相：0.5％，B相：99.5％；
25～28min，A相：0.5～3％，B相：99.5～97％；
28～35min，A相：3％，B相：97％。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相的流速为每分钟0.6～0.8ml；柱温为20～30℃；检测波长为240～260nm；理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于5000。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取的溶剂为10％甲醇；提取的方式为超声提取；
超声提取的功率为580～620W，超声提取的频率为35～45kHz；超声提取的时间为20～40min；
所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比为(0.5～1)：(20～25)。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对虻虫及其制剂的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的虻虫药材HPLC标准特征图谱，其中次黄嘌呤参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.27(峰1)、0.54(峰2)、0.72(峰3)、0.78(峰4)、0.91(峰5)、1.25(峰7)、1.30(峰8)。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对虻虫及其制剂的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的虻虫饮片、提取物HPLC标准特征图谱，其中次黄嘌呤参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.27(峰1)、0.54(峰2)、0.71(峰3)、0.78(峰4)、0.92(峰5)、1.25(峰7)、1.30(峰8)。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对虻虫及其制剂的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的虻虫配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中次黄嘌呤参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.26(峰1)、0.53(峰2)、0.72(峰3)、0.78(峰4)、0.92(峰5)、1.26(峰7)、1.30(峰8)。
9.一种虻虫药材、饮片、提取物及其配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1～8任一项所述的方法进行检测，分析检测结果。
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