KR101821747B1 - 고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법 - Google Patents

고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101821747B1
KR101821747B1 KR1020150066953A KR20150066953A KR101821747B1 KR 101821747 B1 KR101821747 B1 KR 101821747B1 KR 1020150066953 A KR1020150066953 A KR 1020150066953A KR 20150066953 A KR20150066953 A KR 20150066953A KR 101821747 B1 KR101821747 B1 KR 101821747B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sample
candidate
complex
column
target
Prior art date
Application number
KR1020150066953A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160133873A (ko
Inventor
최용수
판철호
오상록
김형석
양중석
김상민
신정숙
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020150066953A priority Critical patent/KR101821747B1/ko
Publication of KR20160133873A publication Critical patent/KR20160133873A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101821747B1 publication Critical patent/KR101821747B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

본 발명에 따른 HPLC 장치 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 의하면 별도의 시료 전처리 과정을 생략하여 신속하게 신약 후보 물질을 스크리닝할 수 있다.

Description

고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법{High performance liquid chromatography apparatus and method for screening substance using thereof}
고속 액체 크로마토그래피 장치, 및 이를 이용한 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
식·의약품 바이오 산업화를 위한 제품 개발은 전 임상 단계와 임상 단계의 연구 개발로 크게 나눌 수 있으며 전 임상 단계의 연구는 다시 표적 물질의 확인과 검증, 표적 물질에 대한 활성 물질의 탐색, 활성 물질의 최적화, 및 동물 실험으로 나눌 수 있다. 활성 물질 탐색 단계는 검증된 표적 단백질 및 효소 혹은 표적 세포에 대하여 수천 혹은 수십만 종류의 라이브러리 물질 또는 천연 물질 중 활성 물질을 찾아내고 분류하는 연구단계로서 이러한 연구개발을 위해서 수많은 시간과 비용, 그리고 노동력이 집중되어야 한다. 최근에는 많은 논문이나 특허에서 질량분석법을 이용한 약물이나 물질의 활성탐색에 대한 연구개발이 보고되고 있다.
물질의 활성 탐색 방법으로서, ELISA법과 질량분석법이 대표적으로 사용되고 있다. ELISA법은 용매에 의한 시료 전처리 과정 없이 표적 물질을 측정을 함으로써 물질의 활성 여부를 판단할 수 있지만 여러 종류의 표적 물질을 동시에 측정할 수 없으며 1개의 종에 대하여 1개씩 측정해야 한다는 단점이 있다. 무엇보다도 ELISA방법은 비용이 많이 소요되며 세포 종류에 따른 교차 반응의 문제점으로 대량의 물질 탐색에는 적용할 수 없다. ELISA법은 주로 몇 가지 화합물에 대하여 혹은 이미 알려진 활성물질에 대한 세포 내에 활성 작용을 확인하기 위한 방법으로 주로 사용된다. 액체 크로마토그래피/질량분석기(LC/MS)법은 감도가 우수하며 ELISA법과 달리 모든 표적 물질을 동시에 분석하는 것이 가능하고, 현재까지 가장 정확한 측정 방법으로 알려져 있다. 그러나, LC/MS법은 세포 시료에 존재하는 표적 물질을 측정하기 위해 상당히 복잡한 시료 전처리 과정과 용매 추출법이 사용되어야 하므로 탐색 처리 능력의 한계가 있고, 대량의 시료 탐색이 불가능하였다.
따라서, ELISA법의 비용 문제를 해결하고 LC/MS법의 시료 전처리 과정을 완전히 제거하여 신속하고 경제적으로 대량의 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 개발할 필요가 있다.
일 양상은 신규한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 장치를 제공한다.
다른 양상은 신규한 고속 액체 크로마토그래피 장치를 이용한 후보 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
일 양상은 고속 액체 크로마토그래피(High Performance liquid chromatography: HPLC) 장치를 제공한다.
상기 장치는,
표적 세포와 후보 물질을 포함하는 시료에서, 후보 물질에 의해 표적 세포로부터 생산된 표적 물질을 포함하는 제2 시료를 분리해 내기 위한 제1 칼럼;
상기 제2 시료에서 표적 물질을 분리하기 위한 제2 칼럼;
상기 분리된 표적 물질을 분석하기 위한 분석기를 구성으로서 포함할 수 있다.
상기 표적 물질은 단백질, 탄수화물, 지질, 또는 이의 조합일 수 있다. 상기 단백질은 효소, 항체, 또는 항원 또는 이의 조합일 수 있다. 상기 표적 물질은 반응물 중 표적 물질의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM, 약 0.25 μM 내지 약 8 μM, 약 0.5 μM 내지 약 6 μM, 약 0.75 μM 내지 약 4 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 2 μM일 수 있다.
상기 표적 물질은 표적 세포 자체, 표적 세포 내에 포함된 물질, 또는 표적세포가 생산하는 물질일 수 있다. 상기 시료에는 표적 물질로서 표적 세포를 포함하는 표적 세포 또는 표적 물질을 생산하는 표적 세포가 포함될 수 있다. 상기 표적 세포는 염증 세포, 신경 세포, 암세포, 상피 세포, 면역 세포, 생식 세포, 근육 세포, 줄기 세포, 내피 세포, 또는 혈구일 수 있다. 표적 세포의 농도는 약 10개/웰 내지 약 108개/웰, 약 102개/웰 내지 약 107개/웰, 약 103개/웰 내지 약 106개/웰, 또는 약 104개/웰 내지 약 105개/웰일 수 있다.
상기 시료는 물, 증류수, 식염수, 또는 완충액을 포함할 수 있다. 완충액의 종류와 pH는 제한되지 않고, 방부제, 염, 또는 글리세롤을 포함한 안정화 물질을 포함할 수 있다.
상기 시료는 하나 이상의 후보 물질을 포함하는 혼합물, 천연물, 추출물, 분획물, 또는 이의 조합일 수 있다. 혼합물은 용액 상태로서 약 2종 이상, 5종 이상, 10종 이상, 50종 이상, 100종 이상, 200종 이상, 300종 이상, 400종 이상, 및 500종 이상의 화학 물질이 혼합된 것일 수 있다. 상기 천연물은 약리 활성이나 생리 활성이 있어 신약 탐색이나 신약 디자인에 도움을 주는 생물에 의하여 만들어지는 물질을 말한다. 천연물의 농도는 약 0.1 ng/mL 내지 약 1000 ㎍/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 200 ㎍/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 100 ng/mL 내지 약 10 ㎍/mL일 수 있다. 시료는 천연물로부터 추출된 추출물, 및 추출물을 용매로 분획하여 수득한 분획물을 포함할 수 있다. 추출물 또는 분획물의 농도는 약 1 ㎍/mL 내지 약 1 mg/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 900 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL 내지 약 800 ㎍/mL, 또는 약 300 ㎍/mL 내지 약 600 ㎍/mL일 수 있다. 상기 시료의 부피는 약 10 ㎕ 내지 약 5 mL, 약 50 ㎕ 내지 약 4 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 3 mL, 또는 약 150 ㎕ 내지 약 2 mL일 수 있다.
상기 후보 물질은 신약 후보 물질일 수 있다. 상기 후보 물질은 상기 표적 물질에 결합 또는 영향을 미치는 화학 물질일 수 있다. 상기 표적 물질과 후보 물질의 결합은 후보 물질이 표적 물질의 생화학적, 또는 생리학적 반응을 유도, 평형 상태를 유지 또는 종결할 수 있다. 상기 표적 세포 내 표적 물질의 생산은 상기 후보 물질에 의해 활성화되거나 또는 저해될 수 있다. 상기 후보 물질은 표적 세포의 신호전달 경로를 활성시키거나, 또는 저해하여 표적 세포의 표적 물질 생산을 변경 하는 것일 수 있다. 상기 결합은 유리 바이알, 실험용 튜브, 플레이트 또는 이들의 조합에서 수행될 수 있다.
상기 장치는 표적 물질과 후보 물질을 포함하는 시료가 주입되는 시료 주입장치를 더 포함할 수 있다. 상기 시료 주입장치는 수동 또는 자동으로 HPLC 장치 내에 시료를 주입할 수 있다. 상기 시료 주입장치는 2개 내지 96개, 또는 그 이상의 시료를 자동으로 주입하는 장치일 수 있다. 상기 장치에서, 상기 시료는 HPLC 펌프에 의해 약 1 mL/분 내지 5 mL/분의 속도로 액체 크로마토그래피 칼럼으로 전달될 수 있다.
상기 칼럼은 흡착, 분배, 이온 교환, 크기 배제, 또는 친화 크로마토그래피를 수행하기 위한 충진제로 충진된 것일 수 있다. 분리하고자 하는 물질의 성질에 따라, 그 물질을 분리하기 위한 흡착, 분배, 이온 교환, 크기 배제, 또는 친화 크로마토그래피가 수행될 수 있다. 상기 칼럼은 비드로 충진된 것일 수 있다. 비드는 예를 들어 실리카 또는 폴리머일 수 있다. 상기 비드의 직경은 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛일 수 있다.
상기 표적 물질은 액체 크로마토그래피 펌프에 의해 액체 크로마토그래피 칼럼으로 전달된 후 액체 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출될 수 있다. 액체 크로마토그래피에 사용되는 용매는 2가지 이상의 용매의 혼합물일 수 있다. 상기 용매는 예를 들어 물과 메탄올의 혼합물, 또는 물과 아세토니트릴의 혼합물일 수 있다. 용매의 농도 구배 기울기는 약 1% 내지 99%일 수 있다.
상기 장치의 구성들의 연결을 위한 스위칭 밸브를 포함할 수 있다. 상기 구성들은 스위칭 밸브에 연결될 수 있다. 상기 스위칭 밸브는 각각의 구성요소에 연결되기 위한 포트를 포함할 수 있다. 상기 포트는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 이상의 개수로 구성될 수 있다. 상기 각각의 포트는 다른 하나의 포트와 연결될 수 있다. 이에 의해, 상기 구성들은 스위칭 밸브의 포트를 통하여 다른 구성과 연결될 수 있다.
상기 각각의 포트는 상기 스위칭 밸브의 작동에 의해 조작 전 연결된 구성과는 다른 구성과 연결될 수 있다. 이에 의해, 상기 각각의 구성은 스위칭 밸브의 포트를 통하여 하나 이상의 다른 구성과 연결될 수 있다. 상기 포트는 상기 구성에 연결되지 않을 수 있다. 상기 구성에 연결되지 않은 포트는 유체를 밖으로 배출하기 위한 배출구로 연결될 수 있다. 상기 연결은 전기적으로 제어 가능한 것일 수 있다. 상기 밸브의 제어는 수동, 또는 유체의 흐름에 따라 자동으로 이루어질 수 있다. 상기 밸브는 폴리에테르 에테르 케톤(polyether ether ketone: PEEK) 튜브, 또는 스테인리스 튜브를 사용하여 연결된 것일 수 있다.
상기 장치는 해리 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 해리 장치는 전원 제어 모듈을 포함하는 것일 수 있다. 상기 해리 장치는 전원 제어 모듈에 의해 전기적 신호에 따라 전원이 제어될 수 있다. 해리 장치는 표적 물질이 단백질, 탄수화물, 또는 지질인 경우에 사용될 수 있다. 표적 세포가 사용되는 경우에는 상기 스위칭 밸브에 의해 해리 장치를 우회하여 사용하지 않을 수 있다. 예를 들어, 후보 물질로 인해 표적 세포가 표적 물질을 생성하는 경우라면 후보 물질이 표적 세포의 수용체에 결합된 후보 물질-표적 세포 복합체를 해리하는 과정 없이도 표적 물질을 검출할 수 있다. 해리 장치는 스테인리스로 제조된 것 또는 시장에서 구입 가능한 상업용 제품일 수 있다. 상기 해리 장치는 초음파 발생기를 포함하는 것인 장치일 수 있다. 상기 초음파 발생기는 약 20W의 초음파를 방출하는 것일 수 있다. 상기 해리 장치는 해리가 일어나는 해리 챔버를 포함하는 것일 수 있다. 상기 해리 챔버의 내부 부피는 약 20 ㎕ 내지 2000 ㎕일 수 있다.
상기 분석기는 UV 분석기, IR 분석기, 굴절율 분석기, 형광 분석기, 전도도 분석기, 질량 분석기(MS), 전기화학 분석기, 다이오드 어레이 분석기, 또는 이들의 결합일 수 있다.
일 양상은 HPLC가 수행되는 장치를 제공한다.
상기 장치는 시료 내 표적 물질과 후보 물질이 결합하여 형성된 표적 물질-후보 물질 복합체를 분리하여 제2 시료를 제조하기 위한 제1 칼럼;
상기 제2 시료 내의 분리된 표적 물질-후보 물질 복합체를 해리시키기 위한 해리 장치;
상기 제2 시료 내의 해리된 표적 물질 및 후보 물질을 분리하기 위한 제2 칼럼; 및
분리된 후보 물질을 분석하기 위한 분석기를 구성으로서 포함할 수 있다.
상기 장치에서 언급된 용어 또는 요소(element) 중 상기 설명에서 이미 언급된 것과 같은 것은, 그 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상은 후보 물질에 의해 표적 세포로부터 생산된 표적 물질을 검출하여, 표적 세포에 대한 활성이 있는 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 표적 세포와 후보 물질을 포함하는 제1 시료를 배양하여 표적 세포가 표적 물질을 생산케 하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 제1 시료에 제1 크로마토그래피를 수행하여, 제1 시료로부터 표적 물질을 포함하는 제2 시료를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 표적물질을 포함하는 제2 시료에 제2 크로마토그래피를 수행하여 상기 표적 물질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 분리된 표적 물질을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 HPLC 장치에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소(element) 중 청구된 장치에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 청구된 장치에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상은 표적 물질과 결합하는 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 표적 물질과 후보 물질을 포함하는 제1 시료를 배양하여 표적 물질-후보 물질 복합체를 형성시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 복합체가 형성된 제1 시료에 제1 크로마토그래피를 수행하여 시료로부터 복합체를 분리하고, 상기 분리된 복합체를 포함하는 제2 시료를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 제2 시료에 포함된 복합체를 표적 물질 및 후보 물질로 해리시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 해리시키는 단계는 제2 시료에 포함된 복합체에 초음파를 가하여 해리시키는 단계일 수 있다. 상기 초음파는 20W 이상의 초음파일 수 있다. 상기 초음파는 약 10초 내지 5분, 30초 내지 3분, 1분 내지 2분 이상 복합체에 가해질 수 있다. 해리된 표적 물질은 제거될 수 있다.
상기 방법은 상기 해리된 표적 물질 및 후보 물질을 포함하는 상기 제2 시료에 제2 크로마토그래피를 수행하여 후보 물질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 분리된 후보 물질을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기한 HPLC 장치에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소(element) 중 청구된 장치에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 청구된 장치에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 HPLC 장치는 별도의 시료 전처리 과정을 생략하여 신속하게 신약 후보 물질을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 스크리닝 방법에 의하면 신속하게 신약 후보 물질을 스크리닝할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 DFC-LC/MS 장치 및 제1 크로마토그래피에서의 유체 흐름을 나타내는 모식도이다. 빨간선은 제1 HPLC 펌프에 의한 유체 흐름, 초록선은 제2 HPLC 펌프에 의한 유체 흐름을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 DFC-LC/MS 장치 및 제2 크로마토그래피에서의 유체 흐름을 나타내는 모식도이다. 빨간선은 제1 HPLC 펌프에 의한 유체 흐름, 초록선은 제2 HPLC 펌프에 의한 유체 흐름을 나타낸다.
도 3a는 ELISA법, 일반적인 용매추출법인 LLE 시료 전처리 후 LC/MS법, 및 DFC-LC/MS법을 이용하여 PGE2를 정량한 결과를 나타내고, 도 3b는 LLE 시료 전처리 후 LC/MS법, 및 DFC-LC/MS법을 사용하여 PGD2를 정량한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 천연물 물질을 첨가한 경우 생성된 PGE2의 양을 ELISA법 및 DFC/LC로 측정하고, 그 결과를 양성 대조군 LPS를 첨가한 경우 생성된 PGE2의 양에 대비한 백분율로 나타내는 도면이다.
도 5a는 2시간 또는 15 시간 동안 PPAR-γ와 로시글리타존을 배양시킨 후 DFC-LC/MS에서 수득된 로시글리타존의 질량분석 결과를 나타내는 그래프이고, 도 5b는 4℃에서 보관한 시간에 따라 DFC-LC/MS에서 수득된 로시글리타존의 양을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 동적 흐름 크로마토그래피-액체 크로마토그래피/질량분석( DFC -LC/MS) 장치의 제조
액체 크로마토그래피의 제1 칼럼(10)은 직경 50~100㎛의 비드 (Zr-Si, 세노텍)를 직경 ~ 0.2cm, 길이 3cm의 칼럼에 채우고, ~ 50% 수용성 메탄올로 평형화시켰다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 제1 칼럼(10)의 일 측면에는 시료를 주입할 수 있는 시료 주입장치(1)를 연결하고, 다른 측면에는 HPLC의 펌프를 연결하였다. HPLC 펌프를 사용하여 상기 제1 칼럼(10) 중 용매의 흐름 속도는 1mL/min 내지 5mL/min로 유지할 수 있다.
또한, 상기 제1 칼럼(10)의 또 다른 측면에 HPLC 장치의 신호에 의해 전기적으로 제어가능한 4 내지 12 포트(port)를 갖는 스위칭 밸브(2)를 연결하였다. 상기 칼럼과 밸브는 폴리에테르 에테르 케톤(Polyether ether ketone: PEEK) 튜브로 연결하였다.
한편, 상기 연결된 밸브의 일 측면에 스테인리스 블록으로 만든 해리 챔버(32)를 유체가 소통 가능하도록 PEEK 튜브로 연결하였다. 상기 밸브는 해리 챔버를 우회하여 해리 챔버를 사용하지 않고 바로 제2 칼럼으로 연결될 수 있도록 제작하였다. 초음파 발생기(30)가 일 측면에 연결되고 초음파 발생기에는 HPLC 장치의 신호에 의해 전원이 제어될 전원 제어 모듈(31)을 부착하였다. 제2 칼럼(20)은 ~5% 아세토니트릴을 용매로 하여 평형화시키고, 상기 제1 칼럼(10)에 스위칭 밸브(2)를 통하여 연결되었다. 또한 상기 장치에는 스위칭 밸브(2)를 통하여 분석 컬럼(40) 및 질량분석기(Q Exactive, Thermo Scientific)(50)도 연결되었다.
상기와 같이 제조한 장치를 동적 흐름 크로마토그래피-액체 크로마토그래피/질량분석(Dynamic Flow Choromatography-Liquid Chromatography/Mass Spectrometry: DFC-LC/MS) 장치로 명명하였다.
실시예 1. 세포를 시료로 한 항염증 인자의 절대적 정량
항염증 세포 모델로 사용된 RAW 264.7 세포주(ATTC)를 96-웰 플레이트에 웰 당 105개의 세포를 접종하고, 1%(v/v) FBS(Invitrogen)와 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen)을 포함하는 DMEM 배지(GibcoBRL)에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다.
배양된 세포에 최종 농도 1㎍/mL의 농도로 염증 유발인자인 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)를 처리하고, 37℃에서 24시간 동안 더 배양하였다.
ELISA법, 일반적인 용매 추출법인 용액-용액추출법(liquid-liquid extraction: LLE)에 의한 시료 전처리 후에 LC/MS를 사용하는 방법과 상기 제조예 1에서 제조된 장치를 사용하여, 배양된 세포로부터 생성된 프로스타글란딘E2(PGE2)와 프로스타글란딘D2(PGD2)의 항염증 표지 인자의 농도를 측정하였다.
ELISA법에 의한 측정은 PGE2 파라미터 어세이 키트(R&D systems)을 사용하였다. 구체적으로, 50㎕의 세포 배양액을 마이크로플레이트로 옮기고, 마이크로플레이트의 웰에 ~100㎕ 완충액을 가하여 1/3로 희석시켰다. 희석된 세포 배양액에 호스 래디쉬 퍼옥시다제-PGE2 항체를 첨가하고 500rpm으로 교반하면서 상온에서 3 시간 동안 배양하였다. 그 후, 400㎕의 세척 완충액(Wash Buffer, R&D Parameter, PGE2 kit)을 첨가하여 플레이트를 4회 세척하였다. 세척된 마이크로플레이트에 200㎕의 반응 용액을 첨가하고, 상온에서 30분 동안 배양한 다음, 100㎕의 반응정지 용액을 첨가하였다. 반응물 중 PGE2의 농도는 마이크로플레이트 판독기(Decan Infinite M1000)를 사용하여 450nm 파장에서 광학 밀도를 측정하였다.
일반적인 LC/MS법에 의한 측정을 위하여 LLE 용매 추출법으로 시료를 전처리하였다. 250㎕의 세포 배양액을 수집하고 여기에 내부 대조군인 d4-PGE2와 d4-PGD2를 최종 농도 5㎍/mL로 첨가하고, 동시에 20㎕의 1M의 시트르산, 및 5㎕의 10%(v/v) 부틸레이티드 히드록시 톨루엔(butylated hydroxy toluene: BHT)을 함께 첨가하였다. 그 후, 1mL의 헥산/에틸아세테이트(1:2 v/v) 추출 용매를 반응물에 첨가하였다. 반응물을 1분 동안 볼텍싱하고, 상온에서 4000 x g로 원심 분리한 후, 상층액을 조심스럽게 수득하였다. 이러한 용매 추출을 총 3회 반복하였고, 수득된 상층액은 질소 가스 하에서 건조시켰다. 반응물에 250㎕의 메탄올/물(50:50 v/v)을 가하여 재현탁시킨 다음, PGE2와 PGD2의 농도를 LC/MS 방법으로 측정하였다.
상기 제조예 1의 장치에 의한 PGE2와 PGD2의 농도 측정을 위해, 50㎕의 세포 배양액을 수득하고, 수득된 세포 배양액에 d4- PGE2와 d4-PGD2가 녹아있는 50㎕의 물(최종 농도 5 ng/ml)을 첨가하였다. 별도의 시료 전처리 과정 없이, 세포 배양액을 포함하는 시료를 제조예 1에서 제조된 장치에 주입하고, 세포로부터 생성된 PGE2와 PGD2의 농도를 LC/MS 방법으로 측정하였다.
측정된 세포 내 항염증 표지 인자인 PGE2와 PGD2의 농도를 각각 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 도 3a는 ELISA법, 일반적인 용매추출법인 LLE 처리 후 LC/MS법, 및 DFC-LC/MS법을 이용하여 PGE2의 항염증 세포 표지 인자의 절대정량을 비교한 결과를 나타내고, 도 3b는 DFC-LC/MS법과 LLE 처리 후 LC/MS법을 사용하여 PGD2의 항염증 세포 표지 인자의 절대정량의 결과를 비교한 결과를 나타낸다. 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이 측정 방법에 따른 PGE2 및 PGD2의 농도에는 유의미한 차이가 없었다. 따라서, 상기 결과는 세포 내 항염증 표지 인자의 절대 정량에 있어서 DFC-LC/MS법이 정확도가 높은 측정 방법임을 보여준다.
실시예 2. DFC -LC/MS 방법에 기반한 천연물 시료의 세포 내 항염증 활성탐색
천연물 시료의 세포 기반 항염증 활성탐색을 위하여 천연물 시료를 더 첨가한 것 외에는 실시예 1에서와 같은 세포주를 사용하고 동일한 방법으로 배양하였다.
세포를 96 웰 플레이트에 배양한 후, 세포에 LPS와 최종 농도 5 ㎍/mL의 하기 표 1의 천연물 시료를 함께 첨가하고 배양하였다. 24시간의 배양 후, 세포 배양액을 수득하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 ELISA 법과 DFC-LC/MS법을 이용하여 PGE2를 측정하여 상기 천연물 시료의 항염증 활성 탐색 결과를 확인하였다.
LPS를 단독으로 처리하여 생성된 PGE2의 양에 대한 천연물 물질을 첨가한 경우 생성된 PGE2의 양을 %로 정규화하여 결과를 수득하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 4는 천연물 시료의 PGE2 항염증 억제에 있어서 ELISA 법과 DFC-LC/MS법의 정량이 거의 일치하는 것을 보여준다. 따라서, DFC-LC/MS법이 천연물 시료에 대한 항염증 활성 탐색 응용에 적합한 스크리닝 방법임을 보여준다.
실시예 2에서 사용된 천연물시료
1 아킬레아 알피나(Achillea alpine) 70 % 에탄올 추출물
2-6 각각 시료 1의 헥산, 메틸렌 클로라이드(MeCl), 에틸 아세테이트(EtAc), 부탄올, 및 물 분획물
7 사사 자포니카(Sasa Japonica) 70 % 에탄올 추출물
8-12 각각 시료 7의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
13 아코루스 칼라무스(Acorus calamus) 70 % 에탄올 추출물
14-18 각각 시료 13의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
19 리트룸 살리카리아(Lythrum salicaria) 70% 에탄올 추출물
20-24 각각 시료 19의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
25 포르모노네틴(Formononetin)
26 퀘르시트린(Quercitrin)
27 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)
28 켐프페린(Kaempferin)
29 켐프페롤(Kaempferol)
30 3,4-디카페올리퀴닉산
31 아인슬리아에아 아세리폴리아 Sch. Bip(Ainsliaea acerifolia Sch. Bip) 70% 에탄올
32-36 추출물 각각 시료 31의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
37 코도놉시스 란세올라타 트라웃(Codonopsis lanceolata Traut) 70% 에탄올 추출물
38-42 각각 시료 37의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
43 레데보루이엘라 세셀로이데스(Ledeboruiella seseloides) 70% 에탄올 추출물
44-48 각각 시료 43의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
49 아시아사룸(Asiasarum) 70% 에탄올 추출물
50-54 각각 시료 49의 산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
55 페르시카리아 히드로피퍼(Persicaria hydropiper) 70% 에탄올 추출물
56-60 각각 시료 55의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
61 루스 베르니시플루아(Rhus verniciflua) 끓는 물 추출물
62-66 각각 시료 61의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
67 루멕스 크리스푸스(Rumex crispus) 70% 에탄올 추출물
68-72 각각 시료 67의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
73 상구이소르바 오피시날리스(Sanguisorba officinalis) 70% 에탄올 추출물
74-78 각각 시료 73의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
79 덴드로파낙스 모르비페라 레베일레(Dendropanax morbifera Leveille)끓는 물 추출물
80-84 각각 시료 79의 헥산, MeCl, EtAc, 부탄올, 및 물 분획물
실시예 3. DFC -LC/MS 방법에 기반한 표적 단백질에 대한 천연물 시료의 활성 탐색
DFC-LC/MS 방법에 의한 표적 단백질이나 효소에 대한 활성 물질 탐색이 가능한지 여부를 확인하기 위하여, 페록시솜 증식인자 활성화 수용체-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ: PPAR-γ)와, PPAR-γ와 결합하는 것으로 알려진 로시글리타존(Rosiglitazone)을 사용하였다.
1μM의 PPAR-γ(Cayman chemical), 100nM의 로시글리타존(Sigma Aldrich), 100mM Tris 완충액, 0.1M NaCl, 10%(v/v) 글리세롤, 및 1mM EDTA를 혼합하여 총 부피 200 ㎕의 반응액을 제조하였다. PPAR-γ와 로시글리타존이 복합체를 형성하도록 반응액을 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 한편, 음성 대조군으로서 활성도를 인위적으로 제거한 PPAR-γ 단백질(Cayman chemical)과 로시글리타존을 배양하였다. DFC-LC/MS 장치를 이용하는 경우 별도의 전처리 과정이 필요 없다. 제1 크로마토그래피 단계에서 자동적으로 전처리 과정이 진행되는 경우 시료당 약 20초의 시간이 소요되고, 통상적인 LC/MS 분석에서 1인 기준 30개 시료의 전처리 소요시간이 약 10시간 정도 걸리는 것에 비해 약 60배 빠른 속도로 시료 분석이 가능하다.
배양 후, 생성된 복합체가 시간의 경과에 따라 분해되는지 확인하기 위해 반응물을 4 ℃에 24시간 보관하였다. 생성된 복합체는 시료 자동 주입장치에 의해 10 ㎕ 주입되고, 제1 HPLC 펌프에 의해 제1 칼럼을 통과하게 된다. 도 1 및 도 2는 제조예 1에 따른 장치 및 이에 의한 유체의 흐름을 나타낸 모식도이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 제1 칼럼에 의한 첫 DFC에 의해 비활성 물질과 생성된 복합체가 먼저 1차적으로 분리되고 이때 사용된 용매는 100mM Tris 완충액 3mL/min의 흐름에서 30초간 이루어지도록 하였다. 상기 복합체를 포함하는 유체는 스위칭 밸브의 포트를 통해 해리 챔버로 이동되었다. 이와 동시에 초음파 발생기(Wiseclean sonicator, WUC-A01H, 159W, Daihan Sci Co, Ltd)에 전달된 전기적인 신호에 의해 초음파 발생기의 전원이 자동으로 켜짐으로써, 생성된 복합체는 상기 해리 챔버 내에서 30초간 초음파 발생기에 의해 해리되었다. 상기 30초간의 해리 후, 초음파 발생기는 전기적인 신호에 의해 자동적으로 꺼지게 된다. 해리 챔버를 통과한 유체는 제2 칼럼을 통과하게 되며, 이때 해리된 로시글리타존은 제2 칼럼 내에 머물고, PPAR-γ 단백질은 제거된다. 도 2에 나타난 바와 같이, 이후 상기 스위칭 밸브의 변환에 의해 제2 칼럼의 연결이 변화하게 되어, 분석 칼럼과 제2 칼럼이 연결된다. 상기 제2 칼럼에 제2 HPLC 펌프로 15분간 5%에서 90%까지 변하는 농도 구배의 ACN/물을 용매로 공급하여, 제2 칼럼 내에 머물러 있던 로시글리타존을 용리하였다. 사용된 ACN, 및 물은 HPLC 등급이었다. 상기 용리된 로시글리타존의 양은 분석 컬럼에서 유출되어 질량분석기로 확인되었고, 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
도 5a는 2시간 또는 15 시간 동안 PPAR-γ와 로시글리타존을 배양시킨 후 DFC-LC/MS에서 수득된 로시글리타존의 질량분석 결과를 나타내는 그래프이고, 도 5b는 4℃에서 보관한 시간에 따라 DFC-LC/MS에서 수득된 로시글리타존의 양을 나타내는 그래프이다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 활성을 인위적으로 제거한 PPAR-γ 단백질과 로시글리타존을 배양한 음성 대조군은 로시글리타존이 거의 검출되지 않았지만, PPAR-γ 단백질과 로시글리타존을 배양한 경우에는 로시글리타존이 검출되었다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 4℃에서 2 내지 25시간 동안 보관하여도 로시글리타존이 검출량은 일정하였다. 따라서, PPAR-γ 단백질과 로시글리타존이 복합체를 형성한 후 4℃에서 24시간 동안 보관하여도 복합체가 유지되고, 24시간 기계적인 동작으로 스크리닝이 가능한 자동화 장치에서도 약물의 자동화 탐색이 가능하다는 것을 확인하였다.
1: 시료 주입장치
2: 스위칭 밸브
10: 제1 컬럼
20: 제2 컬럼
30: 초음파 발생기
31: 전원 제어 모듈
32: 해리 챔버
40: 분석 컬럼
50: 질량분석기

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. HPLC(High Performance Liquid Chromatography)가 수행되는 장치로서, 상기 장치는
    시료 내 표적 물질과 후보 물질이 결합하여 형성된 표적 물질-후보 물질 복합체를 분리하여 상기 복합체를 포함하는 제2 시료를 제조하기 위한 제1 칼럼;
    상기 제2 시료 내의 분리된 표적 물질-후보 물질 복합체를 해리시키기 위한 해리 장치;
    상기 제2 시료 내의 해리된 표적 물질 및 후보 물질을 분리하기 위한 제2 칼럼; 및
    분리된 후보 물질을 분석하기 위한 분석기를 구성으로 포함하는 HPLC 장치로서,
    상기 제1 칼럼은 직경 50-100 ㎛의 비드로 충진된 것인 장치.
  5. 청구항 4에 있어서, 2개 이상의 시료를 자동으로 주입하는 자동 시료 주입장치를 더 포함하는 것인 장치.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 구성들을 연결하는 스위칭 밸브를 더 포함하는 장치.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 해리 장치는 초음파 발생기인 것인 장치.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 해리 장치는 HPLC 장치의 신호에 따라 자동으로 동작이 제어되는 전원 제어 모듈을 포함하는 것인 장치.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 표적 물질과 후보 물질을 포함하는 제1 시료를 배양하여 표적 물질-후보 물질 복합체를 형성시키는 단계;
    상기 복합체가 형성된 제1 시료에 제1 크로마토그래피를 수행하여 시료로부터 복합체를 분리하고, 상기 분리된 복합체를 포함하는 제2 시료를 제조하는 단계;
    상기 제2 시료에 포함된 복합체를 표적 물질 및 후보 물질로 해리시키는 단계;
    상기 해리된 표적 물질 및 후보 물질을 포함하는 상기 제2 시료에 제2 크로마토그래피를 수행하여 후보 물질을 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 후보 물질을 검출하는 단계를 포함하는 표적 물질과 결합하는 후보 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    HPLC(High Performance Liquid Chromatography)가 수행되는 장치로서, 상기 장치는
    시료 내 표적 물질과 후보 물질이 결합하여 형성된 표적 물질-후보 물질 복합체를 분리하여 제2 시료를 제조하기 위한 제1 칼럼;
    상기 제2 시료 내의 분리된 표적 물질-후보 물질 복합체를 해리시키기 위한 해리 장치;
    상기 제2 시료 내의 해리된 표적 물질 및 후보 물질을 분리하기 위한 제2 칼럼; 및
    분리된 후보 물질을 분석하기 위한 분석기를 구성으로서 포함하는 HPLC 장치에서 수행되는 것이고,
    상기 제1 칼럼은 직경 50-100 ㎛의 비드로 충진된 것인 방법.

  12. 삭제
KR1020150066953A 2015-05-13 2015-05-13 고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법 KR101821747B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150066953A KR101821747B1 (ko) 2015-05-13 2015-05-13 고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150066953A KR101821747B1 (ko) 2015-05-13 2015-05-13 고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180005265A Division KR101921628B1 (ko) 2018-01-15 2018-01-15 고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160133873A KR20160133873A (ko) 2016-11-23
KR101821747B1 true KR101821747B1 (ko) 2018-01-24

Family

ID=57541496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150066953A KR101821747B1 (ko) 2015-05-13 2015-05-13 고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101821747B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112763615A (zh) * 2020-12-29 2021-05-07 四川新绿色药业科技发展有限公司 一种地榆炭配方颗粒特征图谱鉴别方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100479215B1 (ko) * 2003-01-07 2005-03-28 한국과학기술연구원 혈장 중의 아테놀롤의 검출 방법 및 그 장치
KR100680013B1 (ko) * 1997-06-20 2007-02-09 사이퍼젠 바이오시스템스, 인코오포레이티드 생물학과 의학에 사용할 수 있는 보유물 크로마토그래피및 단백질 칩 어레이

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100680013B1 (ko) * 1997-06-20 2007-02-09 사이퍼젠 바이오시스템스, 인코오포레이티드 생물학과 의학에 사용할 수 있는 보유물 크로마토그래피및 단백질 칩 어레이
KR100479215B1 (ko) * 2003-01-07 2005-03-28 한국과학기술연구원 혈장 중의 아테놀롤의 검출 방법 및 그 장치

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160133873A (ko) 2016-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fu et al. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products
Mahrous et al. Two dimensional NMR spectroscopic approaches for exploring plant metabolome: A review
Patel et al. Introduction to hyphenated techniques and their applications in pharmacy
Shi et al. Systematic profiling and comparison of the lipidomes from Panax ginseng, P. quinquefolius, and P. notoginseng by ultrahigh performance supercritical fluid chromatography/high-resolution mass spectrometry and ion mobility-derived collision cross section measurement
CN106950327B (zh) 复杂基质中贝类毒素的筛查与确证方法
CN111896651B (zh) 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用
CN105842375B (zh) 一组鉴别阿胶及其制品中驴源性成分的多肽
CN105784879B (zh) 一种基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法
Si-Hung et al. Current state and future perspectives of supercritical fluid chromatography
Cieśla Biological fingerprinting of herbal samples by means of liquid chromatography
CN111893110B (zh) 一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用
de Moraes et al. Targeting anti-cancer active compounds: affinity-based chromatographic assays
CN115015460B (zh) 一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴定冬虫夏草产地的方法
KR101921628B1 (ko) 고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법
KR101821747B1 (ko) 고속 액체 크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 물질 스크리닝 방법
Pourbasheer et al. Dispersive liquid–liquid microextraction for preconcentration and determination of phenytoin in real samples using response surface methodology-high performance liquid chromatography
Xin et al. Mass spectrometry-based strategies for screening of bioactive natural products
Li et al. Extraction and separation of lactate dehydrogenase inhibitors from Poria cocos (Schw.) Wolf based on a hyphenated technique and in vitro methods
Zhu et al. Comprehensive screening and separation of cyclooxygenase-2 inhibitors from Pterocephalus hookeri by affinity solid-phase extraction coupled with preparative high-performance liquid chromatography
Zhao et al. pH‐Zone‐refining counter‐current chromatography for two new lipo‐alkaloids separated from refined alkaline extraction of Kusnezoff monkshood root
Tang et al. Cell extraction combined with off‐line HPLC for screening active compounds from Coptis chinensis
Gu et al. Rapid isolation of a dipeptidyl peptidase IV inhibitor from Fritillaria cirrhosa by thin-layer chromatography–bioautography and mass spectrometry-directed autopurification system
CN113189346B (zh) 一组检测生脉注射液质量的血清蛋白标志物及其应用
CN110297046B (zh) 筛选药对活性成分及其配比优化的方法
CN114910577A (zh) 基于树突状细胞判断水产过敏原作用的联合型代谢标志物及其应用和检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant