CN103913522B

CN103913522B - 从地榆中分离三种鞣质单体组分的方法

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Publication number: CN103913522B
Application number: CN201410003957.1A
Authority: CN
Inventors: 邹文俊; 高小平; 吴建明; 李小芳; 代燕平
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2013-01-06
Filing date: 2014-01-06
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2034-01-06
Also published as: CN103913522A

Abstract

本发明提供了从地榆中分离三种鞣质单体组分的方法，所述的三种单体组分分别是没食子酸、3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷、3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸。本发明利用制备型高效液相色谱法分离制备的鞣质单体组分，纯度均在98%以上，且分离效率高、分离速度快，具有很好的产业前景，可以将所得组分作为鞣质标准品，并广泛用于药剂、药物分析和药理学等研究领域。

Description

从地榆中分离三种鞣质单体组分的方法

技术领域

本发明涉及从地榆中分离三种鞣质单体组分的方法，主要涉及没食子酸、3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷和3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸的高效液相色谱分离方法。

背景技术

鞣质又称单宁，是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物。它的药理活性除常见的收敛、抗菌消炎、止血、驱虫、止泻、抗多种病原虫感染性疾病外，还表现在人们非常关注的抗肿瘤、抗人类免疫缺陷病毒（HIV）、抗突变、抗脂质过氧化，抗衰老、心血管病、改善肝肾功能、预防应激性胃肠损伤、抗白内障、对重金属盐和生物碱中毒有解毒作用等方面有独到功效。

根据鞣质的化学结构可分为可水解鞣质、缩合鞣质和复合鞣质三大类。其中可水解鞣质是一类由酚酸及其衍生物与葡萄糖或多元醇通过甙键或酯键而形成的化合物。依水解后所得酚酸类的不同，又可分为没食子酸鞣质和逆没食子酸鞣质两类，其中没食子酸与3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸分别为没食子酸鞣质和逆没食子酸鞣质水解产生的两类酚酸及其衍生物，3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷为逆没食子酸鞣质，这三种单体组分的结构式分别为：

没食子酸

3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷

3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸

见载于文献的分离地榆鞣质类物质的分离方法主要为柱层析技术（王满力，陈桐.柱色谱法分离地榆中的鞣质和皂苷，色谱，1994,12（4）），但该方法产率低、耗时、耗力，且只能将总鞣质和总皂苷分离，而无法获得鞣质单体组分。目前为止尚未公开有高效液相色谱法分离地榆粗提物中三种单体组分的方法，它是一种能够快速、高效分离地榆粗提物中鞣质类组分的分离方法，但应对流动相的条件等进行严格限制，因为鞣质类组分多具有酚羟基结构，容易发生离子化同时洗脱液在浓缩过程中目标化合物易破坏及流动相易残留，所以应对流动相的选择及其条件进行严格限制。

发明内容

本发明提供了从地榆中分离没食子酸、3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷、3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸的方法。

本发明提供了从地榆中分离三种鞣质单体组分的方法，所述的三种单体组分分别是没食子酸、3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷、3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸，它包括如下操作步骤：

（1）取地榆提取物，制备供试品溶液，所述地榆提取物为地榆总鞣质或地榆的70～95%v/v甲醇提取物；

（2）将供试品溶液注入制备型高效液相色谱仪中，以甲醇-酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在线监测，分别收集所述三种组分的洗脱液，将各洗脱液减压浓缩、干燥后，得3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷、3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸两个纯化样品以及没食子酸粗制品；

（3）取步骤（2）制备的没食子酸粗制品，注入制备型高效液相色谱仪中，以甲醇-酸水溶液为流动相进行洗脱，在线监测，收集没食子酸组分的洗脱液，减压浓缩、干燥，即得没食子酸纯化样品；

其中，步骤（2）采用的色谱条件如下：制备型色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶；流动相为甲醇-酸水溶液系统，所述甲醇-酸水溶液系统为：以体积百分比计，甲醇体积浓度为20%～100%的甲醇-酸水溶液的梯度洗脱液；

步骤（3）采用的色谱条件如下：制备型色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶；流动相为甲醇-酸水溶液系统，所述甲醇-酸水溶液系统为：以体积百分比计，甲醇体积浓度为5%～100%的甲醇-酸水溶液的梯度洗脱液；

步骤（2）、（3）中，检测波长为210nm、254nm或/和280nm。

进一步地，步骤（1）中所述地榆提取物为地榆的80%v/v甲醇提取物。

进一步地，步骤（2）中，所述甲醇-酸水溶液系统的梯度洗脱条件如下：

时间/min	酸水溶液/%	甲醇/%
			0	80	20
35	40	60
			45	0	100
55	0	100

步骤（3）中，所述甲醇-酸水溶液系统的梯度洗脱条件如下：

时间/min	酸水溶液/%	甲醇/%
			0	95	5
15	80	20
			16	40	60
25	0	100

进一步地，所述酸水溶液的pH值为2.0～4.0。

优选地，所述酸水溶液的pH值为3.0±0.2。

其中，所述酸为盐酸、磷酸、硫酸、甲酸或醋酸，优选使用盐酸或磷酸。

其中，所述十八烷基键合硅胶的粒径为5um。

其中，步骤（2）、（3）中，流动相流速10.0ml/min。

其中，步骤（2）、（3）中，色谱柱柱温为25±5℃。

其中，步骤（1）中所述供试品溶液的浓度在50mg/ml以下；步骤（2）、（3）中，进样量在1.0ml以下。

本发明利用制备型高效液相色谱法分离制备鞣质单体组分，分离效率高、分离速度快，具有很好的产业前景，可以将所得组分作为鞣质标准品，并广泛用于药剂、药物分析和药理学等研究领域。

附图说明

图1是本发明制备型HPLC分离地榆提取物色谱图

图2是本发明地榆粗提物组分分离流程图

图3是本发明没食子酸纯度分析高效液相色谱图（λ=254nm,纯度：99.81%）

图4是本发明3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷纯度分析高效液相色谱图（λ=254nm,纯度：98.82%）

图5是本发明3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸纯度分析高效液相色谱图（λ=254nm,纯度：98.10%）

图6是本发明没食子酸主峰纯度拟合曲线

图7是本发明3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷主峰纯度拟合曲线

图8是本发明3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸主峰纯度拟合曲线

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，对本发明进一步详述，但本发明并不仅限于此。在以下实施例中用到的仪器和试剂有，AKTA basic色谱层析系统：美国GE公司。AB104-N电子天秤：瑞士METTLER TOLEDO公司。AB265-S电子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。RC210B旋转真空干燥系统：Savant公司。Allegra64R型高速冷冻离心机：美国Beckman公司。KQ5200B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。Milli-Q纯水仪：美国Millipore公司。岛津LC2010C液相色谱系统（柱温箱、紫外检测器、四元低压梯度输液泵、真空脱气机、系统控制器、SPD-M10Avp二极管阵列检测器、Shimadzu反相C₁₈色谱柱组成）：日本岛津公司。甲醇：色谱纯，批号：1204197；规格：4000ml/瓶；美国TEDIA公司产品。磷酸：色谱纯，批号：20090706；规格：500ml/瓶；天津市科密欧化学试剂有限公司产品。盐酸：分析纯，批号：20100317；规格：500ml/瓶；成都科龙化工试剂厂产品。Inertsil色谱柱，ODS(C₁₈)，5μm，250mm×4.6mmm ID，日本GL-Sciences公司。Kromasil C₁₈制备柱，5μm，250mm×20mmm ID，瑞典Kromasil公司。溶剂过滤器：天津津腾实验设备有限公司。Millipore滤膜，0.22μm，美国Merck Millipore公司。DELTA320pH计，瑞士METTLER TOLEDO公司。

实施例1 本发明分离纯化方法

（一）原料的前处理

称取一定量的地榆粗提物，用80%甲醇水溶液溶解，超声5min，采用0.22μm滤膜过滤，备用。

地榆粗提物可以是使用现有技术从地榆的干燥根茎中提取得到的一组鞣质类化合物的混合物。

溶剂对样品分离度和稳定性有较大影响，由于样品具有一定脂溶性，而同时又需兼顾亲水性化合物，在甲醇水溶液中，地榆粗提物稳定且溶解度好，在高效液相色谱分析时分离度也好，故选择80%甲醇为溶剂。

（二）制备型HPLC分离地榆粗提物中的三种单体组分

取步骤（一）制备的地榆粗体物，上液相色谱对其中三种主要成分进行分离制备，其制备型液相色谱条件具体为：色谱柱：Kromasil C₁₈制备柱，5μm，250mm×20mmm ID。流速：10.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：210nm、254nm、280nm；进样量：1.0ml。流动相A：pH3.0的盐酸；流动相B：甲醇。流动相梯度见表1。

表1流动相梯度

时间（min）	流动相A:盐酸溶液(pH3.0)	流动相B:甲醇
			0	80	20
35	40	60
			45	0	100
55	0	100

HPLC分离步骤：

取配制好的地榆粗提物溶液，进样1.0mL，根据在线监测信号，分段收集不同的物质峰。将收集到的分馏液在减压条件下旋转蒸发，旋转蒸发仪水浴温度为65℃，真空度为0.1MPa。将蒸馏得到的3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷和3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸浓缩液置旋转真空干燥系统干燥，得到3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷和3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸两种分馏组分的固体；将蒸馏得到的没食子酸样品浓缩液再一次注入“没食子酸样品再次纯化”条件下的制备型高效液相色谱仪中进行进一步纯化。

制备色谱图见图1。

其中，没食子酸出峰时间范围：RT8.87-RT9.88，收集时间范围：RT9.28-RT9.55；3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷出峰时间范围：RT23.82-RT25.85，收集时间范围：RT24.55-RT25.42，3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸出峰时间范围：RT33.47-RT33.84，收集时间范围：RT33.77-RT34.27。

（三）没食子酸的再次纯化

没食子酸样品再次纯化HPLC具体条件为：色谱柱：Kromasil C₁₈制备柱，5μm，250mm×20mmm ID。流速：10.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：210nm、254nm、280nm；进样量：1.0ml。流动相A：PH3.0的盐酸；流动相B：甲醇。流动相梯度见表2。

表2流动相梯度

时间（min）	流动相A:盐酸溶液(pH3.0)	流动相B:甲醇
			0	95	5
15	80	20
			16	40	60
25	0	100

没食子酸样品再次纯化步骤：

将没食子酸样品初次分离样品注入制备型高效液相色谱，进样量1.0mL，根据在线检测信号，收集没食子酸样品主峰，再经减压浓缩后旋转真空干燥得组分没食子酸精制样品。

整个地榆粗提物组分分离流程图如图2所示。

实施例2：流动相的确定

选择了几种不同组成的流动相来分离地榆提取物中所含多种单体成分，其中乙腈-盐酸（pH3.0）水溶液与甲醇-盐酸（pH3.0）水溶液所组成的流动相均可使多种组分达到良好分离，但考虑到乙腈的价格昂贵，在相同分离效果的情况下我们选择了相对经济的甲醇作为流动相。因此最终选择甲醇-盐酸（pH3.0）水溶液作为制备样品时的流动相系统，而为了获得更好的分离度，选择甲醇-磷酸（0.1%）水溶液所组成的流动相作为检测样品时的流动相。

考察了流动相pH值对各组分分离度及稳定性的影响，根据此次分离样品的化学成分特点及其光谱吸收特征，推测目标化合物多具有酚羟基结构，因此需调节流动相pH值至酸性以降低化合物离子化。而样品制备过程中为防上洗脱液浓缩过程中对目标化合物的破坏及残留，不能采用非挥发性酸及离子对可缓冲液，为此选择既易挥发酸性又不会太强的盐酸，根据色谱柱的pH范围及分离效果摸索，最终确定为以盐酸调节pH至3.0即可获得良好的分离效果。

考察了进样量对各组分分离度的影响，制备色谱以获得尽可能大量的单成分为目的，所以确定最佳进样量是制备色谱优化的一个主要环节，因此既希望通过加大进样量，又必须保证分离效果来提高工作效率。加大进样量由样品溶液的浓度和进样体积两方面决定，由于样品3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸具有一定脂溶性，而同时又需兼顾亲水性化合物，故选择80%甲醇为溶剂。在该溶剂条件下，50mg/ml已接近该样品溶解极限，而随着进样量从0.6～1.0ml递增，目标成分与干扰成分分辨率逐渐降低，峰重叠逐渐加重，各目标峰已出现平头峰，但仍能保证主要目标峰的分离度，由此确定最大进样量为1.0ml。

考察了检测波长对各组分分离监测的影响，由于地榆粗提物样品含鞣质类及皂苷类化合物，而洗脱液有机相为甲醇，具有较强末端吸收，因此在样品制备过程中同时监测210nm、254nm及280nm，主要以254nm波长指导各目标化合物的收集，而以210nm及280nm监测洗脱液中的杂质干扰情况。结果表明该方法对组分收集可起到良好的指导作用。

实施例3：分析型高效液相色谱检测分离所得的三种单体组分

对实施例1所得的三个组分进行检测时，其液相色谱条件具体为：色谱柱：Inertsil，ODS(C₁₈)，5μm，250mm×4.6mmm ID。流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测波长：254nm；进样量：60μl。流动相A：0.1%磷酸溶液；流动相B：甲醇。流动相梯度见表3。

表3流动相梯度

时间（min）	流动相A:0.1%磷酸溶液	流动相B:甲醇
			0	80	20
35	40	60
			45	0	100
55	0	100

液相色谱图见图3～5，图3是没食子酸组分液相色谱图，图4是3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷组分液相色谱图，图5是3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸组分液相色谱图。

实施例4：三种组分的鉴定和纯度测定

通过HPLC-MS、HNMR分析与文献数据对照，确定产物归属：

三种组分的纯度测定：

通过实施例1获得三种单体后，采用HPLC面积归一化法对三种产物的纯度进行了测定，所得的没食子酸、3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷和3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸三种组分纯度分别为99.81%、98.82%、98.10%。

没食子酸:ESI-MS显示分子离子峰m/z169[M-H]^-且124[M-45]^-说明分子含1个羧基,¹H-NMR显示有1分子酸[δ_H12.2(1H)]，3个酚羟基[δ_H9.15(2H,s),8.80(1H,s)]和2个芳香质子[δ_H7.06(2H,s)]，以上数据与从地榆中分离的没食子酸(gallic acid)报道值相一致。

3,3′,4′-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷:ESI-MS显示分子离子峰m/z475[M-H]^-,且344[M-132]^-和313[344-31]^-说明分子含有1个五碳糖和甲氧基。¹H-NMR显示有2个芳香质子[δ_H7.74,7.51(each1H,s)]和3个甲氧基[δ_H4.08,4.03,3.98(each3H,s)]和1个糖基[δ_H5.16(1H,d,J=7Hz)]信号。以上数据与从地榆中分离的3,3’,4’,-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷(3,3’,4’,-O-trimethylellagic acid4-O-β-D-xyloside)文献值相一致。

3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸:ESI-MS显示分子离子峰m/z343[M-H]^-,且328[M-15]^-表明有甲基。¹H-NMR显示有2个芳香质子[δ_H7.73,7.61(each1H,s)]和3个甲氧基[δ_H4.19,4.14,4.04(each3H,s)]信号。以上数据与从地榆中分离的3,3’,4’,-O-三甲基逆没食子酸(3,3’,4’,-O-trimethylellagic acid)文献值相一致。

综上所述，本发明利用制备型高效液相色谱法分离制备的鞣质单体组分，纯度均在98%以上，且分离效率高、分离速度快，具有很好的产业前景，可以将所得组分作为鞣质标准品，并广泛用于药剂、药物分析和药理学等研究领域。

Claims

1.从地榆中分离三种鞣质单体组分的方法，所述的三种单体组分分别是没食子酸、3,3',4'-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷、3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸，其特征在于：它包括如下操作步骤：

(1)取地榆提取物，制备供试品溶液，所述地榆提取物为地榆总鞣质或地榆的70～95％v/v甲醇提取物；

(2)将供试品溶液注入制备型高效液相色谱仪中，以甲醇-酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在线监测，分别收集所述三种组分的洗脱液，将各洗脱液减压浓缩、干燥后，得3,3',4'-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷、3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸两个纯化样品以及没食子酸粗制品；

(3)取步骤(2)制备的没食子酸粗制品，注入制备型高效液相色谱仪中，以甲醇-酸水溶液为流动相进行洗脱，在线监测，收集没食子酸组分的洗脱液，减压浓缩、干燥，即得没食子酸纯化样品；

其中，步骤(2)采用的色谱条件如下：制备型色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶；流动相为甲醇-酸水溶液系统，所述甲醇-酸水溶液系统为：以体积百分比计，甲醇体积浓度为20％～100％；甲醇-酸水溶液的梯度洗脱液的梯度洗脱条件如下：

时间/min 酸水溶液/％甲醇/％ 0 80 20 35 40 60 45 0 100 55 0 100

步骤(3)采用的色谱条件如下：制备型色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶；流动相为甲醇-酸水溶液系统，所述甲醇-酸水溶液系统为：以体积百分比计，甲醇体积浓度为5％～100％；甲醇-酸水溶液的梯度洗脱液的梯度洗脱条件如下：

时间/min 酸水溶液/％甲醇/％ 0 95 5 15 80 20 16 40 60 25 0 100

步骤(2)、(3)中，检测波长为210nm、254nm或/和280nm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述地榆提取物为地榆的80％v/v甲醇提取物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酸水溶液的pH值为2.0～4.0。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述酸水溶液的pH值为3.0±0.2。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于：所述酸为盐酸、磷酸、硫酸、甲酸或醋酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述十八烷基键合硅胶的粒径为5um。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)、(3)中，流动相流速10.0ml/min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)、(3)中，色谱柱柱温为25±5℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述供试品溶液的浓度在50mg/ml以下；步骤(2)、(3)中，进样量在1.0ml以下。