CN112946132B - 月季花药材指纹图谱及其构建方法和月季花药材的质量检测方法 - Google Patents
月季花药材指纹图谱及其构建方法和月季花药材的质量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中药检测技术领域，具体提供了月季花药材指纹图谱及其构建方法和月季花药材的质量检测方法，所述月季花药材指纹图谱的构建方法中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为含甲酸的水溶液‑乙腈，梯度洗脱，在本发明的洗脱条件下得到11个共有特征峰，并实现了共有特征峰的有效分离，峰形良好且无干扰，通过比较共有峰可以鉴别月季花药材的真伪以及检测月季花药材的质量；且该方法准确度高、时间短，精密度高、重复性和稳定性好，能够更加全面地对月季花药材进行质量监控。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种月季花药材指纹图谱及其构建方法和月季花药材的质量检测方法。
背景技术
月季花为蔷薇科植物月季Rosa chinensis Jacq.的干燥花。全年均可采收，花微开时采摘，阴干或低温干燥。月季花具有活血调经，疏肝解郁的功效；可用于气滞血瘀，月经不调，痛经，闭经，胸胁胀痛等症状。月季花中含有丰富的化学成分，主要活性成分为黄酮类、酚酸类、挥发油类、鞣质等，还包括蛋白质、糖类以及人体所需的全部必需氨基酸、多种维生素和矿物质等营养成分。现代药理学研究表明，月季花具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节免疫、抑制肿瘤、抗癌、抑制血小板聚集作用、降低血管通透性、利尿作用等多种药理作用，具有广泛的药理活性。
目前在月季花药材的质量控制项目中，2020年版《中国药典》对月季花的质量控制仅包括基原、品种、药材性状、理化鉴别、含量测定等项目，然而这些项目均不能从整体上反映月季花药材的内在质量。
指纹图谱方法是新增的控制中药药材质量的一种方法，目前对月季花进行指纹图谱相关研究较少，其中《香港中药材标准(第七册)》提供了一种月季花指纹图谱的方法，然而该方法得出的共有特征峰个数较少，且各特征峰的分离度不佳，不能全面反映中药内在的化学成分的种类和数量，进而反映月季花药材的质量。
因此，研究一种新的有效、准确、全面地检测月季花药材质量的方法成为了亟待解决的问题。
发明内容
因此，本发明的目的在于解决现有技术中月季花指纹图谱的构建方法得到的指纹图谱的共有峰个数少、分离度不佳的问题，提供了一种月季花药材指纹图谱及其构建方法，利用该指纹图谱可对月季花药材质量进行整体描述和评价，从而保证产品质量可控、稳定。
具体的，本发明公开了一种月季花药材指纹图谱的构建方法，包括以下步骤，
(1)月季花供试品溶液的制备；
(2)取月季花供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含甲酸的水溶液为流动相B，以乙腈为流动相A，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→10分钟，流动相A的体积百分比为15％→17％，流动相B的体积百分比为85％→83％；10→22分钟，流动相A的体积百分比为17％→18％，流动相B的体积百分比为83％→82％；22→35-40分钟，流动相A的体积百分比为18％→30％，流动相B的体积百分比为82％→70％；35-40分钟→40-50分钟，流动相A的体积百分比为30％→100％，流动相B的体积百分比为70％→0％。
所述梯度洗脱程序还包括：40-45→50-55分钟，流动相A的体积百分比为100％，流动相B的体积百分数为0％。
根据本发明任一项所述的构建方法，其中，步骤(1)包括：
1)称取月季花药材，加水提取，得到提取液；
2)将提取液固液分离，取液体干燥，得到提取物；
3)取提取物加入甲醇，提取，固液分离，取液体，即为供试品溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法，满足A-C中任意一项或者多项：
A、步骤1)中，加入10-40倍量水，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为0.5-5h。
优选的，提取时间为30-60min。所述倍量表示每克月季花药材中加入水的毫升数。
优选的，月季花药材经粉粹处理得到粉末，取过四号筛的月季花粉末。
B、步骤2)和3)中，所述固液分离独立地选自离心或者过滤；
C、步骤3)中，加入月季花药材50-200倍量甲醇，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为0.5-5h。加热回流的温度为90-100℃。
优选的，提取时间为30-60min；提取方式为超声提取，所述倍量表示每克月季花药材中加入甲醇的毫升数。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(1)包括：取过四号筛的月季花药材粉末0.5-1g，精密称定，加入水10-20ml，称定重量，加热回流或超声提取30-60分钟，补重，过滤，滤液蒸干，残渣加入甲醇50-100ml，称定重量，超声处理30-60分钟，补重，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(2)包括：检测波长304-379nm，流速为0.8-1.2ml/min，柱温20-40℃，进样量为2-20μl。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(2)中，以安捷伦ZORBAX SB C18或Waters Xselect Hss T3 C18为色谱柱。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(2)中，以含体积百分数为0.1％-0.15％甲酸的水溶液为流动相B，优选的，以含0.1％甲酸的水溶液为流动相B。
对样品进行全波长检测，根据收集的3D图谱，综合考察，发现304-379nm波长，尤其是354nm处的各色谱峰相应比较均衡，图谱信息量较为全面，且共有峰的响应最高。
某些优选的实施方式中，构建方法还包括，采用金丝桃苷、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮苷中的至少一种制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品指纹图谱的步骤。
可以采用金丝桃苷、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮苷的任一种或者多种对照品制备对照品溶液，采用两种或者两种以上对照品时，可以将各对照品混合制备混合液，也可以单独配制对照品溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取金丝桃苷、异槲皮苷对照品，加溶剂制成每1ml含金丝桃苷0.005-0.02mg、异槲皮苷0.005-0.02mg的对照品A溶液，取鞣花酸对照品加溶剂制成每1ml含鞣花酸0.1-0.5mg的对照品B溶液，取槲皮苷对照品加溶剂制成每1ml含槲皮苷0.3-0.8mg的对照品C溶液。
优选的，所述溶剂选自正己烷、甲醇水溶液或者纯甲醇；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不小于60％。
某些优选的实施方式中，还包括月季花药材对照指纹图谱的构建，对多批月季花药材供试样品检测得到的指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成月季花药材对照指纹图谱。
至少采用2批月季花药材得到对照谱图，例如采用3个批次、5个批次、11个批次、15个批次的月季花药材。
某些优选的实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成月季花药材对照指纹图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
本发明还提供了一种月季花药材指纹图谱，由上述任一所述的构建方法得到。
本发明还提供了一种月季花药材对照指纹图谱，其具有11个共有特征峰，各特征峰与4号峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.52(1号峰)、0.90(2号峰)、0.95(3号峰)、1.00(4号峰)、1.05(5号峰)、1.43(6号峰)、1.54(7号峰)、1.82(8号峰)、1.89(9号峰)、2.04(10号峰)、2.21(11号峰)。
本发明还提供了另一种月季花药材对照指纹图谱，其具有11个共有特征峰，各特征峰与4号峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.52(1号峰)、0.90(2号峰)、0.95(3号峰)、1.00(4号峰)、1.05(5号峰)、1.43(6号峰)、1.54(7号峰)、1.82(8号峰)、1.89(9号峰)、2.04(10号峰)、2.21(11号峰)；其中的1-4个峰分别与对照品指纹图谱中的1-4个特征峰的保留时间相同或者其中1-4个峰的保留时间与对照品指纹图谱中的1-4个特征峰的保留时间的RSD<3％、<1％、<0.5％或者<0.1％，所述对照品指纹图谱为本发明所述的对照品指纹图谱。
本发明中，月季花药材对照指纹图谱还可以使用单批次或者多批次月季花药材按照本发明任一所述的构建方法得到的月季花药材HPLC指纹图谱；可选的，月季花药材对照指纹图谱还可以使用多批次月季花药材按照本发明任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成指纹图谱。
可选的，至少采用2批月季花药材得到对照谱图，例如采用3个批次、5个批次、11个批次、15个批次的月季花药材。
优选的，采用月季花道地药材构建对照指纹图谱。
本发明还提供了本发明的月季花药材指纹图谱的构建方法和/或本发明的月季花药材对照指纹图谱在月季花药材产品的质量检测中的用途。
本发明还提供了一种检测月季花药材的质量的方法，包括将待测月季花药材产品的指纹图谱与月季花药材对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测月季花药材产品的指纹图谱为使用待测月季花药材产品按照本发明任一所述的构建方法得到，所述月季花药材对照指纹图谱为本发明所述的月季花药材对照指纹图谱。
待测月季花药材产品的指纹图谱与月季花药材对照指纹图谱的相似度如果不低于0.90-0.95(例如0.90)，则为质量合格；如果低于0.90-0.95(例如0.90)，则为不合格；具体地，所述相似度通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件得到。
本发明中，0.1％甲酸指的是含体积百分数为0.1％的甲酸的水溶液。
本发明还提供了一种月季花药材的鉴别方法，包括将待测样品的指纹图谱与月季花药材对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测样品的指纹图谱为使用待测样品按照本发明任一所述的构建方法得到，所述月季花药材对照指纹图谱为本发明所述的月季花药材对照指纹图谱。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述的月季花药材指纹图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为含甲酸的水溶液-乙腈梯度洗脱，并通过反复试验得到洗脱程序，在本发明的洗脱条件下可以得到11个共有特征峰，并实现了共有特征峰的有效分离，峰形良好且无干扰，通过比较共有峰可以找出不同药材之间的细微差异，克服了由于化学成分复杂造成的干扰以致不能全面、清楚、有效的对月季花药材进行质量检测和鉴别的缺陷，适用于对月季花药材真伪和品质进行检测；且该方法时间短，精密度高、重复性和稳定性好，能够更加全面的对原料药月季花药材进行质量监控。
2.本发明所述的月季花药材指纹图谱的构建方法，月季花药材中主要的活性成分是黄酮类化合物，成分的极性相近，分离难度大，为了尽可能的将这些化合物分开，本发明还通过称取月季花药材，加水提取，然后将提取液固液分离，取液体干燥，然后加入甲醇，提取，固液分离的方法制备供试品溶液，通过该制备方法使得获得的供试品溶液更有利于药物的质量检测，使得检测得到的色谱更精确、稳定、可靠，且该处理方法具有方便，操作简单等优点。
3.本发明所述的月季花药材指纹图谱的构建方法，通过采用金丝桃苷、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮苷中的至少一种制备对照品溶液并构建对照品指纹图谱，可以实现对月季花药材指纹图谱中1-4个共有峰进行定位，使得检测得到的色谱更精确、稳定、可靠，侧面说明采用本发明的色谱条件可以实现月季花药材中四种有效成分，即金丝桃苷、异槲皮苷、鞣花酸和槲皮苷的有效分离，构建的指纹图谱具有高度的可靠性。
4.本发明所述的月季花药材的质量检测方法，通过待测月季花药材产品的指纹图谱与月季花药材对照指纹图谱进行比较，对月季花药材的特征有效成分进行质量检测，使得对所述月季花药材相关制剂的质量检测更全面，保证了所述月季花药材相关制剂质量的有效性和可控性；
此外，通过对金丝桃苷、异槲皮苷、鞣花酸和槲皮苷特征峰进行检测，使得对所述月季花药材相关制剂的质量检测更全面，有利于对有效成分的全面监控，进一步保证了所述月季花药材相关制剂质量的可控性，并通过结合保留时间、相似度评价、聚类分析不同产地月季花药材质量的差异，为月季花药材的质量评价研究提供依据。
4.本发明所述的月季花药材的鉴别方法，通过将待测样品的指纹图谱与月季花药材对照指纹图谱进行比较，可以有效鉴别月季花药材的真伪，例如但不局限于鉴别月季花与玫瑰花。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1中不同提取方式的色谱图；
图2为本发明实验例1中不同提取时间的色谱图；
图3为本发明实验例2中柱温选择的色谱图；
图4为本发明实验例2中流速选择的色谱图；
图5为本发明实验例2中色谱柱选择的色谱图；
图6为本发明实验例3中15批月季花药材11个共有峰的指纹图谱；
图7为本发明实验例3中鞣花酸对照品定位的色谱图；
图8为本发明实验例3中金丝桃苷对照品定位的色谱图；
图9为本发明实验例3中异槲皮苷对照品定位的色谱图；
图10为本发明实验例3中槲皮苷对照品定位的色谱图；
图11为本发明实验例3中15批月季花药材合成的对照指纹图谱；
图12为本发明实验例3中15批月季花药材聚类分析图；
图13为本发明实验例2中梯度条件1的色谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例提供了一种月季花药材指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取金丝桃苷、异槲皮苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.01mg对照品的混合对照品A溶液。取鞣花酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.3mg的对照品B溶液。取槲皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的对照品C溶液。
(2)供试品溶液的制备：取过四号筛的月季花药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷，补重，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，补重，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
(3)分别精密吸取供试品溶液、混合对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以安捷伦ZORBAX SB C18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，以含体积百分数为0.1％甲酸的水溶液为流动相B，按以下比例进行梯度洗脱：0-10分钟，流动相A的体积百分比为15％-17％，流动相B的体积百分比为85％-83％；10-22分钟，流动相A的体积百分比为17％-18％，流动相B的体积百分比为83％-82％；22-35分钟，流动相A的体积百分比为18％-30％，流动相B的体积百分比为82％-70％；35-50分钟，流动相A的体积百分比为30％-100％，流动相B的体积百分比为70％-0％；检测波长354nm，柱温35℃，分别得到月季花药材的指纹图谱和混合对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的指纹图谱。
实施例2
本实施例提供了一种月季花药材的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、鞣花酸对照品和槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml各含0.02mg金丝桃苷、0.005mg异槲皮苷对照品、0.1mg鞣花酸对照品和0.8mg槲皮苷对照品的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：取过四号筛的月季花药材粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，放冷，补重，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，补重，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
(3)分别精密吸取供试品溶液、混合对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液5μl，注入高效液相色谱仪，测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以安捷伦ZORBAX SBC18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸为流动相B，按以下比例进行梯度洗脱：0-10分钟，流动相A的体积百分比为15％-17％，流动相B的体积百分比为85％-83％；10-22分钟，流动相A的体积百分比为17％-18％，流动相B的体积百分比为83％-82％；22-35分钟，流动相A的体积百分比为18％-30％，流动相B的体积百分比为82％-70％；35-50分钟，流动相A的体积百分比为30％-100％，流动相B的体积百分比为70％-0％；检测波长354nm，柱温35℃，分别得到供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱。
(4)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液的指纹图谱、对照品溶液的指纹图谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配。
实施例3
本实施例提供了一种月季花药材的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取过四号筛的月季花药材粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，加热回流或超声提取30分钟，放冷，补重，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，补重，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
(2)分别精密吸取供试品溶液、混合对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以安捷伦ZORBAX SB C18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸为流动相B，按以下比例进行梯度洗脱：0-10分钟，流动相A的体积百分比为15％-17％，流动相B的体积百分比为85％-83％；10-22分钟，流动相A的体积百分比为17％-18％，流动相B的体积百分比为83％-82％；22-35分钟，流动相A的体积百分比为18％-30％，流动相B的体积百分比为82％-70％；35-50分钟，流动相A的体积百分比为30％-100％，流动相B的体积百分比为70％-0％；检测波长354nm，柱温35℃，得到月季花药材的指纹图谱。
实施例4
本实施例提供了一种月季花药材指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.01mg金丝桃苷的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：取过四号筛的月季花药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷，补重，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，补重，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
(3)高效液相色谱法检测：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定。色谱条件如下：以安捷伦ZORBAX SB C18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸为流动相B，按以下比例进行梯度洗脱：0-10分钟，流动相A的体积百分比为15％-17％，流动相B的体积百分比为85％-83％；10-22分钟，流动相A的体积百分比为17％-18％，流动相B的体积百分比为83％-82％；22-35分钟，流动相A的体积百分比为18％-30％，流动相B的体积百分比为82％-70％；35-50分钟，流动相A的体积百分比为30％-100％，流动相B的体积百分比为70％-0％；检测波长354nm，柱温35℃，得到月季花药材的指纹图谱。
实验例1提取工艺的考察
1、材料、试剂与仪器
1.1 仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪；Waters e2695高效液相色谱仪；千分之一天平(梅特勒托利多ME503T/02)；万分之一天平(赛多利斯BSA224S-CW)；十万分之一天平(赛多利斯CPA225D)；数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司KQ-500DE)。
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)
1.2 试剂与试药
乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余为分析纯
金丝桃苷(中国食品药品检定研究院111521-201708，纯度95.1％)；异槲皮苷(中国食品药品检定研究院111809-201804，纯度97.2％)；鞣花酸(中国食品药品检定研究院111959-201501，纯度97.0％)；槲皮苷(中国食品药品检定研究院111959-201501，纯度90.6％)1.3药材
在全国5个月季花产地江苏省常州市、山东省莱阳市、河南省南阳市、云南省昆明市、广东省清远市共收集样品15批次，经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为蔷薇科植物月季R.chinensis Jacq.的干燥花，为药典正品。来源及编号见表1。
表1 月季花药材来源
| 序号 | 药材编号 | 产地 |
| 1 | S1 | 山东省莱阳市 |
| 2 | S2 | 山东省莱阳市 |
| 3 | S3 | 山东省莱阳市 |
| 4 | S4 | 河南省南阳市 |
| 5 | S5 | 河南省南阳市 |
| 6 | S6 | 江苏省常州市 |
| 7 | S7 | 江苏省常州市 |
| 8 | S8 | 江苏省常州市 |
| 9 | S9 | 云南省昆明市 |
| 10 | S10 | 云南省昆明市 |
| 11 | S11 | 云南省昆明市 |
| 12 | S12 | 广东省清远市 |
| 13 | S13 | 广东省清远市 |
| 14 | S14 | 广东省清远市 |
| 15 | S15 | 河南省南阳市 |
2、供试品溶液的制备
2.1 水提取方式的选择
除水提前方式之外，其余条件均与实施例1相同，以提取方式为变量，分别采用加热回流提取和超声提取两种方式按以下方法对月季花药材进行水提取制备供试品溶液：取月季花粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，分别加热回流(温度为100℃)和超声(功率250W，频率40kHZ)处理30分钟，放冷，再称定重量，分别用水补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液蒸干，残渣精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
按照实施例1步骤(3)相同的方法建立色谱图。
不同水提取方式的色谱图如图1所示，对除溶剂峰以外，分离度较佳，峰型较好的10个峰进行比较，结果见表2和表3。
表2 超声提取色谱峰系统适应性参数
表3 加热回流提取色谱峰系统适应性参数
由图1、表2和表3可知，经加热回流提取方式提取得到的色谱峰信息量较大，峰型较好，系统适应性参数相对较优，因此选择加热回流水提取方式进行月季花药材进行提取。
2.2 水提取时间的选择
除了提取时间之外，其余均与实施例3相同，以提取时间为变量，考察水提取时间为30分钟、45分钟、60分钟制备的供试品溶液，即取月季花粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，分别加热回流(温度为100℃)处理30分钟、45分钟、60分钟，放冷，再称定重量，分别用水补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液蒸干，残渣精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
按照实施例1步骤(3)相同的方法建立色谱图。
不同提取时间的色谱图如图2所示，对除溶剂峰以外，分离度较佳，峰型较好的10个峰进行比较，结果见图2、表4、表5和表6。
表4 水提取30分钟色谱峰系统适应性参数
表5 水提取45分钟色谱峰系统适应性参数
表6 水提取60分钟色谱峰系统适应性参数
由图2、表4、表5和表6可知，经加热回流提取30分钟提取效果相对更好，峰型较好，系统适应性参数相对较优，因此选择加热回流提取30分钟进行月季花药材进行提取。
2.3 最终提取方案确定
取月季花粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，加热回流处理30分钟，放冷，再称定重量，分别用水补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液蒸干，残渣精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验例2色谱条件的确定
1、检测波长的选择
实验以检测到的峰数、峰高、峰保留时间为选择原则，采用3D全波长扫描，得到354nm波长下的图谱信息量较为全面，且共有峰的响应最高，因此确定最佳波长为354nm。
2、流动相梯度的选择
除了梯度程序外，其余条件均与实施例1相同，以梯度程序作为变量，采用了多个不同的洗脱梯度(梯度条件1-梯度条件7，见表7-13)对同一份供试品溶液(按照实施例1的方法制备得到)进行测定，结果见表14。
根据结果可知，梯度洗脱程序1各个峰的分离度差，基线不平稳，梯度洗脱程序2和3，各个峰保留时间较集中，分别在17-35分钟和10-20分钟，峰分离度易受影响，稳定性较差；梯度洗脱程序4部分峰(14.8分钟左右和27.8分钟左右出峰)的分离度差；梯度洗脱程序5基线不平稳。
而梯度洗脱程序6和7所得液相色谱图中特征峰的峰形良好且无干扰，基线较平稳，分离度较高，出峰个数更多。
表7 梯度条件1
| 时间(分钟) | A％(乙腈) | B％(0.1％甲酸) |
| 0～20 | 10～21 | 90～79 |
| 20～55 | 21～26 | 79～74 |
| 55～90 | 26～100 | 74～0 |
表8 梯度条件2
表9 梯度条件3
| 时间(分钟) | A％(乙腈) | B％(0.1％甲酸) |
| 0～10 | 15～17 | 85～83 |
| 10～40 | 17～20 | 83～80 |
| 40～50 | 20～25 | 80～75 |
| 50～60 | 25～100 | 75～0 |
| 60～80 | 100 | 0 |
表10 梯度条件4
| 时间(分钟) | A％(乙腈) | B％(0.1％甲酸) |
| 0～10 | 15 | 85 |
| 10～30 | 15～17 | 85～83 |
| 30～50 | 17～30 | 83～70 |
| 50～55 | 30～100 | 70～0 |
| 55～65 | 100 | 0 |
表11 梯度条件5
| 时间(分钟) | A％(乙腈) | B％(0.1％甲酸) |
| 0～10 | 15～17 | 85～83 |
| 10～22 | 17～18 | 83～82 |
| 22～45 | 18～30 | 82～70 |
| 45～50 | 30～100 | 70～0 |
| 50～60 | 100 | 0 |
表12梯度条件6
| 时间(分钟) | A％(乙腈) | B％(0.1％甲酸) |
| 0～10 | 15～17 | 85～83 |
| 10～22 | 17～18 | 83～82 |
| 22～40 | 18～30 | 82～70 |
| 40～45 | 30～100 | 70～0 |
| 45～55 | 100 | 0 |
表13梯度条件7
表14 各梯度色谱峰系统适用性参数
3、柱温的选择
除了柱温外，其余条件均与实施例1相同，以柱温作为变量，取同一份月季花药材样品的供试品溶液，分别以柱温30℃、35℃、40℃的柱温测定，所得色谱图如图3所示。结果表明35℃柱温所获得的色谱效果相对更好，故柱温为35℃最好。
4、流速的选择
除了流速外，其余条件均与实施例1相同，以流速为变量，取同一份月季花药材样品的供试品溶液，分别在每分钟0.6ml、每分钟0.8ml、每分钟1.0ml和每分钟1.2ml的流速下测定，所得色谱图如图4所示。结果显示流速发生变化时对各色谱峰保留时间有一定影响，同时不同流速下对部分色谱峰分离度、对称因子、峰宽、峰高有一定影响，结果表明每分钟0.6ml流速所获得的色谱效果相对更好，故暂定流速0.6mL/min做后续条件筛选考察。
5、色谱柱的选择
除了色谱柱之外，其余条件均与实施例1相同，以色谱柱为变量，取同一份月季花药材样品的供试品溶液，分别以Agilent ZORBAX SB C18(4.6*250mm，5μm)为色谱柱1，Waters Xselect Hss T3 C18(4.6*250mm，5μm)为色谱柱2进行测定，所得色谱图如图5所示。结果显示Agilent ZORBAX SB(4.6*250mm，5μm)色谱柱分离效果相对更好，因此选择Agilent ZORBAX SB C18为本实验色谱柱。
6、最终色谱条件的确定
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-C18，(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm))，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸为流动相B进行梯度洗脱，检测波长354nm，柱温35℃，流速为每分钟0.6mL。
表15 梯度洗脱表
| 时间(分钟) | A％(乙腈) | B％(0.1％甲酸) |
| 0～10 | 15～17 | 85～83 |
| 10～22 | 17～18 | 83～82 |
| 22～35 | 18～30 | 82～70 |
| 35～50 | 30～100 | 70～0 |
实验例3：月季花药材指纹图谱的建立与验证
1、月季花药材指纹图谱方法的建立
供试品溶液的制备：取过四号筛的月季花药材粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，放冷，补重，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，补重，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以安捷伦ZORBAX SB C18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸为流动相B，按以下比例进行梯度洗脱：0-10分钟，流动相A的体积百分比为15％-17％，流动相B的体积百分比为85％-83％；10-22分钟，流动相A的体积百分比为17％-18％，流动相B的体积百分比为83％-82％；22-35分钟，流动相A的体积百分比为18％-30％，流动相B的体积百分比为82％-70％；35-50分钟，流动相A的体积百分比为30％-100％，流动相B的体积百分比为70％-0％；检测波长354nm，柱温35℃，0.6mL/min。
得到月季花药材指纹图谱，根据相对保留时间的稳定性、分离度及峰型良好的原则选择11个特征峰。
该指纹图谱具有11个共有特征峰，各特征峰与4号峰的相对保留时间为：0.52(1号峰)、0.90(2号峰)、0.95(3号峰)、1.00(4号峰)、1.05(5号峰)、1.43(6号峰)、1.54(7号峰)、1.82(8号峰)、1.89(9号峰)、2.04(10号峰)、2.21(11号峰)。这11个特征峰构成了月季花药材的指纹特征，可作为月季花药材的对照指纹图谱。
2、样品测定与共有峰的比对
取金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、鞣花酸对照品和槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml各含0.01mg金丝桃苷、0.01mg异槲皮苷对照品、0.3mg鞣花酸对照品和0.5mg槲皮苷对照品的对照品溶液，采用第1项的方法构建对照品图谱，见图7-10所示，通过与对照品图谱进行比对，对部分共有峰进行了归属研究，其中3号峰为鞣花酸，4号峰为金丝桃苷，5号峰为异槲皮苷，7号峰为槲皮苷。图7、8、9和10分别为鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷对照品定位的色谱图。
以金丝桃苷为参照峰(S峰)，计算11个共有峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围内，规定值为：0.52(峰1)、0.90(峰2)、0.95(峰3)、1.00(S峰金丝桃苷)、1.43(峰6)、1.54(峰7)、1.82(峰8)、1.89(峰9)、2.04(峰10)、2.21(峰11)。15批月季花药材指纹图谱11个共有峰的相对保留时间见表16。
表16 15批月季花药材相对保留时间
3、相似度评价
采用上面第1项的方法建立15批月季花药材样品的指纹图谱，均存在11个特征峰，15批样品根据中位数法生成的指纹图谱如图6所示。
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对15批样品的指纹图谱进行合成，建立中药月季花药材指纹图谱的对照图谱，结果如图11所示。
并运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对15批月季花样品与对照图谱进行相似度评价，计算样品指纹图谱与对照图谱的相似度均在0.958-1.000之间，相似度较集中，表明各批月季花药材差异不大。相似度结果见表17。
表17 15批月季花药材特征峰相似度结果
| 月季花药材编号 | 相似度 |
| S1 | 0.986 |
| S2 | 0.993 |
| S3 | 0.997 |
| S4 | 0.994 |
| S5 | 1.000 |
| S6 | 0.989 |
| S7 | 0.998 |
| S8 | 0.983 |
| S9 | 0.999 |
| S10 | 0.978 |
| S11 | 0.996 |
| S12 | 0.999 |
| S13 | 0.960 |
| S14 | 0.958 |
| S15 | 0.997 |
| 月季花对照药材 | 0.994 |
4、相对峰面积分析
计算15批月季花药材指纹图谱11个共有峰的峰面积与总特征峰的峰面积的相对峰面积，结果见表18。由表中结果可知，11个共有峰相对峰面积中峰1-峰4的RSD％在16.5％-29.2％之间，其余共有峰的相对峰面积RSD％小于15％，表明不同产地的月季花药材部分共有峰的相对峰面积相差较大，不同批药材质量存在差异。
表18 15批月季花药材相对峰面积
5、系统聚类分析
以15批月季花药材的相似度(表17)和相对峰面积(表18)为变量，采用SPSS 21.0统计软件对样品进行系统聚类分析。采用利差平方和法(Ward法)，以欧式距离平方(Squared euclidean distance)作为样品测度，聚类树状图见图12。由系统聚类树状图可以看出，15批月季花样品被分为两大类，编号为S3、S4、S5、S7、S9、S11、S12、S15的样品属于I类，批号为S1、S2、S6、S8、S10、S13、S14的样品属于II类，每类样品中都含不同产地的月季花，表明不同产地月季花内在质量具有差异性，此方法可以用于月季花药材的质量评价及比较。
6、方法学考察
6.1 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，根据确定的色谱条件连续测定6次，记录指纹图谱，以金丝桃苷色谱峰为参照峰，对各主要共有峰与其保留时间比值的RSD％均小于2.0％。表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。精密度试验结果见表19。
表19 精密度考察相对保留时间试验结果
6.2 重复性试验
精密称取同一批月季花药材粉末6份，制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录指纹图谱。以金丝桃苷色谱峰为参照峰，考察各共有峰与其保留时间比值的相对标准偏差(RSD％)。结果RSD值均小于2.0％，表明该方法的重复性良好，符合指纹图谱的要求。重复性试验结果见表20。
表20 方法重复性考察相对保留时间试验结果
6.3 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，18，24h进样测定，记录指纹图谱，以金丝桃苷色谱峰为参照峰，对各主要共有峰与其保留时间比值的RSD％均小于3.0％。表明供试品溶液在24小时内的稳定性良好，符合指纹图谱的要求。稳定性试验结果见表21。
表21 稳定性考察相对保留时间试验结果
实验例4月季花药材指纹图谱在检测月季花药材中的应用
本实施例提供了一种月季花药材指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：取过四号筛的月季花药材粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，加热回流或超声提取30分钟，放冷，补重，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，补重，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以安捷伦ZORBAX SB C18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸为流动相B，按以下比例进行梯度洗脱：0-10分钟，流动相A的体积百分比为15％-17％，流动相B的体积百分比为85％-83％；10-22分钟，流动相A的体积百分比为17％-18％，流动相B的体积百分比为83％-82％；22-35分钟，流动相A的体积百分比为18％-30％，流动相B的体积百分比为82％-70％；35-50分钟，流动相A的体积百分比为30％-100％，流动相B的体积百分比为70％-0％；检测波长354nm，柱温35℃，0.6mL/min。
本实施例提供了一种月季花药材的质量检测方法，其中，测定了随机购买的月季花药材产品，按照上述方法构建待测月季花药材产品的指纹图谱，然后与实验例3构建的对照指纹图谱对比，并运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对待测月季花药材产品与对照指纹图谱进行相似度评价，相似度大于0.95，因此，可以判断此批次月季花药材质量合格。
实验例5月季花药材指纹图谱在鉴别月季花药材中的应用
月季花药材和玫瑰花药材同属蔷薇科蔷薇属植物，两者的形色相似，容易混淆，也常有混杂现象，但两药的性味、功能各不相同，不宜混用。
本实施例提供了一种鉴别月季花药材的方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：取过四号筛的玫瑰花粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，密塞，称定重量，加热回流或超声提取30分钟，放冷，补重，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，补重，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以安捷伦ZORBAX SB C18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸为流动相B，按以下比例进行梯度洗脱：0-10分钟，流动相A的体积百分比为15％-17％，流动相B的体积百分比为85％-83％；10-22分钟，流动相A的体积百分比为17％-18％，流动相B的体积百分比为83％-82％；22-35分钟，流动相A的体积百分比为18％-30％，流动相B的体积百分比为82％-70％；35-50分钟，流动相A的体积百分比为30％-100％，流动相B的体积百分比为70％-0％；检测波长354nm，柱温35℃，0.6mL/min。
测试结果分析，采用上述方法构建指纹图谱并与实验例3构建的对照指纹图谱对比，玫瑰花指纹图谱中仅出现5个特征峰与月季花对照指纹图谱相对应，并运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对玫瑰花样品与对照图谱进行相似度评价，相似度小于0.90，因此，该样品不是月季花药材，该方法可以用此方法可用于区分月季花药材和玫瑰花药材。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种月季花药材指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，
（1）月季花供试品溶液的制备；包括：
1）称取月季花药材，加水提取，得到提取液；
2）将提取液固液分离，取液体干燥，得到提取物；
3）取提取物加入甲醇，提取，固液分离，取液体，即为供试品溶液；
（2）取月季花供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含体积百分数为0.1%-0.15%甲酸的水溶液为流动相B，以乙腈为流动相A，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→10分钟，流动相A的体积百分比为15%→17%，流动相B的体积百分比为85%→83%；10→22分钟，流动相A的体积百分比为17%→18%，流动相B的体积百分比为83%→82%；22→35分钟，流动相A的体积百分比为18%→30%，流动相B的体积百分比为82%→70%；35分钟→50分钟，流动相A的体积百分比为30%→100%，流动相B的体积百分比为70%→0%。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）满足如下A-C中的任意一项或者多项：
A、步骤1）中，加入10-40倍量水，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为0.5-5h；
B、步骤2）和3）中，所述固液分离独立地选自离心或者过滤；
C、步骤3）中，加入月季花药材50-200倍量甲醇，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为0.5-5h。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为304-379nm，流速为0.8-1.2ml/min，柱温20-40℃，进样量为2-20μl。
4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用金丝桃苷、异槲皮苷、鞣花酸、槲皮苷中的至少一种制备对照品溶液的步骤，以及按照1或2所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品指纹图谱的步骤。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取金丝桃苷、异槲皮苷对照品，加溶剂制成每1ml含金丝桃苷0.005-0.02mg、异槲皮苷0.005-0.02mg的对照品A溶液，取鞣花酸对照品加溶剂制成每1ml含鞣花酸0.1-0.5mg的对照品B溶液，取槲皮苷对照品加溶剂制成每1ml含槲皮苷0.3-0.8mg的对照品C溶液。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述溶剂选自正己烷、甲醇水溶液或者纯甲醇；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不小于60%。
7.权利要求1-6中任一项所述的月季花药材指纹图谱的构建方法在月季花药材产品的质量检测和/或鉴别中的用途。
8.一种月季花药材的质量检测方法，其特征在于，包括将待测月季花药材产品的指纹图谱与月季花药材对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测月季花药材产品的指纹图谱为使用待测月季花药材产品按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到，所述月季花药材对照指纹图谱选自如下（1）-（4）中的任意一项：
（1）其具有11个共有特征峰，各特征峰与4号峰的相对保留时间在规定值的±10%、±5%或者±3%的范围之内；1号峰的规定值为0.52、2号峰的规定值为0.90、3号峰的规定值为0.95、4号峰的规定值为1.00、5号峰的规定值为1.05、6号峰的规定值为1.43、7号峰的规定值为1.54、8号峰的规定值为1.82、9号峰的规定值为1.89、10号峰的规定值为2.04、11号峰的规定值为2.21；
（2）其具有11个共有特征峰，各特征峰与4号峰的相对保留时间在规定值的±10%、±5%或者±3%的范围之内；1号峰的规定值为0.52、2号峰的规定值为0.90、3号峰的规定值为0.95、4号峰的规定值为1.00、5号峰的规定值为1.05、6号峰的规定值为1.43、7号峰的规定值为1.54、8号峰的规定值为1.82、9号峰的规定值为1.89、10号峰的规定值为2.04、11号峰的规定值为2.21；而且其中有1-4个特征峰分别与对照品指纹图谱中的1-4个特征峰的保留时间相同或者其中有1-4个特征峰的保留时间与对照品指纹图谱中的1-4个特征峰的保留时间的RSD<3%、<1%、<0.5%或者<0.1%，所述对照品指纹图谱为权利要求4所述的对照品指纹图谱；
（3）使用单批次或者多批次月季花药材按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到的月季花药材指纹图谱；
（4）使用多批次月季花药材按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成对照指纹图谱。
9.一种月季花药材的鉴别方法，其特征在于，包括将待测样品的指纹图谱与月季花药材对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测样品的指纹图谱为使用待测样品按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到，所述月季花药材对照指纹图谱选自如下（1）-（4）中的任意一项：
（1）其具有11个共有特征峰，各特征峰与4号峰的相对保留时间在规定值的±10%、±5%或者±3%的范围之内；1号峰的规定值为0.52、2号峰的规定值为0.90、3号峰的规定值为0.95、4号峰的规定值为1.00、5号峰的规定值为1.05、6号峰的规定值为1.43、7号峰的规定值为1.54、8号峰的规定值为1.82、9号峰的规定值为1.89、10号峰的规定值为2.04、11号峰的规定值为2.21；
（2）其具有11个共有特征峰，各特征峰与4号峰的相对保留时间在规定值的±10%、±5%或者±3%的范围之内；1号峰的规定值为0.52、2号峰的规定值为0.90、3号峰的规定值为0.95、4号峰的规定值为1.00、5号峰的规定值为1.05、6号峰的规定值为1.43、7号峰的规定值为1.54、8号峰的规定值为1.82、9号峰的规定值为1.89、10号峰的规定值为2.04、11号峰的规定值为2.21；而且其中有1-4个特征峰分别与对照品指纹图谱中的1-4个特征峰的保留时间相同或者其中有1-4个特征峰的保留时间与对照品指纹图谱中的1-4个特征峰的保留时间的RSD<3%、<1%、<0.5%或者<0.1%，所述对照品指纹图谱为权利要求4所述的对照品指纹图谱；
（3）使用单批次或者多批次月季花药材按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到的月季花药材指纹图谱；
（4）使用多批次月季花药材按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成对照指纹图谱。
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