CN108828111A - 一种核桃仁中膳食多酚的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核桃仁中膳食多酚的含量测定方法，采用LC‑MS/MS对核桃仁进行检测，建立了同时测定13种膳食多酚的方法。该检测方法主要包括以下步骤：1）对照品溶液的制备；2）供试品溶液的制备；3）采用LC‑MS/MS对待测样品进行含量测定。本发明建立的检测方法具有简便、快速、灵敏度高、专属性强、重复性好等优点，并成功地应用于不同产地核桃仁中膳食多酚的含量测定。本发明不仅完善了核桃仁的质量标准，为核桃仁的营养及保健功能提供理论依据，同时为消费者、营养治疗从业者、研究人员和生产者提供了关键信息，为更好地开发和利用核桃资源提供了研究基础。
Description
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种核桃仁中膳食多酚的含量测定方法。
背景技术
核桃（Juglans regia）是胡桃科、胡桃属的普通核桃。它是一种经济价值很高的木本油料果树。核桃一词始见于《本草纲目》，别名有胡桃见。核桃仁为核桃内果肉，营养丰富，全面而均衡，易被人体消化吸收，是理想的天然食品。
目前，对核桃仁多集中于其营养功能的评价，包括营养成分、药理作用及功能特性的研究。史金凤等（史金凤，林玉萍，陈朝银，和兴萍，赵声兰.核桃仁酚性成分及其生物活性研究进展.中成药，2018，40（6）：1360-1363）报道了核桃仁中的酚性成分及药理作用，核桃仁具有抗癌、抗炎、保肝、抗氧化、抗病毒、抗衰老、降压降糖、健脑等多种生物活性；于沛沛等（于沛沛，于萌萌，姜启兴，夏文水，许学勤.不同产地核桃仁的成分分析及营养评价.安徽农业科学，2015，43（18）：296-299）对不同产地核桃仁的基本成分、氨基酸、脂肪酸组成及主要矿物质含量进行了检测，同时进行了蛋白质的营养评价；徐宏化等（徐宏化，程慧，王正加，付顺华，斯金平，于敏，张爱莲.美国山核桃总多酚与总黄酮含量及其抗氧化活性.核农学报，2016，30（1）：0072-0078）测定了美国山核桃种仁中总多酚和总黄酮的含量，并研究了其抗氧化活性，等等。
现今，随着人类健康理念和生活水平的提高，膳食多酚类化合物越来越受到营养与食品研究者的青睐。膳食多酚，是指人体从膳食中获得的多酚类成分，通常通过食物，如水果、蔬菜、茶、咖啡和葡萄酒等摄入人体。膳食多酚，主要包括酚类单体和聚合多酚，如黄酮、酚酸、可水解单宁和芪类等化合物。膳食多酚具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、降血压、降血脂以及抗癌等作用。大量的资料显示膳食多酚类化合物由于备受关注而大有成为人类“第八大营养素”的趋势，其在人类健康方面具有广阔的前景。
对于核桃仁的主要活性成分--膳食多酚类物质，目前尚没有较为系统、全面的检测方法，中国药典（2015）中也没有规定核桃仁的含量测定标准。因此，有必要提出有效的技术方案，解决上述问题。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种核桃仁中膳食多酚的含量测定方法。该方法可同时检测核桃仁中13种膳食多酚。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种核桃仁中膳食多酚的含量测定方法，检测了核桃仁中的13种膳食多酚，分别为：没食子酸、鞣花酸、儿茶素、新绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、香草醛、原儿茶酸、柚皮素和没食子酸甲酯，所述测定方法包括如下步骤：
（1）配制标准溶液；
（2） 配制供试品溶液：核桃仁样品和50%甲醇于室温下混合超声30min，经0.22μm滤膜过滤，取续滤液，得供试品溶液；
（3）液相色谱分离：将标准溶液打入进样瓶中，再将供试品溶液用液相色谱进行分离；
（4）质谱检测：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测。
优选地，所述液相色谱分离的条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，柱长为100mm，柱径为2.1mm和填料粒径为1.8μm；
流动相A：体积分数为0.2%的乙酸水溶液；
流动相B：乙腈：甲醇，体积比4:1；
柱温：30℃；
流速：0.4mL/min；
进样体积：2μL；
每针运行时间：20min；
梯度洗脱：0-1min：4%B；1-15min：4-35%B；15-18min：35-95%B；18-20min：95%B。
优选地，所述质谱检测的条件为：
检测条件：三重四级杆质谱；
质谱工作模式：负离子扫描的MRM检测模式；
离子源：ESI源；质谱离子源参数为：
| 离子源参数/单位 | 设定值 |
| 气帘气/psi | 10 |
| 离子化电压/V | -4500 |
| 离子源温度/℃ | 550 |
| 喷雾气/psi | 55 |
| 辅助加热气/psi | 55 |
| 接口加热 | On |
| 碰撞气 | Medium |
优选地，所述配制标准溶液为：分别称取没食子酸、鞣花酸、儿茶素、新绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、香草醛、原儿茶酸、柚皮素和没食子酸甲酯标准品适量，分别以二甲基亚砜溶解，均配制成单独的标准储备液；分别精密量取上述标准储备液适量，用50％甲醇稀释制备混合工作溶液；从混合的工作溶液中连续稀释得到浓度为5、10、25、50、100、250、500、1000、2500ng/mL的没食子酸、鞣花酸、儿茶素和新绿原酸，浓度为1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的异槲皮苷、金丝桃苷、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、香草醛、原儿茶酸、柚皮素和没食子酸甲酯的混合标准系列溶液。
优选地，所述配制供试品溶液中核桃仁样品和50%甲醇的料液比为1:200。
本发明所述的利用LC-MS/MS同时测定核桃仁中13种膳食多酚类化合物的含量具有如下积极效果：
（1）本发明首次建立了同时测定核桃仁中13种膳食多酚的液相色谱质谱联用方法，并通过了方法学验证。
（2）本发明首次从膳食多酚的角度佐证了核桃仁的营养及保健功能，并对包括鞣花酸、儿茶素、金丝桃苷等在内的13种膳食多酚进行了含量测定。
（3）本发明建立的核桃仁中13种膳食多酚的含量测定方法，是对核桃仁现有质量标准的补充和提高。中国药典目前尚没有核桃仁的含量测定标准，本方法将为建立核桃仁的含量测定标准提供参考依据。
（4）本发明对核桃仁中具有健康促进作用的膳食多酚类化合物进行了较为系统、全面的表征，有助于开发核桃仁的新的食品应用，同时可以更好地了解这些膳食多酚是如何有助于预防和治疗疾病的。
（5）本发明采用的LC-MS/MS具有简便、快速、灵敏度高、专属性强、重复性好的优点，能够在20分钟内完成13种膳食多酚的检测。在建立标准曲线的基础上，对膳食多酚同时进行含量测定，得到丰富的信息量。
（6）本发明提供的样品前处理方法操作简单。供试品溶液的制备只需以50%甲醇为提取溶剂，料液比为1：200，室温超声30分钟后过滤即可进行分析。此样品前处理过程提取效率高，无需附加的处理，且样品分析干扰少。
具体实施方式
本发明提供一种核桃仁中膳食多酚的含量测定方法，检测了核桃仁中的13种膳食多酚，13种化合物按编号1-编号13依次为没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、对羟基苯甲酸、没食子酸甲酯、儿茶素、香草酸、香草醛、阿魏酸、金丝桃苷、鞣花酸、异槲皮苷和柚皮素。
本发明所述测定方法包括如下步骤：
（1）配制标准溶液：分别称取没食子酸、鞣花酸、儿茶素、新绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、香草醛、原儿茶酸、柚皮素和没食子酸甲酯标准品适量，分别以二甲基亚砜溶解，均配制成单独的标准储备液；分别精密量取上述标准储备液适量，用50％甲醇稀释制备混合工作溶液；从混合的工作溶液中连续稀释得到浓度为5、10、25、50、100、250、500、1000、2500ng/mL的没食子酸、鞣花酸、儿茶素和新绿原酸，浓度为1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的异槲皮苷、金丝桃苷、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、香草醛、原儿茶酸、柚皮素和没食子酸甲酯的混合标准系列溶液；
（2）配制供试品溶液：精密称取核桃仁样品0.1g，置于具塞试管中，精密量取20mL 50%甲醇，称定重量，于室温下在超声波清洗仪中超声30min，放冷，称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，再经0.22μm滤膜过滤，取续滤液，得供试品溶液；
（3）液相色谱分离：将标准溶液打入进样瓶中，再将供试品溶液用液相色谱进行分离；
所述液相色谱分离的条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，柱长为100mm，柱径为2.1mm和填料粒径为1.8μm；
流动相A：体积分数为0.2%的乙酸水溶液；
流动相B：乙腈：甲醇，体积比4:1；
柱温：30℃；
流速：0.4mL/min；
进样体积：2μL；
每针运行时间：20min；
梯度洗脱：0-1min：4%B；1-15min：4-35%B；15-18min：35-95%B；18-20min：95%B；
（4）质谱检测：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测；
所述质谱检测的条件为：
检测条件：三重四级杆质谱；
质谱工作模式：负离子扫描的MRM检测模式；
离子源：ESI源；质谱离子源参数如下表1所示：
表1 质谱离子源参数
| 离子源参数/单位 | 设定值 |
| 气帘气/psi | 10 |
| 离子化电压/V | -4500 |
| 离子源温度/℃ | 550 |
| 喷雾气/psi | 55 |
| 辅助加热气/psi | 55 |
| 接口加热 | On |
| 碰撞气 | Medium |
本发明13种化合物均有较强的负离子信号。核桃仁中13种膳食多酚的质谱参数如下表2所示：
表2核桃仁中13种膳食多酚的质谱参数
| 编号 | 化合物 | 母离子（m/z） | 子离子（m/z） | 去簇电压（V） | 碰撞电压（V） |
| 1 | 没食子酸 | 169.0 | 125.0 | -46 | -19 |
| 2 | 原儿茶酸 | 153.0 | 109.0 | -57 | -20 |
| 3 | 新绿原酸 | 353.0 | 191.0 | -69 | -24 |
| 4 | 对羟基苯甲酸 | 137.0 | 93.0 | -37 | -19 |
| 5 | 没食子酸甲酯 | 183.0 | 124.0 | -63 | -26 |
| 6 | 儿茶素 | 289.1 | 203.2 | -76 | -27 |
| 7 | 香草酸 | 167.0 | 151.9 | -48 | -15 |
| 8 | 香草醛 | 151.0 | 136.0 | -37 | -17 |
| 9 | 阿魏酸 | 193.0 | 134.0 | -58 | -21 |
| 10 | 金丝桃苷 | 463.2 | 299.9 | -117 | -31 |
| 11 | 鞣花酸 | 301.0 | 284.0 | -127 | -40 |
| 12 | 异槲皮苷 | 463.0 | 301.1 | -111 | -33 |
| 13 | 柚皮素 | 270.9 | 151.0 | -84 | -24 |
本申请所用实验药品与试剂厂家信息如下：
表3 试剂和9批药材的相关信息
| 名称 | 级别 | 厂家 |
| 甲醇 | 色谱纯 | Merck |
| 乙腈 | 色谱纯 | Merck |
| 乙酸 | 色谱纯 | Thermo Fisher Scientific |
| 二甲基亚砜（DMSO） | 色谱纯 | Sigma-Aldrich |
| 纯净水 | - | 娃哈哈集团有限公司 |
| 核桃仁1 | - | 新疆A |
| 核桃仁2 | - | 新疆B |
| 核桃仁3 | - | 新疆C |
| 核桃仁4 | - | 云南A |
| 核桃仁5 | - | 云南B |
| 核桃仁6 | - | 山东A |
| 核桃仁7 | - | 山东B |
| 核桃仁8 | - | 河北A |
| 核桃仁9 | - | 陕西A |
表4 核桃仁中13种膳食多酚对应的标准品及相关信息
表5 实验中所用仪器及相关信息
本发明中色谱柱的选择是重要的，Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱是亲水性的超高压色谱柱，在本发明中能在短时间内实现较好的分离，且峰形较好，化合物的响应较强。酚酸和黄酮类化合物极性较大，在一般的C18色谱柱上的分离效果不佳，且峰形较差，而在亲水性的色谱柱上则更好。本实验尝试了Waters ACQUITY UPLC BEH C18、ThermoHypersil Gold aQ色谱柱等，发现峰形较差，有出现峰分叉、响应低的情况，影响测定。优选Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱来进行含量测定。
本发明中流动相和梯度条件的选择是重要的，定量分析时样品中的其他组分可能干扰目标成分的检测，因此需要严格的洗脱条件，以保证在尽可能短的时间内定量分析13种膳食多酚。因此，本发明经优化后确定流动相为0.2%乙酸水溶液（A相）-乙腈：甲醇（4:1，B相），梯度洗脱，运行时间20分钟。
本发明样品前处理方法是重要的，样品前处理是活性成分定量分析的关键环节。本发明分别考察了提取溶剂为25%、50%、75%和100%甲醇，料液比为1：50、1：100、1：200和1：500以及提取时间为5、15、30和60分钟时的待测物的峰面积和，发现提取条件为50%甲醇、料液比1：200以及提取30分钟时的待测物的提取效率最高。
含量测定的方法学验证
线性范围、检测限、定量限
取混合标准系列溶液，按上述样品处理方法处理后进样测定，分别以每种成分的峰面积对其浓度作线性回归，权重因子为1/x2，得到相应的回归方程。13种膳食多酚的回归方程和线性范围如表6所示。
分别量取步骤1中的13种混合标准储备液适量，以50%甲醇（含0.2%乙酸，v/v）溶解并稀释，按上述检测条件进样测定，记录色谱图。以峰响应值为基线噪音的10倍(信噪比的10倍)时的进样浓度为定量限（LOQ）；以峰响应值为基线噪音的3倍(信噪比的3倍)时的进样浓度为检测限（LOD）。结果见表6。
表6 核桃仁13种膳食多酚的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限
| 编号 | 化合物 | 回归方程 | 线性范围(ng/mL) | 相关系数(r) | 检测限(ng/mL) | 定量限(ng/mL) |
| 1 | 没食子酸 | y=9002x+2011 | 5.00-2500.00 | 0.9991 | 1 | 2 |
| 2 | 原儿茶酸 | y=9217x+3835 | 1.00-500.00 | 0.9992 | 0.2 | 0.5 |
| 3 | 新绿原酸 | y=2870x-1503 | 5.00-2500.00 | 0.9995 | 0.2 | 0.5 |
| 4 | 对羟基苯甲酸 | y=15022x+28611 | 1.00-500.00 | 0.9992 | 0.2 | 0.5 |
| 5 | 没食子酸甲酯 | y=34796x+1518 | 1.00-500.00 | 0.9982 | 0.05 | 0.1 |
| 6 | 儿茶素 | y=724x-3 | 5.00-2500.00 | 0.9987 | 0.5 | 1 |
| 7 | 香草酸 | y=2922x+379 | 1.00-500.00 | 0.9990 | 0.2 | 0.5 |
| 8 | 香草醛 | y=26660x+153922 | 1.00-500.00 | 0.9990 | 0.001 | 0.002 |
| 9 | 阿魏酸 | y=8385x+512 | 1.00-500.00 | 0.9995 | 0.2 | 0.5 |
| 10 | 金丝桃苷 | y=5270x-366 | 1.00-500.00 | 0.9983 | 0.2 | 0.5 |
| 11 | 鞣花酸 | y=438x+724 | 5.00-2500.00 | 0.9990 | 1 | 2 |
| 12 | 异槲皮苷 | y=4315x-296 | 1.00-500.00 | 0.9986 | 0.1 | 0.2 |
| 13 | 柚皮素 | y=21191x+3793 | 1.00-500.00 | 0.9990 | 0.05 | 0.1 |
精密度
取同一份混合对照品溶液，按上述色谱条件，同一天内连续测定6次计算日内精密度；分别连续三天进样测定日间精密度。结果见表7。
准确度
取同一批供试品约0.1g，精密称定，共9份，按重复性结果计算出来的13种膳食多酚的含量分别加入三个低、中、高3个水平（80%、100%、120%）的对照品量，按上述样品处理方法处理并平行测定3次。结果见表7。
重复性
取同一批次样品约0.1g，精密称定，按前述方法制备供试品溶液并平行测定6份。结果见表7。
稳定性
取核桃仁样品按前述方法制成供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h测定各成分含量。结果见表7。
表7 核桃仁13种膳食多酚的精密度、重复性、稳定性和加样回收率结果
含量测定结果
对9批不同来源的核桃仁进行样品分析：按前述的样品处理方法制备供试品溶液，按照经过验证的方法进行含量测定，测定结果如表8所示。
表8 核桃仁13种膳食多酚的含量测定结果表 (含量单位为μg/g )
| 化合物 | 样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | 样品5 | 样品6 | 样品7 | 样品8 | 样品9 |
| 没食子酸 | 41.95 | 41.37 | 87.28 | 14.63 | 33.75 | 24.43 | 71.83 | 54.78 | 107.87 |
| 原儿茶酸 | 2.99 | 0.75 | 1.86 | 0.87 | 1.34 | 1.05 | 0.94 | 0.88 | 1.48 |
| 新绿原酸 | 1.20 | 3.09 | <LOQ | 14.76 | 15.94 | 1.43 | 1.78 | 1.34 | 7.37 |
| 对羟基苯甲酸 | 1.11 | 1.48 | 4.12 | 2.44 | 1.40 | 3.14 | 2.47 | 2.64 | 4.14 |
| 没食子酸甲酯 | 64.13 | 203.51 | 113.58 | 36.48 | 36.31 | 38.28 | 186.28 | 69.50 | 263.84 |
| 儿茶素 | 2.39 | 12.21 | 7.48 | 6.92 | 6.28 | 27.55 | 21.39 | 66.75 | 57.34 |
| 香草酸 | 0.95 | 2.08 | 3.10 | 3.01 | 2.90 | 1.44 | 1.15 | 1.09 | 3.38 |
| 香草醛 | 0.20 | 0.37 | 0.58 | 0.78 | 0.58 | <LOQ | 0.61 | 0.30 | 0.50 |
| 阿魏酸 | 0.90 | 2.04 | 2.38 | 2.11 | 3.34 | 0.65 | 2.55 | 1.86 | 2.10 |
| 金丝桃苷 | 0.23 | 0.33 | <LOQ | 0.24 | 0.23 | 0.59 | 0.64 | 1.77 | 7.06 |
| 鞣花酸 | 689.32 | 500.72 | 674.17 | 182.93 | 272.92 | 220.63 | 565.98 | 355.41 | 376.15 |
| 异槲皮苷 | 0.85 | <LOQ | 0.77 | 0.60 | 0.36 | 1.97 | 2.58 | 1.20 | 6.35 |
| 柚皮素 | 1.46 | 0.87 | 1.08 | 0.07 | <LOQ | 1.14 | 1.47 | 0.86 | 1.81 |
| 总含量 | 807.68 | 768.82 | 896.40 | 265.84 | 375.35 | 322.30 | 859.67 | 558.38 | 839.39 |
上表中检测的13种膳食多酚，具有丰富多样的生物活性和营养价值。如，鞣花酸具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化和治疗糖尿病等多种生物活性，是石榴、草莓、葡萄、覆盆子等的主要生物活性成分和质量控制标准。鞣花酸在被检测的9批核桃仁中含量均为最高的，含量范围为0.18-0.69mg/g；鞣花酸在不同来源的核桃仁中含量差异显著，以样品1与样品4比较，前者是后者的大约4倍。儿茶素，是茶叶、儿茶等中药材以及榛子等坚果中的主要活性成分；具有抗氧化、抗癌、抗菌以及防治心血管疾病、预防肥胖等多种作用；本发明中发现儿茶素在9批被测核桃仁中含量介于2.39-66.75μg/g，相差28倍，含量差别非常显著。其他膳食多酚类化合物也表现出潜在的健康促进作用，如没食子酸具有抗菌、抗病毒的活性，阿魏酸具有抗炎、抗肿瘤以及对阿尔茨海默病的化学预防作用，金丝桃苷具有解痉、利尿、止咳、降压等活性。在被测的9批核桃仁中，13种膳食多酚的总量介于0.27-0.90mg/g。以上结果表明，作为核桃仁中的生物活性物质，鞣花酸、儿茶素等膳食多酚的含量，在不同来源的核桃仁中差别显著，因此建议在制定核桃仁的质量标准时增加膳食多酚的含量测定标准，从而更加全面、科学地控制核桃仁质量。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。
Claims (4)
1.一种核桃仁中膳食多酚的含量测定方法，检测了核桃仁中的13种膳食多酚，分别为：没食子酸、鞣花酸、儿茶素、新绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、香草醛、原儿茶酸、柚皮素和没食子酸甲酯，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：
（1）配制标准溶液；
（2） 配制供试品溶液：核桃仁样品和50%甲醇于室温下混合超声30min，经0.22μm滤膜过滤，取续滤液，得供试品溶液；
（3）液相色谱分离：将标准溶液打入进样瓶中，再将供试品溶液用液相色谱进行分离；
（4）质谱检测：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述液相色谱分离的条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，柱长为100mm，柱径为2.1mm和填料粒径为1.8μm；
流动相A：体积分数为0.2%的乙酸水溶液；
流动相B：乙腈：甲醇，体积比4:1；
柱温：30℃；
流速：0.4mL/min；
进样体积：2μL；
每针运行时间：20min；
梯度洗脱：0-1min：4%B；1-15min：4-35%B；15-18min：35-95%B；18-20min：95%B。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述质谱检测的条件为：
检测条件：三重四级杆质谱；
质谱工作模式：负离子扫描的MRM检测模式；
离子源：ESI源；质谱离子源参数为：
如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述配制标准溶液为：分别称取没食子酸、鞣花酸、儿茶素、新绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、香草醛、原儿茶酸、柚皮素和没食子酸甲酯标准品适量，分别以二甲基亚砜溶解，均配制成单独的标准储备液；分别精密量取上述标准储备液适量，用50％甲醇稀释制备混合工作溶液；从混合的工作溶液中连续稀释得到浓度为5、10、25、50、100、250、500、1000、2500ng/mL的没食子酸、鞣花酸、儿茶素和新绿原酸，浓度为1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的异槲皮苷、金丝桃苷、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、香草醛、原儿茶酸、柚皮素和没食子酸甲酯的混合标准系列溶液。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述配制供试品溶液中核桃仁样品和50%甲醇的料液比为1:200。
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