CN112274522B - 地榆中酚苷类化合物的抗炎新用途及其提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了地榆中酚苷类化合物的抗炎新用途及其提取分离方法。对本发明从地榆中提取分离得到的两个新的酚苷化合物和两个已知物质的抗炎活性进行了表征,发现其能够减少炎症介质如NO、IL‑6和TNF‑α的产生,表现出很好的抗炎特性,在制备治疗炎症性疾病的药物领域具有很好的应用前景,为临床提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及从地榆中提取分离的化合物的抗炎新用途及其提取分离方法。
背景技术
地榆(Sanguisorba officinalis)属蔷薇科植物,几千年来由于其收敛性和镇痛性,它的干燥根通常被用作传统中医药治疗烧伤、烫伤、炎症和出血。目前有研究表明地榆中的三萜类、三萜苷类、木脂素、木脂素苷类、多糖、可水解单宁和萜烯糖苷可以部分说明它的治疗效果。
然而,地榆中的化学成分种类多且复杂,为了进一步研究地榆中的活性成分,促进地榆的开发应用并保证其临床疗效,对地榆中的化合物进行提取分离,并探究其生理活性尤为必要。
发明内容
发明人在不断寻找具有抗炎作用的化合物的过程中,从地榆中提取分离得到了具有抗炎活性的两个新的酚苷类化合物和两个已知酚苷类化合物。
本发明提供了式I化合物的抗炎新用途,
所述饱和杂环基的杂原子为N、O、S,杂原子个数为1或2;
m选自2~4的整数,n选自2~4的整数,j选自0~3的整数,k选自0~3的整数;
所述饱和杂环基的杂原子为O,杂原子个数为1;
更进一步地,式I化合物为化合物1、化合物2、化合物3或化合物4,具有以下结构:
进一步地,上述抗炎为减少炎症介质产生,所述炎症介质为一氧化氮、TNF-α和IL-6。
进一步地,上述抗炎新用途是在制备治疗炎症性疾病的药物中的用途。
进一步地,上述式I化合物是从地榆中提取分离得到的化合物,优选的,是从地榆根中提取分离得到的化合物。
本发明还提供了一种从地榆中提取分离式I化合物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取地榆粉碎,加乙醇回流,浓缩得浸膏;
(2)将步骤(1)所得浸膏上样到D101大孔树脂柱层析,用0、30%、50%、70%、95%的乙醇梯度洗脱得5个组分;
(3)将步骤(2)得到的30%乙醇组分上样到HP-20大孔树脂柱层析,用0、10%、20%、30%、40%、50%、100%的乙醇梯度洗脱得7个组分F1—F7;
(4)将步骤(3)得到的F3组分上样至HPD-400大孔树脂柱层析,用10%、30%、95%的乙醇梯度洗脱得到3个组分F3a—F3c;
(5)将步骤(4)得到的F3b组分上样至MCI反向色谱柱层析,用20%、25%、30%、35%、100%的乙醇梯度洗脱得到3个组分F3b1—F3b3;
(6)将步骤(5)得到的F3b3经制备高效液相色谱法分离纯化,即得;
所述饱和杂环基的杂原子为N、O、S,杂原子个数为1或2;
m选自2~4的整数,n选自2~4的整数,j选自0~3的整数,k选自0~3的整数;
进一步地,上述制备高效液相色谱法为采用甲醇和水的体积比为(20~30):(70~80)的混合溶剂作为流动相等度洗脱;优选为用甲醇和水体积比为20:80,或30:70,或28:72,或25:75的混合溶剂作为流动相等度洗脱;
所述饱和杂环基的杂原子为O,杂原子个数为1;
优选地,式I化合物为化合物1、化合物2、化合物3或化合物4,具有以下结构:
本发明还提供了从地榆中提取分离得到的新的化合物1,其特征在于,具如下所示结构:
本发明还提供了从地榆中提取分离得到的新的化合物2,其特征在于,具有如下所示结构:
实验结果表明,从地榆根中提取分离得到的两个新的酚苷类化合物和两个已知的化合物能够减少炎症介质如NO、IL-6和TNF-α的产生,表现出很好的抗炎特性,在制备治疗炎症性疾病的药物领域具有很好的应用前景,为临床提供了新的选择。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为化合物1的异核单量子关系(HSQC)谱图,溶剂为CD3OD。
图2为化合物1的1H异核多碳相关谱(HMBC相关谱),溶剂为CD3OD。
图3为化合物1的氢-氢化学位移相关谱(1H-1H-COSY相关谱),溶剂为CD3OD。
图4为化合物1的关键HMBC和1H-1H-COSY的相关分析
图5为化合物1的二维核磁(NOESY)光谱,溶剂为CD3OD。
图6为化合物1的圆二色谱(CD)光谱,溶剂为CD3OD。
图7为化合物2的HSQC谱图,溶剂为CD3OD。
图8为化合物2的HMBC相关谱,溶剂为CD3OD。
图9为化合物2的1H-1H-COSY相关谱,溶剂为CD3OD。
图10为化合物2的关键HMBC和1H-1H-COSY的相关分析
图11为化合物1~4对细菌脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞产生一氧化氮的影响;每个结果值代表平均值±标准误差(###P<0.001与对照组比较;***P<0.001;**P<0.01;*P<0.05与LPS组比较)。
图12为化合物1~4对细菌脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞产生TNF-α、IL-6的影响;每个结果值代表三个独立实验的平均值±标准误差(###P<0.001与对照组比较;***P<0.001;**P<0.01;*P<0.05,与LPS组比较)。
具体实施方式
仪器与试剂:光学旋转记录在perkin-Elmer-241旋光仪(PerkinElmer,Inc.,Waltham,MA,USA)上测量的。CD光谱是在Chirascan圆二色光谱仪(Applied PhotophysicsLtd.,Leatherhead,UK)上测量的。红外光谱记录在Cary 600系列FT-IR(KBr)光谱仪((Agilent Technologies Inc.,California,USA)上。HR-ESIMS数据由Q Exactive UHMRHybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientifc,MA,USA)测得。1D(1H和13C)和2D(1H-1H-COSY,HSQC,HMBC和NOESY)NMR数据是使用Bruker Bruker-Ascend-700-MHz光谱仪(Bruker Corporation,Billerica,MA,USA)测得。半制备高效液相色谱仪采用NP7000系列仪器和U3000系列紫外检测器购自汉邦科技股份有限公司(中国江苏)。使用Kromasil 100-5-C18柱(10×250mm,5μm)(Akzo Nobel Pulp and Performance ChemicalsAB,Bohus,Sweden).。在配备Kromasil Eternaly XT-5-C18柱(4.6×250nm,5μm)(AkzoNobel Pulp and Performance Chemicals AB,Bohus,Sweden)的Utimated 3000系列泵((Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)上,使用实用的3000DAD检测器(ThermoScientific,Waltham,MA,USA)对高效液相色谱进行分析。柱色谱法使用D101 CC(中国什邡长丰化工有限公司)、HPD400 CC(中国上海兰基技术开发有限公司)、HP-20 CC(日本东京三菱化学公司)和MCI凝胶(75-150μm,日本东京三菱化学公司)进行柱色谱分析。NO检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司,(中国上海,批号:032519190612)。小鼠酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自新生物科技股份有限公司(中国深圳,批号:M190726-004a,M190726-102a)。脂多糖购自北京索罗比科技有限公司(中国北京)。噻唑蓝购自Sigma-Aldrich(美国)。L-阿拉伯糖、D-木糖和D-葡萄糖购自能源化工(中国成都)。L-半胱氨酸甲酯盐酸盐购自Chroma生物技术有限公司(中国成都)。异硫氰酸苯酯购自阿拉丁(中国成都)。所用溶剂均为分析级。
植物材料:地榆由成都地奥集团天府药业股份有限公司提供,经成都中医药大学药学院中药教研室龙飞副教授鉴定为蔷薇科地榆属多年生草本植物地榆Sanguisorbaofficinaisl.。标本(20150920)存放于成都中医药大学药学院中药化学实验室。
实施例1、本发明酚苷类化合物的分离提取与结构确定
1、分离提取
取地榆药材(10kg),粉碎,用70%乙醇回流,浓缩至无醇味,将浸膏(1.37kg)上样至大孔树脂D101(8×80cm)柱层析,用乙醇-水(0、30%、50%、70%、95%)梯度洗脱,得到五个组分。将30%乙醇部分(0.74kg)上样至大孔树脂HP-20柱层析(60×5cm),依次用乙醇-水(0、10%、20%、30%、40%、50%、100%)梯度洗脱共得到七个组分F1—F7.然后将F3(120g)上样至HPD-400大孔树脂柱层析(6×80cm),用乙醇-水(10%、30%、95%)梯度洗脱共得到三个组分F3a—F3c.再将F3b(24g)上样至MCI反向色谱柱层析(5cm×80cm),用乙醇-水(20%、25%、30%、35%、100%)梯度洗脱共得到三个组分F3b1—F3b3。最后将F3b3经制备高效液相色谱法(配备Kromasil RP-C18柱(250nm×10nm,210nm)),分离纯化得到化合物1(2.0mg;MeOH/H2O:20:80,v/v;3mL/min;tR:19min),2(6.9mg;MeOH/H2O:30:70,v/v;3mL/min,tR:20min),3(5.8mg;MeOH/H2O:28:72,v/v;3mL/min,tR:19min),4(3.2mg;MeOH/H2O:25:75,v/v;3mL/min,tR:21min),等度洗脱。
2、结构分析方法
采用HR-ESIMS、1HNMR、13CNMR、HMBC、1H-1H COSY、NOESY光谱、CD光谱、UV光谱、IR光谱等手段对分离得到的化合物1~4结构进行分析,并结合酸水解衍生化、旋光比色法对化合物1和2的结构进行确定。
酸水解衍生化方法如下:
取化合物1和2各1mg,加2ml三氟乙酸(2mol/ml),100℃水解6h,加入2ml甲醇减压蒸干,重复3次,除尽三氟乙酸,加2ml水溶解,用2ml三氯甲烷萃取,重复三次,减压干燥三氯甲烷层,即得水解后的单糖。加入0.5ml吡啶,1mg L-半胱氨酸甲酯盐酸盐,60℃反应1h后,加入0.5ml异硫氰酸苯酯,60℃加热1h,将反应后的溶液进行液相色谱分析。色谱条件色谱柱:Kromasil EternityXT-5-C18柱(4.6×250mm,5μm);流动相:乙腈(A)—0.05%磷酸水(B);流速:1mL/min;检测波长:250nm;柱温:30℃;进样量:10μL,25%乙腈等度洗脱。将化合物1和2水解后的单糖衍生化的保留时间与单糖标准品衍生化后的保留时间进行对比,葡萄糖的保留时间为14.643min,阿拉伯糖的保留时间17.843min,木糖的保留时间为17.380min。
旋光比色方法如下:
预热旋光仪5—10min,取甲醇装入已洗净的旋光管中,再把旋光管放入旋光仪中,校正旋光仪零点,重复5次,取其平均值为零点。再取已准确配制得化合物1的甲醇溶液,重复以上操作,记下读数,即测得旋光度。
3、结构确定:
(1)化合物1
无色透明油状物,HR-ESIMS给出化合物的分子式为C30H42O16(测量值m/z683.23541[M+H]+,计算值为681.24729),有10个不饱和度。1H NMR(Table 1)和HSQC谱图显示有2个甲基,4.87(overlapped with solvent signal),4.34(1H,td,J=5.6,3.1Hz);4个次甲基,3.89(1H,dd,J=12.0,5.8Hz),3.73(1H,dd,J=12.0,3.2Hz),2.61(2H,dd,J=8.9,6.7Hz),1.81(2H,dddd,J=13.9,7.9,6.7,1.4Hz),3.57(2H,t,J=6.5Hz);1个角甲基,3.81(3H,s);6个芳香质子信号,7.05(1H,d,J=2.0Hz),7.01(1H,d,J=1.9Hz),6.86(1H,dd,J=8.3,1.9Hz),6.82(1H,d,J=8.2Hz),6.79(1H,dd,J=8.3,2.0Hz),6.76(1H,d,J=8.1Hz);一个葡萄糖的7个质子信号和一个阿拉伯糖的6个质子信号,4.77(1H,d,J=7.7Hz),3.53(1H,ddd,J=9.9,6.2,2.2Hz),3.82(1H,d,J=3.3Hz),3.36(1H,m),3.45(1H,t,J=9.0Hz),4.06(1H,dd,J=10.9,2.2Hz),3.60(1H,m),4.93(1H,d,J=1.3Hz),4.00(1H,dd,J=3.3,1.4Hz),3.49(1H,dd,J=9.3,7.6Hz),3.95(1H,td,J=5.6,3.3Hz),3.89(1H,m),3.73(1H,d,J=3.3Hz)。13C NMR数据(Table 1)结合HSQC谱显示高场有2个亚甲基碳信号δC 73.4,87.1;4个次甲基碳信号δC 61.6,32.6,35.5,62.3;1个角甲基碳信号δC 56.5;12个芳香碳信号δC 134.1,111.7,148.8,147.3,115.9,120.9,138.3,120.4,149.4,147.9,120.2,124.5;一个葡萄糖的6个碳信号和一个阿拉伯糖的5个碳信号δC 103.7,76.9,79.0,71.8,77.7,68.0,109.7,83.2,75.1,85.9,63.1。HMBC相关谱(图2)中显示H-7与C-1、C-2、C-6、C-8和C-9有相关,H-OCH3与C-3有相关以及1H-1H-COSY相关谱(图3)显示H-7/H-8、H-8/H-9、H-5/H-6有相关可以确定苯丙素的结构;进一步分析HMBC相关谱H-7'到C-1'、C-2'、C-6'之间的相关,C-8'和C-9'以及1H-1H-COSY相关谱中H-7'和H-8'、H-8'和H-9'、H-5'和H-6'的相关可以确定苯丙醇的结构(图4)。
化合物1中1-苯基-2-芳氧基丙烷-1,3-二醇部分在C-7和C-8处的绝对构型通过对NOESY光谱和CD光谱证据的分析得到了确认。NOESY光谱(图5)中H-8和H-2/H-6、H-8和H-7之间的相关以及H-7和H-8之间的偶合常数(J=5.6Hz)表明化合物1具有相对的苏氨酸构型。根据化合物1的CD光谱(图6)确定C-7和C-8处的绝对构型为7R和8R,在220-250nm区域显示负Cotton效应。经酸水解衍生化、旋光比色法鉴定糖组分为D-葡萄糖和L-阿拉伯糖。
最终确定化合物1的结构为8-羟基香叶醇-1-O-(6-O-没食子酸)-β-D-吡喃葡萄糖苷-7R,8R-苏氨酸-4,7,9,9'-四羟基-3-甲氧基-8-O-4'-新木聚糖-3'-O-(6-α-L-阿拉伯呋喃糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷,结构为:具体测试结果数据为: 1H和13CNMR数据见表1;UV(MeOH)λmax(logε)280(2.86),224(3.33);ECD(c 1.05×10-3M,|MeOH),Δε196nm+6.50,Δε225nm+7.00,Δε239nm-10.95;IR(KBr)ν:3436,2924,2857,1734,1630,1613,1458,1422,1269,1646,644cm-1;HR-ESIMS:m/z 681.23541[M+Na]+,calcd.for 681.24729。表1化合物1的1HNMR、13CNMR、HMBC、1H-1HCOSY(700/175MHz)数据
(2)化合物2
化合物2为白色晶体,HR-ESIMS给出化合物的分子式为C21H30O11(测量值m/z481.16779[M+H]+,计算值为481.17881),有7个不饱和度。1H NMR(表2)和HSQC谱图(图7)显示有2个次甲基,2.78(2H,m),2.80(2H,m);1个叫角甲基,2.12(3H,s);4个芳香质子信号,7.14(2H,m),7.02(2H,m);一个葡萄糖的7个质子信号和一个五碳糖的6个质子信号,4.85(1H,s),3.58(1H,dd,J=8.8,6.8Hz),3.63(1H,ddd,J=9.9,6.2,2.1Hz),3.35(1H,m),3.44(1H,m),4.10(2H,dd,J=11.5,2.1Hz),3.77(1H,dt,J=4.6,2.2Hz),4.31(1H,d,J=6.8Hz),3.49(1H,dd,J=8.8,3.5Hz),3.71(1H,m),3.44(1H,m)。13C NMR数据(表1)结合HSQC谱(图7)显示高场有2个次甲基碳信号δC 46.0,30.1;1个角甲基碳信号δC 30.0;6个芳香碳信号δC 136.3,130.3,117.8,157.3,117.3,130.3;一个葡萄糖的6个碳信号和一个阿拉伯糖的5个碳信号δC 104.9,72.5,77.3,71.5,74.9,69.3,102.2,74.1,77.8,69.5,66.7。基于以上信息,我们推测化合物2是一个丁酚的糖苷。
HMBC相关谱(图8)中显示H-7和C-1、C-5和C-6以及从H-8和C-2的相关,再结合1H-1H-COSY(图9)相关谱中H-2和H-3、H-5和H-6的相关,分析表明化合物2是苯丙酮的二糖苷。糖基和侧链的位置根据HMBC相关谱中显示H-1'和C-4以及H-1”和C-6'有相关得到确认(图10)。经酸水解衍生化、旋光比色法鉴定,糖组分为D-葡萄糖和D-木糖。
最终确定化合物2的结构为丁基苯酚-4'-O-(6-β-D-木糖基)-β-D-葡萄糖苷,结构为:具体测试结果数据为 1H和13CNMR数据见表2;UV(MeOH)λmax(logε)224(2.96);IR(KBr)ν:3417,2926,2525,1697,1611,1515,1392,1317,1240,1084,822,771,665,570,515cm-1;HR-ESIMS:m/z 481.16779[M+Na]+,calcd.for481.17881。
表2化合物2的1HNMR、13CNMR、HMBC、1H-1HCOSY(700/175MHz)数据
(3)化合物3
化合物3为无色透明油状物,通过HR-ESIMS结果得出有9个不饱和度。1H NMR结果显示有2个甲基,4.87(与溶剂峰重合),4.34(1H,td,J=5.6,3.1Hz);4个次甲基,3.89(1H,dd,J=12.0,5.8Hz),3.73(1H,dd,J=12.0,3.2Hz),2.61(2H,dd,J=8.9,6.7Hz),1.81(2H,dddd,J=13.9,7.9,6.7,1.4Hz),3.57(2H,t,J=6.5Hz);1个角甲基,3.81(3H,s);6个芳香质子信号,7.05(1H,d,J=2.0Hz),7.01(1H,d,J=1.9Hz),6.86(1H,dd,J=8.3,1.9Hz),6.82(1H,d,J=8.2Hz),6.79(1H,dd,J=8.3,2.0Hz),6.76(1H,d,J=8.1Hz);一个葡萄糖的7个质子信号,4.77(1H,d,J=7.7Hz),3.53(1H,ddd,J=9.9,6.2,2.2Hz),3.82(1H,d,J=3.3Hz),3.36(1H,m),3.45(1H,t,J=9.0Hz),4.06(1H,dd,J=10.9,2.2Hz),3.60(1H,m)。13CNMR结果显示高场有2个亚甲基碳信号δC 73.4,87.1;4个次甲基碳信号δC 61.6,32.6,35.5,62.3;1个角甲基碳信号δC 56.5;12个芳香碳信号δC 134.2,111.7,148.8,147.0,115.9,120.9,138.3,120.4,149.8,147.9,120.2,124.4;一个葡萄糖的6个碳信号和一个阿拉伯糖的5个碳信号δC103.7,75.3,78.2,71.4,77.9,62.6。通过以上检测结果数据与已知化合物比较,确定化合物3为已知化合物:7R,8R-苏氨酸-4,7,9,9'-四羟基-3-甲氧基-8-O-4'-新木聚糖-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。结构为:
(4)化合物4
化合物4为白色晶体,通过HR-ESIMS结果得出有6个不饱和度。1H NMR结果显示有2个次甲基,2.78(2H,m),2.80(2H,m);1个叫角甲基,2.12(3H,s);4个芳香质子信号,7.14(2H,m),7.02(2H,m);一个葡萄糖的7个质子信号,4.85(1H,s),3.58(1H,dd,J=8.8,6.8Hz),3.63(1H,ddd,J=9.9,6.2,2.1Hz),3.35(1H,m),3.44(1H,m),4.10(2H,dd,J=11.5,2.1Hz),3.77(1H,dt,J=4.6,2.2Hz)。13C NMR结果显示高场有2个次甲基碳信号δC46.0,30.2;1个角甲基碳信号δC 30.2;6个芳香碳信号δC 136.4,130.2,117.8,157.5,117.8,130.2;一个葡萄糖的6个碳信号δC 102.5,71.4,78.2,74.9,78.0,62.5。通过以上检测结果数据与已知化合物比较,确定化合物4为已知化合物:4-(4'-羟基苯基)-2-丁酮-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。结构为:
以下通过实验例证明本发明从地榆中提取的化合物1~4的有益效果。
实验例1、MTT法检测细胞毒性
1、实验方法
取对数期RAW264.7细胞,以1×l05个/mL的密度将巨噬细胞悬浊液接种于96孔细胞培养板上,每个孔加入100μL细胞悬浊液,放入孵箱培养24h,然后加入含不同浓度化合物1-4(15、30、60、120μg/mL)的DMEM溶液,每个样品6个重复孔。放入孵箱继续培养24h后,每孔加入20μL MTT溶液,操作过程避光。放入孵箱继续孵育4h,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)溶液,避光轻微震荡,待培养板内结晶完全溶解后,酶标仪于570nm处测定OD值,并计算细胞增殖率。
2、实验结果和结论
细胞增殖率均大于90%,表明从地榆中提取得到的化合物1~4在15、30、60、120μg/mL的浓度下对细胞增殖没有抑制作用,以上结果说明本发明化合物1~4没有明显的细胞毒性。
实验例2、Griess法检测细胞NO释放量
1、实验方法
取对数期RAW264.7细胞,以1×105个/mL的密度将细胞悬浊液接种于24孔细胞培养板上,每孔加入1mL细胞悬液,加入LPS(100mg/mL)刺激巨噬细胞产生炎症,孵箱培养24h,同时设置不加LPS的对照组。向LPS刺激后巨噬细胞中分别加入含不同浓度化合物1~4(7.5、15、30μg/mL)的DMEM溶液,放入细胞孵箱继续培养24h,同时设置不加化合物1~4的LPS组作为阴性对照。按照NO试剂盒操作,每个样品重复6个孔,使用酶标仪于550nm处测定OD值并计算NO含量。
2、实验结果和结论
如图11所示,LPS刺激巨噬细胞后,细胞NO释放量相比于没有加入LPS刺激的对照组有极其显著的升高。LPS刺激后没有加入化合物1~4的LPS组NO释放量达到9μM。加入化合物1~4继续培养的实验组和LPS组相比,NO的产生量显著降低。具体而言,加入化合物1(30μM)后,细胞NO释放量降低到了4μM;加入化合物2(30μM)后,细胞NO释放量降低到了5μM;加入化合物3(30μM)后,细胞NO释放量降低到了5.3μM;加入化合物4(30μM)后,细胞NO释放量降低到了6μM。
以上结果说明从地榆中提取得到的化合物1~4对LPS诱导炎症反应的巨噬细胞一氧化氮的产生有明显的抑制作用,反映出优异的抗炎特性。
实验例3、ELISA法检测细胞IL-6、TNF-α释放量
1、实验方法
取对数期RAW264.7细胞,以1×105个/mL的密度将细胞悬浊液接种于24孔细胞培养板上,每孔加入1mL细胞悬液,加入LPS(100mg/mL)刺激巨噬细胞产生炎症,孵箱培养24h,同时设置不加LPS的对照组。向LPS刺激后的巨噬细胞中分别加入含不同浓度化合物1-4(7.5、15、30μg/mL)的DMEM溶液,放入细胞孵箱继续培养24h,同时设置不加化合物1~4的LPS组作为阴性对照。按照ELISA试剂盒说明书进行实验操作后,于450nm处测定各OD值,根OD值,计算TNF-α、IL-6细胞因子释放水平。
2、实验结果和结论
如图12所示,LPS刺激巨噬细胞后,细胞IL-6和TNF-α的释放量相比于没有加入LPS刺激的对照组有极其显著的升高。LPS刺激后没有加入化合物1~4的LPS组IL-6释放量达到110pg/mL,TNF-α的释放量达到了25ng/mL。加入化合物1~4继续培养的实验组和LPS组相比,IL-6和TNF-α的释放量均显著降低。具体而言,加入化合物1(30μM)后,细胞IL-6释放量降低到了40pg/mL,TNF-α释放量降低到了16ng/mL;加入化合物2(30μM)后,细胞IL-6释放量降低到了75pg/mL,TNF-α释放量降低到了16ng/mL;加入化合物3(30μM)后,细胞IL-6释放量降低到了60pg/mL,TNF-α释放量降低到了17ng/mL;加入化合物4(30μM)后,细胞IL-6释放量降低到了63pg/mL,TNF-α释放量降低到了22ng/mL。
以上结果说明从地榆中提取得到的化合物1~4对LPS诱导炎症反应的巨噬细胞TNF-α、IL-6的释放了有明显抑制作用,反映出优异的抗炎特性。
综上,本发明提供了从地榆根中分离得到了两个新的酚苷类化合物和两个已知的化合物,利用核磁共振、高分辨电子显微镜(HR-ESIMS)和酸水解反应等方法对提取得到的化合物的结构进行了表征。并且发现从地榆中提取分离出的化合物1-4通过减少炎症介质如NO、IL-6和TNF-α的产生,表现出优异的抗炎特性,在制备治疗炎症性疾病的药物领域具有很好的应用前景,为临床提供了新的选择。
Claims (6)
1.一种从地榆中提取分离化合物1、化合物2的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取地榆药材10kg,粉碎,用70%乙醇回流,浓缩至无醇味,得浸膏1.37kg;
(2)将步骤(1)所得浸膏上样到8×80cm的D101大孔树脂柱层析,用乙醇含量依次为0、30%、50%、70%、95%的乙醇-水溶液梯度洗脱,得到5个组分;
(3)将步骤(2)得到的30%乙醇组分0.74kg上样到60×5cm的HP-20大孔树脂柱层析,用乙醇含量依次为0、10%、20%、30%、40%、50%、100%的乙醇-水溶液梯度洗脱得7个组分F1—F7;
(4)将步骤(3)得到的F3组分120g上样至6×80cm的HPD-400大孔树脂柱层析,用乙醇含量依次为10%、30%、95%的乙醇-水溶液梯度洗脱得到3个组分F3a—F3c;
(5)将步骤(4)得到的F3b组分24g上样至5×80cm的MCI反向色谱柱层析,用乙醇含量依次为20%、25%、30%、35%、100%的乙醇-水溶液梯度洗脱得到3个组分F3b1—F3b3;
(6)将步骤(5)得到的F3b3经制备高效液相色谱法分离纯化,得到化合物1、化合物2;所述制备高效液相色谱配备250nm×10nm,210nm的Kromasil RP-C18柱;
所述分离纯化得到化合物1的条件为:MeOH/H2O:20:80v/v,3mL/min;tR:19min等度洗脱;分离纯化得到化合物2的条件为:MeOH/H2O:30:70v/v;3mL/min,tR:20min等度洗脱;
所述化合物1的结构为:
所述化合物2的结构为:
2.权利要求1所述的方法提取分离得到的化合物1、化合物2在制备抗炎药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述抗炎药物为减少炎症介质产生的药物。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述炎症介质为一氧化氮、TNF-α和IL-6。
5.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述抗炎药物为治疗炎症性疾病的药物。
6.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述化合物1、化合物2是从地榆根中提取分离得到的化合物。
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