CN113341033B - 地榆及地榆炭对照提取物的制备工艺及其质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了地榆及地榆炭对照提取物的制备工艺及其质量控制方法，包括以下步骤：取地榆/地榆炭对照提取物0.1g，加入供试品提取溶剂，称定重量，提取，冷却，再称定重量，用供试品提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；另取鞣花酸对照品适量，加60%甲醇制成每1ml含100μg的溶液；再取没食子酸对照品、5‑羟甲基糠醛对照品适量，加水制成每1ml分别含30μg的溶液；十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm，内径为4.6 mm，硅胶粒径为5μm；二极管阵列检测器，检测波长为220‑360nm；柱温：20℃‑30℃；流速：0.8‑1.2mL/min；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；分别精密吸取参照物溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

Description

地榆及地榆炭对照提取物的制备工艺及其质量控制方法

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，具体涉及地榆及地榆炭对照提取物的制备工艺及其质量控制方法。

背景技术

地榆，为蔷薇科植物地榆或长叶地榆的干燥根。后者习称“绵地榆”。春季将发芽时或秋季植株枯萎后采挖，除取须根，洗净，干燥，或趁鲜切片，干燥。地榆炭：取净地榆片置锅内，用武火加热，炒至表面焦黑色、内部棕褐色，喷淋清水少许，灭尽火星，取出凉透。目前关于地榆炭药材指纹图谱的研究几乎没有，缺少地榆及地榆炭对照提取物制备工艺及其质量控制方法。

发明内容

本发明的目的在于提供地榆及地榆炭对照提取物的制备工艺，采用地榆炮制而得的地榆饮片和地榆炭饮片为原料分别经煎煮提取而制得，制备过程中，通过合理控制煎煮次数、加水量、煎煮时间等，能有效控制出膏率及其有效成分没食子酸和鞣质的含量，保证了地榆及地榆炭对照提取物成分的稳定性，且工艺运行稳定。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

地榆对照提取物的制备工艺，其特征在于：取地榆炮制而得的地榆饮片，加水煎煮两次，一次煎煮加10倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，过滤，冷却至室温；二次煎煮加8倍水，煮沸，保持微沸煎煮20分钟，过滤，合并水煎液，冷却至室温，真空冷冻干燥，即得地榆对照提取物。

所述地榆对照提取物中含鞣质为20.0％-39.0％，所述地榆对照提取物中没食子酸为3.5％-6.5％，所述地榆对照提取物出膏率范围为16.0％-32.0％。

包括构建地榆对照提取物的特征图谱，步骤如下：

步骤A1.分别制备地榆对照药材的参照物溶液和地榆对照提取物的供试品溶液；

步骤B1.分别取参照物溶液和供试品溶液，按高效液相色谱法进行测定，得到对应的特征图谱；

步骤C1以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建地榆对照提取物的特征图谱。

所述步骤A1中，参照物溶液的制备包括：取地榆对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，超声处理20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液，另取鞣花酸对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含鞣花酸100μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

所述步骤A1中，供试品溶液的制备包括：取地榆对照提取物0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

所述步骤B1中，按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为272nm，理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。

所述梯度脱洗满足以下条件：0-15min，流动相A5→20％；15-25min，流动相A20→30％；25-55min，流动相A30→75％。

所述共有峰包括7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，与鞣花酸参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.194(峰1)、0.397(峰2)、0.663(峰3)、0.683(峰4)、0.711(峰5)、1.103(峰7)。

还包括地榆对照提取物中鞣质的含量进行测定，包括以下步骤：

步骤A2.对照品溶液制备：精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸0.05mg)。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml、6ml、5ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标Y，浓度为横坐标X，绘制标准曲线。

供试品溶液的制备：取地榆对照提取物0.4g，精密称定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置过夜，超声处理10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，弃取初滤液50ml，精密量取续滤液20ml，置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

步骤B2含量测定：总酚精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

不被吸附的多酚精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃取初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

按下式计算鞣质的含量：

鞣质含量＝总酚量-不被吸附的多酚量

测定时，同时进行干酪素吸附空白试验，计算扣除空白值，且实验过程避光操作。

还包括对权利要求1所述地榆对照提取物中没食子酸的含量进行测定，包括以下步骤：

步骤A3照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05％磷酸溶液为流动相进行等度洗脱；检测波长为272nm，理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含30μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取地榆对照提取物0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％盐酸溶液20ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

步骤B3含量测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

地榆炭对照提取物的制备工艺，其特征在于：取地榆炮制而得的地榆饮片，加水煎煮两次，一次煎煮加10倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，过滤，冷却至室温；二次煎煮加8倍水，煮沸，保持微沸煎煮20分钟，过滤，合并水煎液，冷却至室温，真空冷冻干燥即得地榆炭对照提取物。

所述地榆炭对照提取物中含鞣质为14.0％-28.0％，所述地榆炭对照提取物中没食子酸为3.1％-7.4％，所述地榆炭对照提取物出膏率为12.0％-24.0％。

包括构建地榆炭对照提取物的特征图谱，步骤如下：

步骤A4.分别制备地榆对照药材的参照物溶液和地榆炭对照提取物的供试品溶液；

步骤B4.分别取参照物溶液和供试品溶液，按高效液相色谱法进行测定，得到对应的特征图谱；

步骤C4.以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建地榆炭对照提取物的特征图谱。

所述步骤A4中，参照物溶液的制备包括：取地榆对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液，另取鞣花酸对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含100μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

所述步骤A4中，供试品溶液的制备包括：取地榆炭对照提取物0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

所述步骤B4中，按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为272nm，理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。

所述梯度脱洗满足以下条件：0-15min，流动相A5→20％；15-25min，流动相A20→30％；25-55min，流动相A30→75％。

所述共有峰包括9个特征峰，其中峰1、峰3～峰9应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰相对应，与鞣花酸参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，规定值为：0.198(峰1)、0.265(峰2)、0.404(峰3)、0.686(峰4)、0.719(峰5)、0.826(峰6)、1.000(峰7(S))、1.105(峰8)、1.241(峰9)。

还包括地榆炭对照提取物中鞣质的含量进行测定，包括以下步骤：

对照品溶液制备：精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸0.05mg)；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取地榆炭对照提取物0.4g，精密称定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置过夜，超声处理10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，弃去初滤液50ml，精密量取续滤液20ml，置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得；

含量测定：总酚精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的浓度(μg/mL)，计算没食子酸的量，即得；

不被吸附的多酚精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的浓度(μg/mL)，计算没食子酸的量，即得；按下式计算鞣质的含量：鞣质含量＝总酚量-不被吸附的多酚量；

测定时，同时进行干酪素吸附空白试验，计算扣除空白值，且实验过程避光操作。

还包括地榆炭对照提取物中没食子酸的含量进行测定，包括以下步骤：

步骤A5.照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05％磷酸溶液为流动相进行等度洗脱；检测波长为272nm，理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含30μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取地榆炭对照提取物0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％盐酸溶液20ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

步骤B5含量测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本技术方案的有益效果如下：

(1)本发明方法提供了基于煎煮工艺实现的地榆及地榆炭对照提取物的制备方法，通过合理控制煎煮过程的工艺参数条件，如加水量及煎煮时间，能有效控制出膏率及其有效成分没食子酸和鞣质的含量，保证了地榆及地榆炭对照提取物成分的稳定性，为后续地榆及地榆炭制剂在中药自动配药机中的应用提供更加稳定和精确的数据。

(2)本发明为地榆及地榆炭对照提取物的制备工艺建立了专属的质量控制方法，以地榆对照药材、鞣花酸对照品为参照物，在特定的检测条件下，构建得到地榆及地榆炭对照提取物的特征图谱，可快速并高效地实现地榆及地榆炭对照提取物的质量控制。

(3)本发明同时还建立了地榆及地榆节炭对照提取物中鞣质含量的测定方法，以没食子酸为对照品，通过标准曲线的绘制，测定地榆及地榆炭对照提取物中有效成分鞣质的含量，分别以没食子酸(C₇H₆O₅)计范围应为20.0～39.0％和14.0～28.0％，可用于地榆及地榆炭对照提取物制备工艺的质量控制。

(4)本发明同时还建立了地榆及地榆节炭对照提取物中没食子酸含量的测定方法，以没食子酸为对照品，测定地榆及地榆炭对照提取物中有效成分没食子酸的含量，没食子酸(C₇H₆O₅)含量范围分别为3.5～6.5％和3.1～7.4％，可用于地榆及地榆炭对照提取物制备工艺的质量控制。

综上所述，本发明提出了地榆及地榆炭对照提取物的制备工艺并为此建立了专属的质量控制方法，实现了从药材、制备工艺过程及有效成分含量的全面反映，更好的符合中药制剂的规范要求，保证了中药制剂含量的合理性。

附图说明

图1为地榆吸水率曲线；

图2为地榆对照提取物冻干工艺；

图3为15批地榆对照提取物出膏率分布图；

图4为15批地榆对照提取物水分分布图；

图5为地榆对照提取物的特征图谱，峰1：没食子酸，峰6S：鞣花酸；

图6为地榆对照提取物的3D色谱图；

图7为地榆对照提取物不同波长色谱图；

图8为地榆对照提取物不同柱温色谱图；

图9为地榆对照提取物不同流速色谱图；

图10为地榆对照提取物的延迟性实验色谱图；

图11为地榆对照提取物不同提取方法色谱图；

图12为地榆对照提取物不同提取溶剂色谱图；

图13为地榆对照提取物不同提取时间色谱图；

图14为地榆对照提取物特征图谱专属性考察色谱图；

图15为地榆(地榆)对照药材特征图谱；

图16为地榆对照提取物不同仪器色谱图；

图17为地榆对照提取物色谱柱耐用性考察色谱图；

图18为地榆对照提取物特征图谱(a)；

图19为地榆对照提取物特征图谱(b)；

图20为为地榆对照提取物特征图谱(c)；

图21为地榆对照提取物的专属性考察图；

图22为没食子酸标准曲线图(地榆)；

图23为地榆对照提取物中没食子酸含量分布图；

图24为鞣质标准曲线图(地榆)；

图25为地榆对照提取物含量分布图；

图26为地榆炭吸水率曲线；

图27为地榆炭对照提取物冻干工艺；

图28为地榆炭对照提取物的特征图谱，峰1：没食子酸，峰2：5-羟甲基糠醛，峰7(S)：鞣花酸；

图29为地榆炭对照提取物不同波长色谱图；

图30为地榆炭对照提取物不同柱温色谱图；

图31为地榆炭对照提取物不同流速色谱图；

图32为地榆炭对照提取物不同提取方法色谱图；

图33为地榆炭对照提取物不同提取溶剂色谱图；

图34为地榆炭对照提取物不同提取时间色谱图；

图35为地榆炭对照提取物不同溶媒量色谱图；

图36为地榆炭对照提取物特征图谱峰指认；

图37为地榆炭对照提取物不同仪器色谱图；

图38为地榆炭对照提取物色谱柱耐用性考察色谱图；

图39为15批地榆炭对照提取物特征图谱；

图40为地榆炭对照提取物的专属性考察图；

图41为没食子酸标准曲线图(地榆炭)；

图42为鞣质标准曲线图(地榆)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例提出了地榆对照提取物的制备工艺

取地榆饮片100g，加水煎煮两次，一煎加10倍水(液面没过饮片高度应为2～5cm)，浸泡30分钟，先用武火煮沸后，改用文火慢煎30分钟，采用200目筛网趁热过滤，滤液在冷水环境下快速冷却至室温；二煎加8倍水(液面没过饮片高度应为2～5cm)，先用武火煮沸后，改用文火慢煎20分钟，采用200目筛网过滤，合并水煎液，滤液在冷水环境下快速冷却至室温，按下表1中的冻干工艺进行真空冷冻干燥后，在温度10～26℃、相对湿度40～60％环境下，快速收粉(出膏率范围应为16.0-32.0％)、称量、分装于棕色西林瓶，并封口、贴标签，制得地榆对照提取物。

表1冻干工艺

以下是对地榆对照提取物制备工艺的研究。

1、仪器与设备

电子天平：上海方瑞仪器有限公司JY系列百分之一天平；

煎药壶：美味世家全自动分体式陶瓷煎药壶4升；

筛网：九峰筛网200目；

旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂RE-5203；

循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司SHB-B92；

真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司LGJ-100F；

西林瓶压盖机：SZ20A；

2000ml不锈钢量杯若干；西林瓶：10ml，30ml，50ml若干。

2、前处理工艺研究

经查询《中国药典》2020年版和各地中药饮片炮制规范，结果见表2：

表2地榆饮片炮制方法汇总

综合上表，地榆饮片炮制主要参考《中国药典》2020年版一部地榆【炮制】项下相关规定及第四部通则0213炮制通则相关规定进行炮制，具体方法为：除取杂质；未切片者，洗净，除取残茎，润透，切厚片，干燥。

因15批次地榆药材已经在产地加工时切片和除取杂质，药材中几乎无杂质存在，仅需经过简单净制，即可作为对照提取物的制备原料药。

3、制备工艺研究

3.1、提取溶媒

依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，确定地榆对照提取物的制备提取溶媒为水。

3.2、取样量

用于制备地榆对照提取物的饮片取样量定为100g。

3.3、加水量

按照《医疗构中药煎药室管理规范》等相关规定，加水量一般以浸过药面2-5cm为宜，但不同饮片吸水率相差较大，因此需了解地榆的吸水率进而为加水量做参考。

取同一批号地榆50g(批号：010120-1706001)，两份，分别加入10倍量的水(500g)，分别在浸泡10min、20min、30min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、17h、22h、24h测定，计算吸水率，结果见表3，吸水率曲线见图1。

表3地榆吸水率变化

由地榆的吸水率曲线可知其在前30分钟急剧吸水，30分钟时的平均吸水率为49.7％，30分钟后增长率逐渐减小，5-24h吸水接近饱和，24小时时的平均吸水率为158.5％。

取饮片100g(批号：010120-1706001))于煎药壶，分别加入7倍、9倍水、11倍水、13倍水，观察水面没过饮片的高度，结果见表4。

表4不同加水量液面高度

结果可知当加水量为7-13倍时，浸过药面高度均在2-5cm范围，参考其吸水率，同时保证不同批次饮片均能在2-5cm范围，确定一煎加水倍数为10倍，二煎加水量为8倍。

3.4、浸泡

依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，待煎饮片应当先行浸泡，浸泡时间应根据饮片的质地确定，一般不少于30min。确定浸泡时间为30min。

3.5、煎煮次数

依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，煎煮次数定为2次。

3.6、煎煮时间

地榆属于活血化瘀类药，按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中对照提取物制备的规定：煎煮时间应当根据方剂的功能主治和药物的功效确定。一般药物煮沸后再煎煮20-30分钟；解表类、清热类、芳香类药物不宜久煎，煮沸后再煎煮15-20分钟；滋补药物先用武火煮沸后，改用文火慢煎约40-60分钟。药剂第二煎的煎煮时间应当比第一煎的时间略缩短。确定地榆对照提取物第一煎先用武火煮沸后，改用文火慢煎30min，第二煎先用武火煮沸后，改用文火慢煎20min。

3.7、固液分离

根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》，并结合大生产，采用200目筛网趁热过滤。

3.8、真空冷冻干燥

根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中对照提取物要求，对对照提取物干燥过程推荐采用真空冷冻干燥方法制备为宜，可保证其质量的稳定、易于保存。真空冷冻干燥工艺参数见表5，图2。

表5冻干工艺

实施例2

本实施例涉及15批地榆对照提取物的制备。按照实施例1所述的制备工艺，取15批地榆饮片制备地榆对照提取物。

1、来源

根据《中国药典》2020年版一部地榆项下相关规定，本品为蔷薇科植物地榆Sanguisorbaofficinalis L.的干燥根。

按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的要求共收集15批来自甘肃省定西市、陕西省渭南市等产区的地榆(地榆)药材，并按要求炮制成饮片。药材与饮片均符合《中国药典》2020版的要求。见表6。

表6产地信息与检验结果

2、性状

用15批地榆饮片进行对照提取物的制备，每批地榆饮片制1批对照提取物，共制得15批冻干粉，各对照提取物批号所对应饮片及药材批号及各批对照提取物性状见表7。

表7 15批次地榆对照提取物性状

3、出膏率

对15批地榆对照提取物进行测定，所得各批次对照提取物出膏率结果见表8和图3。

表8 15批地榆对照提取物制备数据汇总

结果表明，15批地榆对照提取物出膏率范围为16.4～31.8％，平均值为24.1％，SD为4.7。平均值的70％-130％的范围为16.9％～31.3％，平均值加减3倍SD范围为10.0％～38.2％。根据以上数据，确定地榆对照提取物出膏率范围为16.0％～32.0％。

4、水分

按照《中国药典》2020年版四部通则0832第二法进行测定，15批地榆对照提取物水分测定结果，见表9，图4。

表9 15批地榆对照提取物水分测定结果

结果表明，15批地榆对照提取物水分在3.6％～6.3％范围之内，平均值为4.9％。

根据以上结果，确定地榆对照提取物水分应小于8.0％。

实施例3

本实施例是对地榆对照提取物的质量控制方法。

1、实验仪器与材料

高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；

超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；

色谱柱：XBridge C18 5μm 4.6×250mm。

2、试剂及试药

甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

没食子酸(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605，含量以90.8％计)；

鞣花酸(中国食品药品检定研究院，批号：111959-201602，含量以89.3％计)；

地榆(地榆)对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121286-201703)；

地榆对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：DYBT180801、DYBT180802、DYBT180803、DYBT180804、DYBT180805、DYBT180806、DYBT180807、DYBT180808、DYBT180809、DYBT180810、DYBT180811、DYBT180812、DYBT180821、DYBT180822、DYBT180824)。

3、特征图谱

参照物溶液的制备：取地榆对照药材0.5g，所述地榆对照药材为地榆(地榆)对照药材，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，超声处理20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取鞣花酸对照品适量，精密称定，分别加60％甲醇制成每1ml含鞣花酸0.1mg的溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备：取本品0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定：精密吸取对照品参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表10的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为272nm，流速为1.0ml/min，理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000，测定，即得。

表10梯度脱洗

以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建地榆对照提取物的特征图谱，见图5。

4、色谱条件与系统适用性试验

4.1、波长

在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液3D图以及在250nm、260nm、272nm、280nm、290nm波长下的色谱图。结果见图6和图7。

结果表明，在检测波长为272nm波长下各色谱峰峰形和对称性更好，整个色谱图信息量较大，故检测波长确定为272nm。

4.2、柱温考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察，见图8。

结果表明，在柱温为25℃时，各色谱峰分离度更好，故暂定柱温为25℃进行后续考察。

4.3、流速考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2 ml/min时进行了考察，见图9。

结果表明，在流速为1.0ml/min时，各色谱峰分离度最好，故暂定流速为1.0ml/min进行后续考察。

4.4、延迟性试验

在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至110min，结果见图10。

结果表明，在色谱图采集到55分钟时，已将色谱峰采集完全。故将色谱图采集时间确定为55分钟。

综上所述，地榆对照提取物特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表10的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为25℃；检测波长为272nm，理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。

5、供试品溶液的制备考察

5.1、提取方法考察

取本品(批号DYBT180801)0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图11。

结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果无显著差异。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。

5.2、提取溶剂考察

取本品(批号DYBT180801)0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、70％甲醇、水时进行考察，溶剂加入量为50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。另取本品约0.2g，按《中国药典》2020年版地榆项下含测供试品处理方法制备，即得，见图12。

结果表明，药典含测处理方法图谱中显示样品发生成分变化，不能真实反应样品实际情况。当提取溶剂为水时，色谱峰信息量较大，峰型最好，故选择提取溶剂为水。

5.3、提取时间考察

取本品(批号DYBT180801)0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图13。

结果表明，在提取时间为20分钟，即可充分提取。故供试品提取时间确定为20分钟。

综上所述，地榆对照提取物特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取供试品0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

6、方法学考察

6.1、专属性考察

供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备地榆对照提取物供试品溶液。

取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含30μg的溶液，即得。

取鞣花酸对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

取地榆(地榆)对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对地榆对照提取物特征图谱峰进行定位，见图14和图15。

结果表明，峰1为没食子酸，峰7为鞣花酸。对照提取物中的8个特征峰在地榆(地榆)对照药材图谱中能够一一对应。在以下方法学考察中，暂将峰7设为S峰，对样品中的8个峰进行考察。

6.2、仪器精密度实验

精密称取地榆对照提取物(批号：DYBT180801)1份，按拟定实验方法进行制备，连续进样6次，每次10μl。结果见表11和表12。

表11精密度考察-特征峰保留时间

表12精密度考察-特征峰峰面积

结果表明，精密度考察中，各特征峰保留时间的RSD在0.02％～0.05％，各特征峰峰面积的RSD在0.25％～1.29％。该仪器精密度良好。

6.3、重复性考察

精密称取地榆对照提取物(批号：DYBT180801)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表13和表14。

表13重复性考察—特征峰相对保留时间比值

表14重复性考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00％～0.21％，各特征峰相对峰面积的RSD在1.32％～7.12％。

6.4、中间精密度考察

6.4.1、不同仪器考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取地榆对照提取物(批号：DYBT180801)一份，制备供试品溶液，分别在安捷伦1260、Waters e2695、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为XBridge C18 5μm 4.6×250mm)，见图16、表15和表16。

表15不同仪器考察—特征峰相对保留时间比值

表16不同仪器考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.50％～2.98％；各特征峰相对峰面积的RSD在9.25％～160.61％。

6.4.2、不同人员和时间考察

在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取地榆对照提取物(批号：DYBT180801)各两份，制备供试品，进行测定，见表17和表18。

表17不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值

表18不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.00％～0.09％；各特征峰相对峰面积的RSD在1.54％～18.65％。

6.5、耐用性考察

6.5.1、色谱柱耐用性考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱批号为0180362731(色谱柱1)、0174353301(色谱柱2)、0180362642(色谱柱3)的XBridge C18 5μm 4.6×250mm色谱柱进行考察。见表19、表20和图17。

表19不同色谱柱考察—特征峰相对保留时间比值

表20不同色谱柱考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，用上述3个批号的色谱柱对样品进行检测，峰3分离度较差，其余各特征峰相对保留时间的RSD在0.29％～1.55％；各特征峰相对峰面积的RSD在1.66％～22.16％。

6.5.2、稳定性考察

在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，16h，24h时测定，见表21和表22。

表21精密度考察-特征峰保留时间

表22精密度考察-特征峰峰面积

结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.03％～0.08％，各特征峰峰面积的RSD在0.40％～7.24％。该方法供试品在24小时内稳定性良好。

综上所述，峰3在色谱柱耐用性考察中，无法保证完全分离，暂定将除峰3以外的其余7个特征峰纳入后续考察。

6.6、特征峰的确定及对照图谱的建立

采用拟定的方法对本品15批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。见图18，图18中S1：DYBT180801；S2：DYBT180802；S3：DYBT180803；S4：DYBT180804；S5：DYBT180805；图19，图19中S1：DYBT180806；S2：DYBT180807；S3：DYBT180808；S4：DYBT180809；S5：DYBT180810；图20，图20中S1：DYBT180811；S2：DYBT180812；S3：DYBT180821；S4：DYBT180822；S5：DYBT180824；表23和表24。

表23 15批地榆对照提取物相对保留时间

表24 15批地榆对照提取物相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，15批次地榆对照提取物特征峰相对峰面积的RSD差异较大，因此不列入质量标准正文，15批次地榆对照提取物7个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，与鞣花酸参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.194(峰1)、0.397(峰2)、0.663(峰3)、0.683(峰4)、0.711(峰5)、1.103(峰7)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对15批次地榆对照提取物特征图谱进行合成，建立了地榆对照提取物特征图谱的对照特征图谱，见图5。

实施例4

本实施例是在实施例3的基础上，对地榆对照提取物的质量控制方法中对没食子酸的含量测定。

1、试验仪器与材料

1.1、仪器

高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津LC-20AT型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；

超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；

色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)250*4.6mm、Shim-pack GIST 4.6*250mm、Diamosil5um C18(2)250*4.6mm。

1.2、材料

没食子酸对照品：(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605，纯度90.8％)

甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

地榆对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：DYBT180801、DYBT180802、DYBT180803、DYBT180804、DYBT180805、DYBT180806、DYBT180807、DYBT180808、DYBT180809、DYBT180810、DYBT180811、DYBT180812、DYBT180821、DYBT180822、DYBT180824)。

2、含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05％磷酸溶液(5：95)为流动相进行等度洗脱；检测波长为272nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含30μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％盐酸溶液20ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

含量测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3、供试品溶液制备方法考察

3.1、提取溶剂考察

取本品(批号DYBT180801)8份各0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入水、10％盐酸、甲醇、70％甲醇20ml，回流提取2 h，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取10μl注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取没食子酸含量，结果见表25。

表25不同提取溶剂的分析结果

结果表明，当提取溶剂中有盐酸时，检出没食子酸含量较高，选择10％盐酸作为其提取溶剂。

3.2、进样量考察

取本品(批号DYBT180801)6份，两份0.1g，两份0.2g，两份0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％盐酸溶液20ml，超声提取1h，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取10μl注入色谱仪，分析计算不同提取方式下没食子酸含量，结果见表26。

表26不同取样量分析结果

结果表明，不同取样量的没食子酸含量无明显差异，选择取样量0.2g。

3.3、提取方式考察

取本品(批号DYBT180801)4份各0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％盐酸溶液20ml，2份超声提取、2份回流提取，提取时间均为2 h，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取10μl注入色谱仪，分析计算不同提取方式下没食子酸含量，结果见表27。

表27不同提取方式分析结果

结果表明，回流提取所得没食子酸含量明显大于超声提取，故选择提取方式为回流提取。

3.4、提取时间考察

取本品(批号DYBT180801)8份各约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入10％盐酸20ml，分别超声提取0.5h、1h、2h、3h，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取10μl注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取没食子酸含量，结果见表28。

表28不同提取时间的分析结果

结果表明，在提取时间为2h，即可充分提取。故选择提取时间为2小时。

综上所述，取本品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％盐酸溶液20ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4、方法学考察

4.1、专属性实验

按拟定方法制备供试品溶液及阴性对照溶液，进行检测，结果见图21。

结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。

4.2、仪器精密度考察

取对照品溶液连续进样6次，记录没食子酸的峰面积，计算RSD值，结果见表29。

表29精密度考察结果

结果表明，精密度考察中没食子酸的峰面积RSD值为0.28％，该仪器精密度良好。

4.3、线性关系

精密称取没食子酸对照品适量，加水制备成浓度为190.6982μg/ml的对照品储备液。分别进样1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、15μl、20μl注入液相色谱仪，按拟定实验方法进行测定，分析得到峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标X，相应的峰面积为纵坐标Y，绘制响应曲线，结果见表30和图22。

表30没食子酸标准曲线分析结果

结果表明：没食子酸进样量范围在190.6928～3813.9640μg，线性关系为Y＝3265.4241X-59745.8238，R²＝1.0000。表明在此进样量范围内，呈良好的线性关系。

4.4、稳定性实验

取同一供试品溶液(批号：DYBT180801)，分别在0，3，6，9，12，24 h测定没食子酸色谱峰面积，结果见表31。

表31没食子酸稳定性实验结果

结果表明，在本实验条件下，没食子酸的峰面积RSD值为0.48％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。

4.5、重复性

取同一供试品(批号：DYBT180801)0.2g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见表32。

表32重复性实验结果

结果表明，没食子酸含量的RSD值为0.95％，表明本方法重复性良好。

4.6、中间精密度

取同一供试品(批号：DYBT180801)由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)制备供试品溶液分别在安捷伦1260、岛津LC-20AT、Waters e2695型高效液相色谱仪上进行分析，计算供试品中没食子酸的含量，结果见表33和表34。

表33中间精密度实验结果—不同人员、不同时间

表34中间精密度实验结果—不同仪器

结果表明，没食子酸的含量由不同人员、不同时间测定的RSD值为1.08％，不同仪器测定的RSD值为1.65％，表明本方法中间精密度良好。

4.7、准确度

取已知含量的供试品(批号DYBT180801，没食子酸的含量4.63％)约0.1g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸对照品(纯度：90.8％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表35。计算公式如下：

表35加样回收实验结果

结果表明，没食子酸加样回收率在95.12％～97.81％，回收率结果的RSD值为1.04％，本方法准确度良好。

4.8、样品含量测定验证

以15批地榆对照提取物冻干粉为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算没食子酸的含量，结果见表36和图23。

表36 15批地榆对照提取物没食子酸含量测定结果

结果表明，15批地榆对照提取物没食子酸的含量范围为4.2～5.6％，平均含量为5.0％，SD为0.4％。平均值的70％～130％限量范围为含没食子酸(C₇H₆O₅)3.5％～6.5％。，含量测定均值加减3倍SD的限量范围为含没食子酸(C₇H₆O₅)3.8％～6.2％。本品按干燥品计，含没食子酸(C₇H₆O₅)应为3.5％～6.5％。

实施例5

本实施例是在实施例3的基础上，对地榆对照提取物的质量控制方法中对鞣质的含量测定。

1、试验仪器与材料

1.1、仪器

紫外分光光度计：安捷伦Cary 60型紫外分光光度计；

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)。

1.2、材料

没食子酸对照品：(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605，纯度90.8％)

磷钼钨酸试液；无水碳酸钠；干酪素。

地榆对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：DYBT180801、DYBT180802、DYBT180803、DYBT180804、DYBT180805、DYBT180806、DYBT180807、DYBT180808、DYBT180809、DYBT180810、DYBT180811、DYBT180812、DYBT180821、DYBT180822、DYBT180824)。

2、含量测定

对照品溶液制备：精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸0.05mg)。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml、6ml、5ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标Y，浓度为横坐标X，绘制标准曲线。

供试品溶液的制备：取药材粉末(过四号筛)0.4g，精密称定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置过夜，超声处理10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，弃取初滤液50ml，精密量取续滤液20ml，置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

含量测定：总酚精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

不被吸附的多酚精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃取初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

按下式计算鞣质的含量：鞣质含量＝总酚量-不被吸附的多酚量；

测定时，同时进行干酪素吸附空白试验，计算扣除空白值，且实验过程避光操作。

3、线性关系

精密称取没食子酸对照品50.1152mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸0.0501mg)。精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml、6ml、5ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标Y，浓度为横坐标X，绘制标准曲线，结果见表37和图24。

表37鞣质标准曲线分析结果

结果表明：鞣质浓度范围在1.0023～14.0322μg/mL，线性关系为Y＝0.12760X-0.01901，R²＝0.9981。表明在此进样量范围内，呈良好的线性关系。

4、样品含量测定验证

以15批地榆对照提取物为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，计算鞣质的含量，结果见表38和图25。

表38 15批地榆对照提取物中鞣质含量

结果表明，15批地榆对照提取物鞣质的含量范围为26.7～33.3％，平均含量为29.9％，SD为2.1％。平均值的70％～130％限量范围为含鞣质20.9％～38.9％。，含量测定均值加减3倍SD的限量范围为含鞣质23.6％～36.2％。本品按干燥品计算，含鞣质应为20.0％～39.0％。

实施例6

本实施例提出了地榆炭对照提取物的制备工艺

取地榆炭饮片100g，加水煎煮两次，一煎加10倍水(液面没过饮片高度应为2-5cm)，浸泡30分钟，先用武火煮沸后，改用文火慢煎30分钟，采用200目筛网趁热过滤，滤液在冷水环境下快速冷却至室温；二煎加8倍水(液面没过饮片高度应为2-5cm)，先用武火煮沸后，改用文火慢煎20分钟，采用200目筛网过滤，合并水煎液，滤液在冷水环境下快速冷却至室温，按下表38中的冻干工艺进行真空冷冻干燥后，在温度10-26℃、相对湿度40-60％环境下，按煎煮批次，快速收粉(出膏率范围应为12.0-24.0％)、称量、分装于棕色西林瓶，并封口、贴标签，制得地榆炭对照提取物。

以下是对地榆对照提取物制备工艺的研究。

1、仪器与设备

热风循环烘箱：杭州金竺机械有限公司，CT-C-3型；

全自动切药机：杭州金竺机械有限公司，NCCO-300型；

电子天平：上海方瑞仪器有限公司JY系列百分之一天平；

煎药壶：美味世家全自动分体式陶瓷煎药壶3升；

筛网：九峰筛网200目；

旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂RE-5203；

循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司SHB-B92；

低温冷却液循环泵：郑州长城科工贸有限公司DLSB-5/20；

真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司LGJ-100F；

西林瓶压盖机：SZ20A；

2000ml不锈钢量杯若干；西林瓶：10ml，30ml，50ml若干。

2、前处理工艺研究

参考《中国药典》2020年版一部地榆【炮制】项下相关规定及第四部通则0213炮制通则相关规定进行炮制，具体方法为：除取杂质；未切片者，洗净，除取残茎，润透，切厚片，干燥。得净地榆片，照炒炭法炒至表面焦黑色、内部棕褐色。

15批次地榆药材按相关规定炮制为地榆炭饮片，作为制备地榆炭对照提取物的原料药。

3、制备工艺研究

3.1、提取溶媒

依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，确定地榆炭对照提取物的制备提取溶媒为水。

3.2、取样量

用于制备地榆炭对照提取物的饮片取样量定为100g。

3.3、加水量

按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》等相关规定，加水量一般以浸过药面2-5厘米为宜，但不同饮片吸水率有差异，因此需了解地榆炭的吸水率进而为加水量做参考。

取同一批号地榆炭50g(批号：DYT180801)，2份，隔一定时间测定饮片的重量，计算吸水率，结果见表39，吸水率曲线见图26。

表39地榆炭吸水率数据

由地榆炭的吸水率曲线可知其炒炭后吸水较为缓慢，前1h吸水较为急剧，吸水约为1.5倍。

取饮片100g(批号：DYT180801)于煎药壶，分别加入不同量的水，观察水面没过饮片的高度，结果见表40。

表40不同加水量液面高度

参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(征求意见稿)、《医疗机构中药煎药室管理规范》相关规定，液面没过饮片高度应为2-5cm，同时参考其吸水率。最终确定地榆炭对照提取物一煎加水量为10倍，二煎加水量为8倍。

3.4、浸泡

依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，待煎饮片应当先行浸泡，浸泡时间应根据饮片的质地确定，一般不少于30min。确定浸泡时间为30min。

3.5、煎煮次数

依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，煎煮次数定为2次。

3.6、煎煮时间

地榆炭属于凉血止血药，一般类，按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中对照提取物制备的规定：煎煮时间应当根据方剂的功能主治和药物的功效确定。一般药物煮沸后再煎煮20-30分钟；解表类、清热类、芳香类药物不宜久煎，煮沸后再煎煮15-20分钟；滋补药物先用武火煮沸后，改用文火慢煎约40-60分钟。药剂第二煎的煎煮时间应当比第一煎的时间略缩短。确定地榆炭对照提取物第一煎先用武火煮沸后，改用文火慢煎30min，第二煎先用武火煮沸后，改用文火慢煎25min。

3.7、固液分离

按照汤剂煎出液应趁热进行固液分离，滤材目数应在100目以上的原则，考察煎出液过滤情况。采用200目筛网过滤后，过滤顺利，药液澄明，无明显固形沉淀物，确定滤材目数为200目。

3.8、真空冷冻干燥

根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中对照提取物要求，对对照提取物干燥过程推荐采用真空冷冻干燥方法制备为宜，可保证其质量的稳定和易于溶解及免加辅料。真空冷冻干燥工艺参数见表41和图27。

表41真空冻干工艺

实施例7

本实施例涉及15批地榆炭对照提取物的制备。按照实施例6所述的制备工艺，取15批地榆炭饮片制备地榆炭对照提取物。

2、来源

根据《中国药典》2020年版一部地榆炭项下相关规定，本品为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.的干燥根的炮制品。

按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的要求共收集15批来自甘肃、陕西等省的地榆药材，并按相关规定炮制为地榆炭饮片。药材与饮片经检测均符合2020版《中国药典》的要求，见表42。

表42地榆药材来源信息表

2、性状

各批次地榆炭对照提取物性状分别见表43。

表43地榆炭对照提取物性状检查结果

3、出膏率

按照拟定的对照提取物制备方法进行对照提取物的制备，所得地榆炭对照提取物出膏率见表44。

表44 15批地榆炭对照提取物制备数据汇总

由表44可知15批地榆炭对照提取物出膏率，实测范围为14.2-22.3％，平均值为18.1％，SD值为2.1。平均值的70-130％的范围为12.7-23.5％，平均值加减3倍SD范围11.7-24.5％，确定地榆炭对照提取物出膏率范围应为12.0-24.0％。

4、水分

按照《中国药典》2020年版四部通则0832第二法)进行测定，测定结果，见表45。

表45 15批地榆炭对照提取物水分测定结果

结果表明，地榆炭对照提取物水分在2.7％-7.3％范围之内，平均值为5.4％。照《中国药典》2020年版通则0832水分测定法第二法进行测定，不得大于8.0％。

实施例8

本实施例是对地榆炭对照提取物的质量控制方法。

1、实验仪器与材料

高效液相色谱仪：岛津LC20-AD型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters2695-e2998型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；

超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；

色谱柱：Waters XBridge C18 5μm 4.6×250mm。

2、试剂及试药

甲纯、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

没食子酸(中国食品药品检定研究员，批号：110831-201605，含量以90.8％计)；

鞣花酸(中国食品药品检定研究员，批号：111959-201602，含量以89.3％计)；

5-羟甲基糠醛(成都普菲生物技术有限公司，批号：17011104)；

地榆(地榆)对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121286-201703)。

地榆炭对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：DYTBT180801、DYTBT180802、DYTBT180803、DYTBT180804、DYTBT180805、DYTBT180806、DYTBT180807、DYTBT180808、DYTBT180809、DYTBT180810、DYTBT180811、DYTBT180812、DYTBT180821、DYTBT180822、DYTBT180824)。

3、特征图谱

参照物溶液的制备：取地榆对照药材0.5g，所述地榆对照药材为地榆(地榆)对照药材，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取鞣花酸对照品适量，精密称定，分别加60％甲醇制成每1ml含鞣花酸0.1mg的溶液，作为对照品参照物溶液。

供试品溶液的制备：取本品0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定：精密吸取对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表46的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为272nm，流速为1.0ml/min，理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000，测定，即得。

表46梯度脱洗

以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建地榆炭对照提取物的特征图谱，见图28。

4、色谱条件与系统适用性试验

4.1、波长

在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液3D图以及在220nm、250nm、272nm、300nm、320nm、360nm波长下的色谱图。结果见图29。

结果表明，在检测波长为272nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为272nm。

4.2、柱温考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察，见图30、表47和表48。

表47柱温考察—特征峰相对保留时间比值

表48柱温考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，各特征峰相对保留时间RSD值为0.22％-4.52％，柱温对色谱峰的相对保留时间影响不大，柱温在25℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故最终选择25℃作为地榆炭对照提取物特征图谱方法学的后续考察柱温。

4.3、流速考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2 ml/min时进行了考察，见图31、表49和表50。

表49流速考察—特征峰相对保留时间

表50流速考察—特征峰相对峰面积

结果表明，流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时，各特征峰的相对保留时间RSD为0.99％～12.96％，在流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。

综上所述，地榆炭对照提取物特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表46中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为272nm。理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。

5、供试品溶液的制备考察

5.1、提取方法考察

取本品(批号：DYTBT180801)0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间20min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图32。

结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。

5.2、提取溶剂考察

取本品(批号DYTBT180801)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、50％甲醇、70％甲醇、水、2％盐酸50ml时进行考察，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图33。

结果表明，提取溶剂中水作为提取溶剂时色谱峰信息量大，故供试品提取溶剂确定为水。

5.3、提取时间考察

取本品(批号DYTBT180801)0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为10分钟、20分钟、30分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图34。

结果表明，在提取时间为30分钟时，即可充分提取，故供试品提取时间确定为30分钟。

5.4、溶媒量

比较了溶媒量25ml、50ml、100ml，最终选择溶媒量50ml，见图35。

结果表明，在溶媒量为50ml时，即可充分提取。故供试品溶媒量为50ml。

综上所述，地榆炭对照提取物特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

6、方法学考察

6.1、专属性考察

供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备地榆炭对照提取物供试品溶液。

参照物溶液的制备：取地榆(地榆)对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，超声处理20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取鞣花酸对照品适量，加60％甲醇制成每1ml含100μg的溶液，作为对照品参照物溶液。再取没食子酸对照品、5-羟甲基糠醛对照品适量，加水制成每1ml分别含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液，即得。

阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺地榆炭对照提取物阴性对照溶液。

对地榆炭对照提取物特征图谱峰进行定位，见图36。

6.2、仪器精密度实验

取地榆炭对照提取物(批号：DYTBT180801)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积，见表51表52。

表51精密度考察-保留时间

表52精密度考察-峰面积

结果表明，该仪器精密度良好。

6.3、重复性考察

精密称取地榆炭对照提取物(批号：DYTBT180801)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表53和表54。

表53重复性考察-相对保留时间比值

表54重复性考察-相对峰面积比值

结果表明，该方法重复性良好。

6.4、中间精密度考察

6.4.1、不同仪器考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取地榆炭对照提取物(批号：DYTBT180801)两份，制备供试品溶液，分别在岛津LC-20AD、Waters2695-e2998、安捷伦1260型高效液相色谱仪上进行测定，见图37、表55和表56。

表55仪器耐用性考察-相对保留时间比值

表56仪器耐用性考察-相对峰面积比值

结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.15％～2.63％范围类。不同仪器耐用性较好。

6.4.2、不同人员和时间考察

在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取地榆炭对照提取物(批号：DYTBT180801)各两份，制备供试品，进行测定。见表57和表58。

表57人员和时间考察-相对保留时间比值

表58人员和时间考察-相对峰面积比值

结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。

6.5、耐用性考察

6.5.1、色谱柱耐用性考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱批号为0180362731(色谱柱1)、0174353301(色谱柱2)、0180362642(色谱柱3)的Waters XBridge C18 5μm 4.6×250mm色谱柱进行考察。见图38，表59和表60。

表59不同色谱柱考察—特征峰相对保留时间比值

表60不同色谱柱考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，用上述3个批号的色谱柱对样品进行检测，峰3分离度较差，其余各特征峰相对保留时间的RSD在0.29％～1.55％；各特征峰相对峰面积的RSD在1.66％～22.16％。

6.5.2、稳定性考察

在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，6h，9h，12h，24h时测定，见表61和表62。

表61稳定性考察-保留时间

表62稳定性考察-峰面积

结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.14％～1.52％，样品溶液在24小时内较稳定。

综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述9个特征峰纳入后续考察。

6.6、特征峰的确定及对照图谱的建立

采用此方法，在15批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间和相对峰面积，见图39，图39中S1～S15分别为DYTBT180801、DYTBT180802、DYTBT180803、DYTBT180804、DYTBT180805、DYTBT180806、DYTBT180807、DYTBT180808、DYTBT180809、DYTBT180810、DYTBT180811、DYTBT180812、DYTBT180821、DYTBT180822、DYTBT180824；表63和表64。

表63 15批地榆炭对照提取物相对保留时间

表64 15批地榆炭对照提取物相对峰面积

方法学各考察项目及验证结果汇总见表65和表66。

表65方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间

表66方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，由上表可知流速对相对保留时间的影响较大，故流速定为1ml/min，为了增加方法的重现性和适用性，规定值范围定为±10％。

最终规定：供试品色谱中应呈现9个特征峰，其中峰1、峰3～峰9应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰相对应，与鞣花酸参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.198(峰1)、0.265(峰2)、0.404(峰3)、0.686(峰4)、0.719(峰5)、0.826(峰6)、1.105(峰8)、1.241(峰9)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对15批地榆炭对照提取物特征图谱进行合成，建立了地榆炭对照提取物特征图谱的对照特征图谱，见图28。

实施例9

本实施例是在实施例7的基础上，对地榆炭对照提取物的质量控制方法中对没食子酸的含量测定。

2、试验仪器与材料

1.1、仪器

高效液相色谱仪：岛津LC-20AT型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、MS205DΜ、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；

超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；

色谱柱：Agilent 5TC-C18 250×4.6mm、Shim-pack GIST 4.6*250mm、Diamosil5um C18250*4.6mm。

1.2、材料

没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605，纯度90.8％)；

甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2、含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05％磷酸溶液(5：95)为流动相进行等度洗脱；检测波长为272nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含30μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％盐酸溶液20ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

含量测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3、供试品溶液制备方法考察

3.1、提取溶剂考察

取本品(批号DYTBT180801)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入水、10％盐酸、甲醇、70％甲醇20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)1小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取10μl注入色谱仪，分析计算不同提取方式没食子酸含量。结果见表67。

表67不同提取溶剂的分析结果

结果表明，以10％盐酸提取时，没食子酸含量为4.44％左右，明显大于水、甲醇、70％甲醇提取，故以10％盐酸作为其提取溶剂。

3.2、进样量考察

取本品(批号DYTBT180801)各约0.1g、0.2g、0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入10％盐酸20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)1小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表68。

表68取样量考察

结果表明，取样量为0.2g时，没食子酸含量高于0.1g、0.3g，拟选定取样量为0.2g。

3.3、提取方式考察

取本品(批号DYTBT180801)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％盐酸溶液20ml，分别超声、回流2h，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取10μl注入色谱仪，分析计算不同提取方式下没食子酸含量，结果见表69。

表69不同提取方式分析结果

结果表明，回流提取所得没食子酸含量明显大于超声提取，故选择提取方式为回流提取。

3.4、提取时间考察

取本品(批号DYTBT180801)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入10％盐酸20ml，分别超声提取0.5h、1h、2h、3h，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取10μl注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取没食子酸含量。结果见表70。

表70不同提取时间的分析结果

结果表明，提取时间为0.5h、1h、2h、3h，没食子酸含量相差不大，而根据《中国药典》2020版地榆含测方法提取时间为2h。故选择提取时间为2小时。

综上所述，地榆炭对照提取物含量测定供试品制备方法确定如下：取本品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％盐酸溶液20ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4、方法学考察

4.1、专属性实验

按拟定方法制备供试品溶液及阴性对照溶液，进行检测，结果见图40。

结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。

4.2、仪器精密度考察

取对照品溶液连续进样6次，记录没食子酸的峰面积，计算RSD值，结果见表71。

表71精密度考察结果

结果表明，精密度考察中没食子酸的峰面积RSD值为0.13％，该仪器精密度良好。

4.3、线性关系

精密称取没食子酸对照品适量，加水制备成浓度为0.1907mg/ml的对照品储备液。分别进样1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、15μl、20μl注入液相色谱仪，按拟定实验方法进行测定，分析得到峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标X，相应的峰面积为纵坐标Y，绘制响应曲线，结果见表72和图41。

表72没食子酸标准曲线分析结果

结果表明：没食子酸进样量范围在0.1907～3.8140μg，线性关系为y＝3047463.5909 x-86124.8811，R2＝0.9999。表明进样量在此范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

4.4、重复性

取同一供试品(批号DYTBT180801)0.2g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见表73。

表73重复性实验结果

结果表明，没食子酸含量的RSD值为1.42％，本方法重复性良好。

4.5、不同仪器考察

在以上拟定的实验条件基础上，精密称取地榆炭对照提取物(批号DYTBT180801)两份，制备供试品溶液，分别在岛津LC-20AT、安捷伦1260、Waters2998-e2695型高效液相色谱仪上进行考察(色谱柱均为Agilent 5 TC-C18 250×4.6mm)。计算没食子酸含量，所得结果，见表74。

表74不同仪器实验结果

结果表明，没食子酸的含量测定结果RSD值为1.5％，本方法中间精密度良好。

4.6、不同人员和时间考察

在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取地榆炭对照提取物(批号DYTBT180801)，制备供试品，进行测定。计算所得没食子酸含量结果，见表75。

表75不同人员与时间考察结果

结果表明，没食子酸的含量测定结果RSD值为1.34％，本方法中间精密度良好。

4.7、加样回收率

取已知含量的供试品(批号DYTBT180801，没食子酸的含量6.43％)约0.1g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸对照品(纯度：99.4％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表76。计算公式如下：

表76加样回收实验结果

结果表明，回收率平均值为101.49％，结果的RSD值为0.28％，本方法准确度良好。

4.8、样品含量测定验证

以地榆炭对照提取物为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算没食子酸的含量，结果见表77。

表77 15批地榆炭对照提取物没食子酸含量

结果表明，地榆炭对照提取物中没食子酸的含量为3.76～6.40％，平均含量为5.25％，SD值为0.7％。本品按干燥品计算，含量测定平均值的70％-130％限量为含没食子酸(C₇H₆O₅)3.68％-6.83％，平均值加减3倍SD值的限量范围为含没食子酸(C₇H₆O₅)3.14％-7.36％。本品按干燥品计算，含没食子酸(C₇H₆O₅)应为3.1％-7.4％。

实施例10

本实施例是在实施例8的基础上，对地榆炭对照提取物的质量控制方法中对鞣质的含量测定。

1、试验仪器与材料

1.1、仪器

紫外分光光度计：安捷伦Cary 60型紫外分光光度计；

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)。

1.2、材料

没食子酸对照品：(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605，纯度90.8％)

磷钼钨酸试液；无水碳酸钠；干酪素。

地榆炭对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：DYTBT180801、DYTBT180802、DYTBT180803、DYTBT180804、DYTBT180805、DYTBT180806、DYTBT180807、DYTBT180808、DYTBT180809、DYTBT180810、DYTBT180811、DYTBT180812、DYTBT180821、DYTBT180822、DYTBT180824)。

2、含量测定

对照品溶液制备：精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸0.05mg)。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

供试品溶液的制备：取本品粉末0.4g，精密称定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置过夜，超声处理10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，弃去初滤液50ml，精密量取续滤液20ml，置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

含量测定：总酚精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的浓度(μg/mL)，计算没食子酸的量，即得。

不被吸附的多酚精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的浓度(μg/mL)，计算没食子酸的量，即得。

按下式计算鞣质的含量：鞣质含量＝总酚量-不被吸附的多酚量；

测定时，同时进行干酪素吸附空白试验，计算扣除空白值，且实验过程避光操作。

3、线性关系

精密称取没食子酸对照品50.1152mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸0.0501mg)。精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml、6ml、5ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标Y，浓度为横坐标X，绘制标准曲线，结果见表78和图42。

表78鞣质标准曲线分析结果

结果表明：鞣质浓度范围在1.0023～14.0322μg/mL，线性关系为Y＝0.12760X-0.01901，R²＝0.9981。表明在此进样量范围内，呈良好的线性关系。

4、样品含量测定验证

以15批地榆炭对照提取物为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，计算鞣质的含量，结果见表79。

表79 15批地榆炭对照提取物鞣质含量

结果表明，地榆炭对照提取物中鞣质的含量为13.29～29.90％，平均含量为21.19％，SD值为4.56％。本品按干燥品计算，含量测定平均值的70％-130％限量为含鞣质14.83％-27.55％，平均值加减3倍SD值的限量范围为含鞣质7.52％-34.86％。根据以上结果，确定本品按干燥品计算，含鞣质应为14.0％-28.0％。

Claims (2)

1.地榆炭对照提取物的制备工艺的质量控制方法，其特征在于：包括构建所述地榆炭对照提取物的特征图谱、地榆炭对照提取物中鞣质的含量进行测定和地榆炭对照提取物中没食子酸的含量进行测定，步骤如下：

构建地榆炭对照提取物的特征图谱：

步骤A4. 分别制备地榆对照药材的参照物溶液和地榆炭对照提取物的供试品溶液；

参照物溶液的制备包括：取地榆对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液，另取鞣花酸对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成每1ml含100μg的溶液，取没食子酸对照品适量，加水制成每1ml分别含30μg的溶液，取5-羟甲基糠醛对照品适量，加水制成每1ml分别含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液；

供试品溶液的制备包括：取地榆炭对照提取物0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

步骤B4. 分别取参照物溶液和供试品溶液，按高效液相色谱法进行测定，得到对应的特征图谱；

按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱满足以下条件：0-15min，流动相A5→20%；15-25min，流动相A20→30%；25-55min，流动相A30→75%；柱温为25℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为272nm，理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000；

步骤C4. 以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建地榆炭对照提取物的特征图谱；

地榆炭对照提取物中鞣质的含量进行测定：

对照品溶液制备：精密称取没食子酸对照品，制得每1ml中含没食子酸0.05mg的对照品溶液；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：取地榆炭对照提取物0.4g，精密称定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置过夜，超声处理10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置，滤过，弃去初滤液50ml，精密量取续滤液20ml，置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得；

含量测定：总酚 精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的浓度，计算没食子酸的量，即得；

不被吸附的多酚 精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的浓度，计算没食子酸的量，即得；按下式计算鞣质的含量：鞣质含量=总酚量-不被吸附的多酚量；

测定时，同时进行干酪素吸附空白试验，计算扣除空白值，且实验过程避光操作；

地榆炭对照提取物中没食子酸的含量进行测定：

步骤A5. 照高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05%磷酸溶液为流动相进行等度洗脱；检测波长为272nm，理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备 取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含30μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备 取地榆炭对照提取物0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10%盐酸溶液20ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

步骤B5 含量测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的地榆炭对照提取物的制备工艺的质量控制方法，其特征在于：所述共有峰包括9个特征峰。

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