CN109917055B - 一种王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量检测及鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒质量检测及鉴别方法。本发明的王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量检测方法，建立了王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC指纹图谱，明确了王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的化学成分差异，阐明了炮制对王不留行化学成分的影响，且本法相较于已有报道的单一成分的HPLC法，稳定性更好，准确度更高。为王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒鉴别提供了新方法。

Description

一种王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量 检测及鉴别方法

技术领域

本发明具体涉及一种王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量检测及鉴别方法。

背景技术

王不留行为石竹科植物麦蓝菜Vaccarria seetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟种子。夏季果实成热、果皮尚未开裂时采割植株，晒干，打下种子，除去杂质，再晒干用，为临床常用中药。有活血通经，下乳消肿，利尿通淋之功，可治经闭，痛经，乳汁不下，乳痈肿痛，淋症涩痛等病症，且疗效显著。王不留行中主要含有三萜皂苷、环肽、黄酮、生物碱、酚酸、类固醇和挥发油等成分。临床研究表明，王不留行能治疗乳汁分泌不足，慢性前列腺炎，乳腺增生症，急性腰扭伤，突发性耳聋，外用治疗带状疱症，桡骨茎突下载性腱鞘炎等症。

炒王不留行为王不留行的主要炮制加工品，相对于其生品，有效成分更易煎出，走散力更强，长于活血通经、下乳和通淋。由于王不留行和小巢菜及同属植物的干燥种子外观性状相似，炒后更难单纯从外形特征上区分。目前市场上有用同属植物的干燥种子作王不留行入药。

中药指纹图谱是一种多指标的质量控制模式，虽然它不能代替含量测定，但它比测定任何单一成分所提供的信息却丰富得多，可以比较全面地反映所含化学成分的种类和数量，能够更加有效地体现出中药成分的整体性和综合作用。HPLC法具有高效、快速、灵敏、重现性好、应用范围广等特点，在中药的质量控制及中药有效成分研究等方面都是重要的分析手段。目前有部分文献研究报道建立了炒王不留行饮片及其炮制前后的成分及含量变化，局限于炮制对单一成分的影响，如周国洪.炒王不留行化学成分及炮制对其影响研究[D].中国中医科学院，2016，5.。但是未能明确王不留行和炒王不留行饮片的整体化学成分，不能说明炮制对王不留行各有效成分的影响。且目前尚没有对炒王不留行标准汤剂和配方颗粒的指纹图谱研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：

1)参照物溶液的制备：取王不留行黄酮苷、原儿茶酸、刺桐碱、肥皂草苷、王不留行环肽A、王不留行环肽B、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷、5-羟甲基糠醛为对照品，加70～100％甲醇制成参照物溶液；

2)供试品溶液的制备：取待检样品粉末，加入60～70％甲醇提取，滤过，取滤液作为供试品溶液；

3)分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B梯度洗脱；波长为240-270nm；梯度洗脱程序如下：

进一步地，步骤1)所述王不留行黄酮苷、刺桐碱、肥皂草苷、原儿茶酸、王不留行环肽A、王不留行环肽B、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷的浓度为每1ml分别含0.1mg、60μg、50μg、60μg、60μg、60μg、30μg。

进一步地，步骤2)所述王不留行/炒王不留行饮片待测样品与70％甲醇的质量体积比为1g：10mL，所述甲醇浓度为60％；或王不留行/炒王不留行标准汤剂粉末待测样品与水的质量体积比为1μ：100mL，所述水浓度为100％；或王不留行/炒王不留行配方颗粒研细后粉末待测样品与水的质量体积比为1g：50mL，所述水浓度为100％。

进一步地，步骤2)所述提取为超声提取，提取功率为600W，提取频率为40kHz，提取时间30min。

进一步地，步骤3)所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；进样量为10μL。

本发明还提供了一种王不留行和炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取待检王不留行和炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒粉末制备供试品溶液；

(2)按权利要求1-5项所述的高效液相色谱法检测；

(3)分析检测结果。

进一步地，所述的高效液相色谱法检测的王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱中应呈现11个特征峰。所述的峰4S为王不留行黄酮苷；峰2：原儿茶酸；峰3：刺桐碱；峰5：肥皂草苷；峰7：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰10：王不留行环肽B；峰11：王不留行环肽A。

进一步地，所述的高效液相色谱法检测的炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱中应呈现13个特征峰。其中与王不留行黄酮苷参照物相应的峰为S峰，与5-羟甲基糖醛参照物相应的峰为峰2；除峰4、峰5、峰12、峰13以外，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其中峰1～3的相对保留时间应在规定值的±10％之内，峰6～11的相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.217(峰1)、0.304(峰2)、0.320(峰3)、1.000(峰6S)、1.051(峰7)、1.142(峰8)、1.206(峰9)、1.429(峰10)、1.501(峰11)。

本发明的一种王不留行和炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量检测方法，明确了王不留行和炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的化学成分差异，阐明了炮制对王不留行化学成分的影响，且方法简单，稳定性好，精密度高，为王不留行和炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒鉴别提供了新方法。防止临床上将王不留行和炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒混用，保证了用药安全。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1王不留行饮片特征图谱，峰2：原儿茶酸；峰3：刺桐碱；峰4(S)：王不留行黄酮苷；峰5：肥皂草苷；峰7：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰10：王不留行环肽B；峰11：王不留行环肽A；

S1-S22依次为：WBLX180701、WBLX180702、WBLX180703、WBLX180704、WBLX180705、WBLX180706、WBLX180707、WBLX180708、WBLX180709、WBLX180710、WBLX180711、WBLX180712、WBLX180713、WBLX180714、WBLX180715、WBLX180716、WBLX180717、WBLX180718、WBLX180719、WBLX180720、WBLX180721、WBLX180722。

图2炒王不留行饮片特征图谱，峰2：5-羟甲基糠醛；峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A；

S1-S22依次为：CWBLX180601、CWBLX180602、CWBLX180603、CWBLX180604、CWBLX180606、CWBLX180607、CWBLX180615、CWBLX180616、CWBLX180617、CWBLX180618、CWBLX180619、CWBLX180620、CWBLX180621、CWBLX180622、CWBLX180623、CWBLX180624、乙WBLX180625、CWBLX180626、CWBLX180627、CWBLX180628、CWBLX180629、CWBLX180630。

图3王不留行饮片特征对照图谱，峰2：原儿茶酸；峰3：刺桐碱；峰4(S)：王不留行黄酮苷；峰5：肥皂草苷；峰7：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰10：王不留行环肽B；峰11：王不留行环肽A。

图4炒王不留行饮片特征对照图谱，峰2：5-羟甲基糠醛；峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A。

图5王不留行饮片与炒王不留行饮片对照图谱叠加图，峰2：5-羟甲基糠醛；峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A。

图6王不留行标准汤剂特征图谱，峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A；

S1-S22 依次为：WBLXBT180701、WBLXBT180702、WBLXBT180703、WBLXBT180704、WBLXBT180705、WBLXBT180706、WBLXBT180707、WBLXBT180708、WBLXBT180709、WBLXBT180710、WBLXBT180711、WBLXBT180712、WBLXBT180713、WBLXBT180714、WBLXBT180715、WBLXBT180716、WBLXBT180717、WBLXBT180718、WBLXBT180719、WBLXBT180720、WBLXBT180721、WBLXBT180722。

图7炒王不留行标准汤剂特征图谱，峰2：5-羟甲基糠醛；峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A；

S1-S22依次为：CWBLXBT180601、CWBLXBT180602、CWBLXBT180603、CWBLXBT180604、CWBLXBT180606、CWBLXBT180607、CWBLXBT180615、CWBLXBT180616、CWBLXBT180617、CWBLXBT180618、CWBLXBT180619、CWBLXBT180620、CWBLXBT180621、CWBLXBT180622、CWBLXBT180623、CWBLXBT180624、CWBLXBT180625、CWBLXBT180626、CWBLXBT180627、CWBLXBT180628、CWBLXBT180629、CWBLXBT180630。

图8王不留行标准汤剂特征对照图谱，峰2：原儿茶酸；峰3：刺桐碱；峰4(S)：王不留行黄酮苷；峰5：肥皂草苷；峰7：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰10：王不留行环肽B；峰11：王不留行环肽A。

图9炒王不留行标准汤剂特征对照图谱，峰2：5-羟甲基糠醛；峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A。

图10王不留行标准汤剂与炒王不留行标准汤剂对照图谱叠加图，峰2：5-羟甲基糠醛；峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A。

图11王不留行配方颗粒特征图谱，峰2：原儿茶酸；峰3：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰5：肥皂草苷；峰7：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰10：王不留行环肽B；峰11：王不留行环肽A；

S1-S3依次为：SY1807001、SY1807002、SY1807003。

图12炒王不留行配方颗粒特征图谱，峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A；

S1-S3依次为：SY1806001、SY1806002、SY1806003。

图13王不留行配方颗粒特征对照图谱，峰2：原儿茶酸；峰3：刺桐碱；峰4(S)：王不留行黄酮苷；峰5：肥皂草苷；峰7：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰10：王不留行环肽B；峰11：王不留行环肽A；。

图14炒王不留行配方颗粒特征对照图谱，峰2：5-羟甲基糠醛；峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A。

图15王不留行配方颗粒与炒王不留行标准汤剂对照图谱叠加图，峰2：5-羟甲基糠醛；峰4：原儿茶酸；峰5：刺桐碱；峰6(S)：王不留行黄酮苷；峰7：肥皂草苷；峰9：异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷；峰12：王不留行环肽B；峰13：王不留行环肽A。

图16刺桐碱紫外吸收光谱图

图17肥皂草苷紫外吸收光谱图

图18王不留行黄酮苷紫外吸收光谱图

图19王不留行环肽A紫外吸收光谱图

图20王不留行环肽B紫外吸收光谱图

图21异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷紫外吸收光谱图

图22原儿茶酸紫外吸收光谱图

图23炒王不留行配方颗粒3D色谱图

图24炒王不留行配方颗粒不同波长色谱图

图25柱温考察

图26流速考察

图27延迟性实验

图28提取方法考察

图29提取溶剂考察

图30提取时间考察

图31炒王不留行配方颗粒特征图谱色谱峰指认

具体实施方式

1实验仪器与试剂

1.1实验仪器

高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、waters e2695型高效液相色谱仪、岛津20AD型高效液相色谱仪；电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×250mm 5-Micron、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm、Shim-pack GIST5μm C184.6×250mm。

1.2试剂

乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

王不留行黄酮苷(中国食品药品检定研究院，批号：111853-201704，含量以96.9％计)；原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号：110809-201205，含量以99.9％计)；刺桐碱(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18012302，含量≥98％)；肥皂草苷(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18011711)；王不留行环肽A(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-18033102，含量以99.24％计)；王不留行环肽B(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-18051007，含量以99.6％计)；异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18010308，含量≥98％)。

王不留行饮片：(批号：WBLX180701、WBLX180702、WBLX180703、WBLX180704、WBLX180705、WBLX180706、WBLX180707、WBLX180708、WBLX180709、WBLX180710、WBLX180711、WBLX180712、WBLX180713、WBLX180714、WBLX180715、WBLX180716、WBLX180717、WBLX180718、WBLX180719、WBLX180720、WBLX180721、WBLX180722)；

炒王不留行饮片：(批号：CWBLX180601、CWBLX180602、CWBLX180603、CWBLX180604、CWBLX180606、CWBLX180607、CWBLX180615、CWBLX180616、CWBLX180617、CWBLX180618、CWBLX180619、CWBLX180620、CWBLX180621、CWBLX180622、CWBLX180623、CWBLX180624、CWBLX180625、CWBLX180626、CWBLX180622、CWBLX180628、CWBLX180629、CWBLX180630)。

王不留行标准汤剂：(批号：WBLXBT180701、WBLXBT180702、WBLXBT180703、WBLXBT180704、WBLXBT180705、WBLXBT180706、WBLXBT180707、WBLXBT180708、WBLXBT180709、WBLXBT180710、WBLXBT180711、WBLXBT180712、WBLXBT180713、WBLXBT180714、WBLXBT180715、WBLXBT180716、WBLXBT180717、WBLXBT180718、WBLXBT180719、WBLXBT180720、WBLXBT180721、WBLXBT180722)；

炒王不留行标准汤剂：(批号：CWBLXBT180601、CWBLXBT180602、CWBLXBT180603、CWBLXBT180604、CWBLXBT180606、CWBLXBT180607、CWBLXBT180615、CWBLXBT180616、CWBLXBT180617、CWBLXBT180618、CWBLXBT180619、CWBLXBT180620、CWBLXBT180621、CWBLXBT180622、CWBLXBT180623、CWBLXBT180624、CWBLXBT180625、CWBLXBT180626、CWBLXBT180627、CWBLXBT180628、CWBLXBT180629、CWBLXBT180630)。

王不留行配方颗粒：(批号：SY1807001、SY1807002、SY1807003)；

炒王不留行配方颗粒：(批号：SY1806001、SY1806002、SY1806003)。

实施例1王不留行饮片特征图谱

1)参照物溶液的制备：

取王不留行黄酮苷对照品、刺桐碱对照品、肥皂草苷对照品适量，精密称定，分别加70％甲醇制成每1ml含王不留行黄酮苷0.1mg、刺桐碱60μg、肥皂草苷50μg的溶液。再取原儿茶酸对照品、王不留行环肽A对照品、王不留行环肽B对照品、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含原儿茶酸60μg、王不留行环肽A 60μg、王不留行环肽B60μg、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷30μg的溶液，即得。

2)供试品溶液的制备：

分别取22个批次王不留行粉末各0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

3)检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定；

色谱条件如下：

检测波长：270nm

色谱柱：C18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；

流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～35min，5～20％A；35～60min，20％～60％A)；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

对22批王不留行饮片样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间比值。见图1，表1。

表1 22批王不留行饮片相对保留时间比值

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共有11个重复性较好的特征峰。22批王不留行饮片11个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品特征图谱中应呈现11个特征峰，其中7个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与王不留行黄酮苷参照物相应的峰为S峰，除峰2、峰3、峰10、峰11以外，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其中峰1的相对保留时间在规定值的±10％之内，峰4～9的相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.216(峰1)、1.000(峰4S)、1.051(峰5)、1.144(峰6)、1.206(峰7)、1.426(峰8)、1.502(峰9)。

实施例2炒王不留行饮片特征图谱

1)参照物溶液的制备：

取王不留行黄酮苷对照品、刺桐碱对照品、肥皂草苷对照品适量，精密称定，分别加70％甲醇制成每1ml含王不留行黄酮苷0.1mg、刺桐碱60μg、肥皂草苷50μg的溶液。再取原儿茶酸对照品、王不留行环肽A对照品、王不留行环肽B对照品、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含原儿茶酸60μg、王不留行环肽A 60μg、王不留行环肽B60μg、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷30μg的溶液，即得；

2)供试品溶液的制备：

分别取22个批次炒王不留行粉末各0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

3)特征图谱的测定

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定；

色谱条件如下：

检测波长：270nm

色谱柱：C18色谱柱(功率600W，频率40kHz)；

流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～35min，5％～20％A；35～60min，20％～60％A)；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

对22批炒王不留行饮片样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间比值。见图2，表2。

表2 22批炒王不留行饮片相对保留时间比值

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共有13个重复性较好的特征峰。22批炒王不留行饮片11个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品特征图谱中应呈现11个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与王不留行黄酮苷参照物相应的峰为S峰，除峰2、峰4、峰5、峰12、峰13以外，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其中峰1、峰3的相对保留时间应在规定值的±10％之内，峰6～11的相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.216(峰1)、0.319(峰3)、1.000(峰6S)、1.051(峰7)、1.143(峰8)、1.206(峰9)、1.427(峰10)、1.501(峰11)。

实施例3王不留行饮片与炒王不留行饮片特征图谱鉴别

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)分别对22批王不留行饮片和22批炒王不留行饮片特征图谱进行合成，建立了王不留行饮片和炒王不留行饮片特征图谱的对照图谱(图3、图4)，并进行叠加比较，见图5。结果表明：炒王不留行饮片中，在6～9分钟时，较王不留行饮片多了两个峰，其中峰2经指认为5-羟甲基糠醛，差异显示这两个峰为炮制之后产生新成分。建立的王不留行和炒王不留行特征图谱检测法能够将两种饮片进行鉴别，其中炒王不留行饮片中的峰2和峰3为主要的鉴别点。

实施例4王不留行标准汤剂特征图谱

1)参照物溶液的制备：

取王不留行黄酮苷对照品、刺桐碱对照品、肥皂草苷对照品适量，精密称定，分别加70％甲醇制成每1ml含王不留行黄酮苷0.1mg、刺桐碱60μg、肥皂草苷50μg的溶液。再取原儿茶酸对照品、王不留行环肽A对照品、王不留行环肽B对照品、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含原儿茶酸60μg、王不留行环肽A 60μg、王不留行环肽B60μg、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷30μg的溶液，即得。

2)供试品溶液的制备：

分别取22个批次王不留行标准汤剂粉末各0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

3)检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定；

色谱条件如下：

检测波长：270nm

色谱柱：C18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；

流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～35min，5～20％A；35～60min，20％～60％A)；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

对22批王不留行标准汤剂样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间比值。见图6，表3。

表3 22批王不留行标准汤剂相对保留时间比值

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共有11个重复性较好的特征峰。22批王不留行标准汤剂11个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品特征图谱中应呈现11个特征峰，其中7个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与王不留行黄酮苷参照物相应的峰为S峰，除峰2、峰3、峰10、峰11以外，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其中峰1的相对保留时间在规定值的±10％之内，峰4～9的相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.208(峰1)、1.000(峰4S)、1.050(峰5)、1.128(峰6)、1.210(峰7)、1.438(峰8)、1.511(峰9)。

实施例5炒王不留行标准汤剂特征图谱

1)参照物溶液的制备：

取王不留行黄酮苷对照品、刺桐碱对照品、肥皂草苷对照品适量，精密称定，分别加70％甲醇制成每1ml含王不留行黄酮苷0.1mg、刺桐碱60μg、肥皂草苷50μg的溶液。再取原儿茶酸对照品、王不留行环肽A对照品、王不留行环肽B对照品、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含原儿茶酸60μg、王不留行环肽A 60μg、王不留行环肽B60μg、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷30μg的溶液，即得；

2)供试品溶液的制备：

分别取22个批次炒王不留行标准汤剂粉末各0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

3)特征图谱的测定

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定；

色谱条件如下：

检测波长：270nm

色谱柱：C18色谱柱(功率600W，频率40kHz)；

流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～35min，5％～20％A；35～60min，20％～60％A)；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

对22批炒王不留行标准汤剂样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。见图7，表4。

表4 22批炒王不留行标准汤剂相对保留时间比值

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共有13个重复性较好的特征峰。22批炒王不留行标准汤剂13个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品特征图谱中应呈现13个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与王不留行黄酮苷参照物相应的峰为S峰，除峰2、峰4、峰5、峰12、峰13以外，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其中峰1、峰3的相对保留时间应在规定值的±10％之内，峰6～11的相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.216(峰1)、0.320(峰3)、0.644(峰5)、1.000(峰6S)、1.051(峰7)、1.142(峰8)、1.206(峰9)、1.428(峰10)、1.502(峰11)。

实施例6王不留行标准汤剂与炒王不留行标准汤剂特征图谱鉴别

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)分别对22批王不留行标准汤剂和炒王不留行标准汤剂特征图谱进行合成，建立了王不留行标准汤剂和炒王不留行标准汤剂特征图谱的对照图谱(图8、图9)，并进行叠加比较，见图10。结果表明：炒王不留行标准汤剂中，在6～9分钟时，较王不留行标准汤剂多了两个峰，其中峰2经指认为5-羟甲基糠醛，差异显示这两个峰为炮制之后产生新成分。建立的王不留行和炒王不留行标准汤剂特征图谱检测法能够将两种饮片进行鉴别，其中炒王不留行标准汤剂中的峰2和峰3为主要的鉴别点。

实施例7王不留行配方颗粒特征图谱

1)参照物溶液的制备：

取王不留行黄酮苷对照品、刺桐碱对照品、肥皂草苷对照品适量，精密称定，分别加70％甲醇制成每1ml含王不留行黄酮苷0.1mg、刺桐碱60μg、肥皂草苷50μg的溶液。再取原儿茶酸对照品、王不留行环肽A对照品、王不留行环肽B对照品、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含原儿茶酸60μg、王不留行环肽A 60μg、王不留行环肽B60μg、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷30μg的溶液，即得。

2)供试品溶液的制备：

分别取3个批次王不留行配方颗粒各1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

3)检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定；

色谱条件如下：

检测波长：270nm

色谱柱：C18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；

流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～35min，5～20％A；35～60min，20％～60％A)；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

对3批王不留行配方颗粒样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。见图11，表5。

表5 3批王不留行配方颗粒相对保留时间比值

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共有11个重复性较好的特征峰。3批王不留行配方颗粒11个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品特征图谱中应呈现11个特征峰，其中7个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与王不留行黄酮苷参照物相应的峰为S峰，除峰2、峰3、峰10、峰11以外，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其中峰1的相对保留时间在规定值的±10％之内，峰4～9的相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.208(峰1)、1.000(峰4S)、1.050(峰5)、1.126(峰6)、1.210(峰7)、1.439(峰8)、1.513(峰9)。

实施例8炒王不留行配方颗粒特征图谱

1)参照物溶液的制备：

取王不留行黄酮苷对照品、刺桐碱对照品、肥皂草苷对照品适量，精密称定，分别加70％甲醇制成每1ml含王不留行黄酮苷0.1mg、刺桐碱60μg、肥皂草苷50μg的溶液。再取原儿茶酸对照品、王不留行环肽A对照品、王不留行环肽B对照品、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含原儿茶酸60μg、王不留行环肽A 60μg、王不留行环肽B60μg、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷30μg的溶液，即得；

2)供试品溶液的制备：

分别取3个批次炒王不留行配方颗粒粉末各1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

3)特征图谱的测定

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定；

色谱条件如下：

检测波长：270nm

色谱柱：C18色谱柱(功率600W，频率40kHz)；

流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～35min，5％～20％A；35～60min，20％～60％A)；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

对3批炒王不留行配方颗粒样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间比值。见图12，表6。

表6 3批炒王不留行配方颗粒相对保留时间比值

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共有13个重复性较好的特征峰。3批炒王不留行配方颗粒13个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。供试品特征图谱中应呈现13个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，以王不留行黄酮苷参照物相应的峰为S峰，除峰2、峰4、峰5、峰12、峰13以外，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其中峰1、峰3的相对保留时间应在规定值的±10％之内，峰6～11的相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.217(峰1)、0.320(峰3)、1.000(峰6S)、1.051(峰7)、1.142(峰8)、1.206(峰9)、1.429(峰10)、1.501(峰11)。

实施例9王不留行配方颗粒与炒王不留行配方颗粒特征图谱鉴别

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)分别对3批王不留行配方颗粒和炒王不留行配方颗粒特征图谱进行合成，建立了王不留行配方颗粒和炒王不留行配方颗粒特征图谱的对照图谱(图13、图14)，并进行叠加比较，见图15。结果表明：炒王不留行配方颗粒中，在6～9分钟时，较王不留行配方颗粒多了两个峰，其中峰2经指认为5-羟甲基糠醛，差异显示这两个峰为炮制之后产生新成分。建立的王不留行和炒王不留行配方颗粒特征图谱检测法能够将两种饮片进行鉴别，其中炒王不留行标准汤剂中的峰2和峰3为主要的鉴别点。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1炒王不留行配方颗粒特征图谱法

1、色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)以乙腈为流动相A；以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为270nm。理论板数按王不留行黄酮苷峰计算应不低于3000，如表7所示。

表7拟定的流动相梯度

1.1波长选择

在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对刺桐碱、肥皂草苷、王不留行黄酮苷、王不留行环肽A、王不留行环肽B、异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷、原儿茶酸供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液3D图以及在250nm、260nm、270nm、280nm波长下的色谱图。见图15-24。结果表明，在检测波长为270nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为270nm。

1.2柱温考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。见图25。结果表明，柱温在30℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故柱温确定为30℃。

1.3流速考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图26。结果表明，在流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。

1.4延迟性实验

在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至120min。见图27。结果，在色谱图采集到60分钟后，仅在74分钟左右出现一个色谱峰，经过同等条件下进空针证实，此峰并非供试品原因产生。故当色谱图采集至60分钟时，已将色谱峰采集完全。将色谱图采集时间确定为60分钟。

2、供试品溶液的制备考察

2.1提取方法考察

取炒王不留行配方颗粒(批号：1804039)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图28。结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。

2.2提取溶剂考察

取炒王不留行配方颗粒(批号1804039)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为70％甲醇、甲醇、水50ml时进行考察，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图29。结果表明，70％甲醇提取溶剂条件下色谱峰信息更丰富。故供试品提取溶剂确定为70％甲醇。

2.3提取时间考察

取炒王不留行配方颗粒(批号：1804039)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图30。结果表明，在提取时间为30分钟时，即可充分提取。故供试品提取时间确定为30分钟。

综上所述，炒王不留行配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3方法学考察

3.1色谱峰指认

供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备炒王不留行配方颗粒供试品溶液。

参照物溶液的制备：取王不留行黄酮苷对照品、刺桐碱对照品、肥皂草苷对照品适量，精密称定，分别加70％甲醇制成每1ml含王不留行黄酮苷0.1mg、刺桐碱60μg、肥皂草苷50μg的溶液。再取原儿茶酸对照品、王不留行环肽A对照品、王不留行环肽B对照品、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含原儿茶酸60μg、王不留行环肽A60μg、王不留行环肽B 60μg、异牡荆素-2”-O-阿拉伯糖苷30μg的溶液，即得。

阴性对照溶液的制备：按以上的实验条件，制备缺炒王不留行配方颗粒阴性对照溶液。

对炒王不留行配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图31。

3.2精密度试验

取炒王不留行配方颗粒(批号：1804039)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的相对保留时间。见表8。结果表明，该仪器精密度良好。

表8精密度考察-保留时间

3.3重复性考察

精密称取炒王不留行配方颗粒(批号：1804039)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表9。结果表明，该方法重复性良好。

表9重复性考察-相对保留时间比值

3.4中间精密度考察

3.4.1不同仪器考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取炒王不留行配方颗粒(批号：1804039)三份，制备供试品溶液，分别在安捷伦安捷伦1260、waters2695、岛津20AD型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为ZORBAX EclipseXDB-C18Analytical 4.6×250mm 5-Micron)。见表10。结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD小于4.56％。

表10仪器耐用性考察-相对保留时间比值

3.4.2不同人员和时间考察

在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取炒王不留行配方颗粒(批号：1804039)各两份，制备供试品，进行测定。见表11。结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。

表11人员和时间考察-相对保留时间比值

3.5耐用性考察

3.5.1色谱柱耐用性考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×250mm5-Micron(安捷伦色谱柱)、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm(迪马色谱柱)、Shim-pack GIST 5μm C184.6×250mm(岛津色谱柱)进行考察。见表12。结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.11％～6.11％。

表12色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值

3.5.2稳定性考察

在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，16h，24h时测定。见表13、14。结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.09％～2.05％，样品溶液在24小时内较稳定。

表13稳定性考察-保留时间

表14稳定性考察-峰面积

综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。

Claims (9)

1.一种王不留行与炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：

1）参照物溶液的制备：取王不留行黄酮苷、原儿茶酸、刺桐碱、肥皂草苷、王不留行环肽A、王不留行环肽B、异牡荆素-2’’-O-阿拉伯糖苷、5-羟甲基糠醛为对照品，加70~100%甲醇制成参照物溶液；

2）供试品溶液的制备：取待检样品粉末，加入0-70%甲醇提取，滤过，取滤液作为供试品溶液；

3）取参照物溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B梯度洗脱；波长为240-270nm；梯度洗脱程序如下：

时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%） 0～35 5→20 95→80 35～60 20→60 80→40

。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1）所述王不留行黄酮苷、刺桐碱、肥皂草苷的浓度为每1ml分别含0.1mg、60μg、50μg，所述甲醇浓度为70%；原儿茶酸对照品、王不留行环肽A对照品、王不留行环肽B对照品、异牡荆素-2’’-O-阿拉伯糖苷的浓度为每1ml分别含60μg、60μg、60μg、30μg，所述甲醇浓度为100%。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述王不留行/炒王不留行饮片待测样品与70%甲醇的质量体积比为1g:10mL，所述甲醇浓度为70%；或王不留行/炒王不留行标准汤剂粉末待测样品与水的质量体积比为1g:100mL；或王不留行/炒王不留行配方颗粒研细后粉末待测样品与水的质量体积比为1g:50mL。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述提取为超声提取，提取功率为600W，提取频率为40kHz，提取时间30min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3）所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3）中，柱温为30℃；流速为1.0ml/min；进样量为10μL。

7.一种王不留行和炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）取待检王不留行和炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒粉末制备供试品溶液；

（2）按权利要求1-6任一项所述的高效液相色谱法检测；

（3）分析检测结果。

8.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒的图谱呈现11个特征峰。

9.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的炒王不留行饮片、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱呈现13个特征峰。

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