CN105738501A

CN105738501A - 同时测定地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的hplc方法

Info

Publication number: CN105738501A
Application number: CN201610070780.6A
Authority: CN
Inventors: 邓赟; 胡佳; 王泽宇; 广兵; 康敏; 李鸿翔
Original assignee: Chengdu Diao Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Chengdu Diao Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2016-07-06

Abstract

本发明公开了一种同时测定地榆类制剂中没食子酸和(+)?儿茶素含量的HPLC方法，可以简便、快速、准确地同时测定没食子酸和(+)?儿茶素的含量。其中，没食子酸的检测限达到0.62ng，平均回收率达98.99％；(+)?儿茶素的检测限达到12.20ng，平均回收率达101.09％。因此，本发明的方法可以更全面地监控地榆类制剂中的活性成分含量，更真实地反映药品的内在质量，为地榆类制剂的质量控制提供了有效保障。

Description

同时测定地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的HPLC 方法

技术领域

本发明涉及药品的检测，具体涉及同时测定地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的HPLC方法。

背景技术

地榆(拉丁学名：Sanguisorba officinalis L.)是蔷薇科地榆属多年生草本植物，纺锤形粗壮跟，短柄小叶，紫红色花瓣，果实包藏萼筒内。别名“黄爪香”、“玉札”、“玉豉”或“酸赭”等。分布在亚洲北温带、广布于欧洲以及中国，生长于海拔30米至3000米的地区，常生于灌丛中、山坡草地、草原、草甸及疏林下，已由人工引种栽培。

地榆也是中草药，性寒，味苦酸，无毒；归肝、肺、肾和大肠经。有凉血止血，清热解毒，培清养阴，消肿敛疮等功效。

地榆升白片是目前较为常见的地榆类制剂，它由地榆单味药加工制成的片剂，具有升高白细胞数量的作用，临床上常作为化疗期间的辅助用药，也可用于治疗精神病药所致的白细胞减少症、干扰素治疗乙型肝炎所致的白细胞减少症。

地榆升白片制剂标准收载于《国家中成药标准汇编》口腔肿瘤儿科分册，具体制法为：取地榆，粉碎成细粉，加入淀粉、蔗糖和糊精，混匀，制成颗粒，干燥，压片，包糖衣或薄膜衣，即得。由于没食子酸(gallic acid)是地榆药材的主要药材成分之一，该标准的含量测定项下测定了没食子酸的含量。然而，(+)-儿茶素((+)-catechin)同样是地榆药材中很重要的一个活性成分，其具有降低辐射对造血组织的损伤，促进造血功能恢复的作用。因此，实际中也有必要对地榆升白片中的(+)-儿茶素的含量同时进行监控，以更真实地反映药品的内在质量。

然而，目前也没有对于地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的测定方法报道，更没有对于地榆升白片中没食子酸和(+)-儿茶素含量的测定方法报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种同时测定地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的HPLC方法，它包括以下步骤：

(1)制备没食子酸和(+)-儿茶素的对照品溶液：取没食子酸和(+)-儿茶素对照品，混合，用甲醇或乙醇分别配制成具有浓度梯度的对照品溶液；

(2)制备供试品溶液：取地榆类制剂或其粉末，除去包衣，甲醇或乙醇提取，过滤，得供试品溶液；

(3)分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪进行检测；

色谱条件如下：

色谱柱：C18色谱柱；

检测波长：280nm；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为磷酸体积浓度为0.03％～0.2％的水溶液，梯度洗脱；

梯度洗脱程序如下：

0～18min，流动相A的体积分数从5％线性变化到14％；18～50min，流动相A的体积分数从14％线性变化到21％；50～53min，流动相A的体积分数从21％线性变化到55％；53～55min，流动相A的体积分数从55％线性变化到5％；55～65min，流动相A的体积分数保持在5％；

(4)绘制标准曲线，计算地榆类制剂中的没食子酸和(+)-儿茶素的含量。

进一步地，所述色谱条件的柱温为25℃～35℃。更进一步地，所述柱温为30℃。

进一步地，所述色谱条件的流速1.0mL/min。

进一步地，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。更进一步地，所述色谱柱为岛津Inertsil ODS-3。

进一步地，步骤(1)中，所述甲醇的浓度是5％。

进一步地，步骤(2)中，所述提取是回流提取。

进一步地，步骤(2)中，所述甲醇的浓度是50％。

进一步地，步骤(2)中，所述样品与甲醇的重量体积比为0.12g/mL。

进一步地，步骤(3)中，所述流动相B为磷酸体积浓度为0.05％的水溶液。

进一步地，步骤(3)中，所述色谱条件的进样量为20μL。

进一步地，所述地榆类制剂是以地榆原粉为原料，加上药学上可接受的辅料制备得到的制剂。更进一步地，所述制剂是片剂。更进一步地，所述片剂是地榆升白片。

本发明中，所述的“甲醇”、“乙醇”均包括它们任意浓度下的水溶液。

本发明通过对色谱条件的优化，使没食子酸和(+)-儿茶素的色谱峰与杂质色谱峰分离良好，并且线性关系优异，精密度、稳定性和重复性试验的RSD均小于2％。其中，没食子酸的检测限达到0.62ng，平均回收率达98.99％；(+)-儿茶素的检测限达到12.20ng，平均回收率达101.09％。

因此，本发明成功建立了地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的HPLC测定方法，可以简便、快速、准确地同时测定没食子酸和(+)-儿茶素的含量，可以更全面地监控地榆类制剂中的活性成分含量，更真实地反映药品的内在质量，为地榆类制剂的质量控制提供了有效保障。本发明检测方法使用的设备为高效液相色谱/HPLC，广泛配备于各制药企业，普遍易得，设备的购置和使用成本相对低，对待测物质的要求适中，不要求使用高纯度的待测物质。因此，本发明检测方法尤其适用于广大制药企业使用，而不需要再购置其他分析设备。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为没食子酸和(+)-儿茶素对照品色谱图，峰1是没食子酸的色谱峰，峰2是(+)-儿茶素的色谱峰。

图2为采用高浓度甲醇配制对照品溶液时，没食子酸的峰。

图3为采用5％浓度甲醇配制对照品溶液时，没食子酸的峰。

图4为地榆升白片制剂的色谱图，峰1是没食子酸的色谱峰，峰2是(+)-儿茶素的色谱峰。

图5为没食子酸的DAD光谱图。

图6为(+)-儿茶素的DAD光谱图

具体实施方式

实施例1本发明的HPLC方法及方法学验证

一、同时测定地榆升白片中没食子酸和(+)-儿茶素的含量

1仪器、试剂与药品

SSI series 1500高效液相色谱仪(美国SSI公司)，紫外检测器，CSChrom Plus色谱工作站；色谱柱Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm，5μm，GL Sciences lnc.)；KQ-600DE型数控超声波清洗器(40KHz，600W)；十万分之一电子天平(瑞士奥豪斯DV-215-CD)；优普 UPT系列超纯水器(成都优普电子产品有限公司)。

地榆升白片(批号141215、141111、140811、141208，由成都地奥制药集团有限公司提供)；没食子酸对照品(批号：11083-201204，购于中国药品生物制品鉴定所)，(+)-儿茶素对照品(批号：110877-201203，购于中国药品生物制品鉴定所)。液相用甲醇为色谱级(美国J.T.Baker)，水为超纯水，其余试剂为分析级。

2方法与结果

2.1色谱条件

Inertsil ODS-3色谱柱，(250mm×4.6mm，5μm；GL Sciences Inc.)；流动相为甲醇-0.05％磷酸，梯度洗脱(0～18min，5％～14％；18～50min，14％～21％；50～53min，21％～55％；53～55min，55％～5％；55～65min，5％)；检测波长280nm；体积流量1mL/min；柱温30℃；进样量20μL，结果如图1所示。

从图1中可以看出，本发明的色谱条件下，没食子酸和(+)-儿茶素均与样品中其他组分色谱峰达到基线分离，分离效果好。

2.2对照品溶液的制备

前期实验中发现，当采用高浓度甲醇配制对照品溶液时，没食子酸峰会出现小峰，例如，当甲醇浓度为100％时，其结果如图2所示。本发明通过对该步骤甲醇浓度进一步地调整，优选5％的甲醇配制对照品溶液，其结果如图3所示。可以看出，该浓度下没食子峰的峰型较优。

分别精密称取没食子酸、(+)-儿茶素对照品适量，置同一量瓶中，5％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备溶液，分别为没食子酸1.041mg/mL、(+)-儿茶素1.045mg/mL。

分别精密吸取制备的混合对照品贮备溶液适量，加5％甲醇稀释，分别配制成含没食子酸对照品20.82、41.64、83.28、104.10、166.56、187.38μg/mL，含(+)-儿茶素对照品20.90、41.80、83.60、104.50、167.20、188.10μg/mL的混合对照品溶液，在“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以质量浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，进行线性回归，得混合对照品的标准曲线和各对照品回归方程。

2.3供试品溶液的制备

由于地榆升白片仅含一味药材，且为原粉入药，预实验发现制剂赋形剂不影响测定，所以供试品溶液的制备采用《国家中成药标准汇编》中地榆升白片供试品溶液的制备工艺。

取地榆升白片(批号：141215)40片，除去包衣，精密称定，研细，取约3.0g，精密称定，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，加热回流1h，放冷至室温，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4含量测定

取4批地榆升白片制剂，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，计算，结果见表1。

表1地榆升白片含量测定结果

二、本发明方法的方法学验证

2.5线性关系，检测限和定量限

分别精密吸取“2.2”项下制备的混合对照品贮备溶液适量，加5％甲醇稀释，分别配制成含没食子酸对照品20.82、41.64、83.28、104.10、166.56、187.38μg/mL，含(+)-儿茶素对照品20.90、41.80、83.60、104.50、167.20、188.10μg/mL的混合对照品溶液，在“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以质量浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，进行线性回归，得混合对照品的标准曲线和各对照品回归方程。

将对照品溶液用甲醇不断进行稀释后分析，分别得到没食子酸和(+)-儿茶素的检测限LOD值(S/N≈3)和定量限LOQ值(S/N≈10)。目标化合物的回归方程、相关系数(r)、线性范围、检测限和定量限见表2。

表2地榆升白片中没食子酸和(+)-儿茶素的线性关系

表2的结果表明，没食子酸和(+)-儿茶素在线性范围内浓度与峰面积线性关系良好，方法灵敏度高。

2.6精密度试验

精密吸取同一对照品溶液20μL，重复进样6次，记录峰面积，结果显示，没食子酸和(+)-儿茶素的峰面积RSD值分别为1.19％、1.44％，说明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验

取本品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、8、12、24、48h照“2.1”项下色谱条件测定，由峰面积计算稳定性，没食子酸和(+)-儿茶素的RSD分别为1.36％、1.64％。

结果表明供试品溶液在48h内稳定性良好。

2.8重复性试验

称取同一批地榆升白片(批号：141215)6份，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，将测定没食子酸和(+)-儿茶素的峰面积代入“2.5”项下的回归方程，计算。结果显示，没食子酸和(+)-儿茶素的RSD分别为1.06％、1.21％，表明方法重复性良好。

2.9加样回收率试验

精密称取已知含量的样品(批号：141215)共6份各约1.8g，加入1.2mL的含没食子酸对照品1.046mg/mL、含(+)-儿茶素对照品1.045mg/mL的对照品溶液，照2.3项下制备，按2.1项色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表3。

表3没食子酸、(+)-儿茶素的加样回收率(n＝6)

表3的结果表明，没食子酸平均回收率98.99％，RSD为1.88％；(+)-儿茶素平均回收率为101.09％，RSD为0.58％，证明本发明的方法准确度高。

结合2.4项和2.5项的结果可知，没食子酸和(+)-儿茶素线性范围的下限和测定样品中的量均远高于定量限，说明本发明方法具有灵敏的定量检测能力。

实施例2本发明色谱条件的筛选

(1)波长的选择

DAD全波长扫描，没食子酸的DAD光谱图如图5所示，(+)-儿茶素的DAD光谱图如图6所示。

结果显示，(+)-儿茶素除末端吸收外，还有一强吸收带，对应的λ值为280nm，与此同时，没食子酸在此条件下也有较好的吸收，故选择280nm作为同时测定两种成分的检测波长。

(2)梯度洗脱程序、柱温、流速和色谱柱的筛选

发明人对梯度洗脱程序、柱温、流速和色谱柱进行了考察。

考察时，先考察了主要因素，即梯度洗脱程序，在考察梯度洗脱程序的时候，对柱温、流速、色谱柱型号采取通用参数，即柱温30℃、流速1.0mL/min^-1、色谱柱Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm，5μm，GL Sciences lnc.)。

确定最佳梯度洗脱程序后，再对其他因素——柱温、流速、色谱柱型号进行了单因素筛选考察。

具体如下：

1、梯度洗脱程序的考察

梯度洗脱程序①：0～80min，5％～45％；80～90min，45％～55％，90～91min，55％～5％；91～100min，5％。

结果如下所示：

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	16.115	1.33
(+)-儿茶素	41.953	1.56

梯度洗脱程序②：0～18min，5～14％；18～50min，14％～21％；50～60min，21％～26％；60～65min，26％～45％；65～70min，45％～55％；70～75min，55％～5％；75～77min，5％。

结果如下所示：

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	14.197	1.63
(+)-儿茶素	42.307	1.5

梯度洗脱程序③：0～18min，5～14％；18～50min，14％～21％；50～53min，21％～55％；53～55min，55％～5％；55～65min，5％。

结果如下所示：

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	14.665	4.29
(+)-儿茶素	43.338	2.0

综合上述保留时间、洗脱时间及分离度，最终确定梯度洗脱程序为条件③，即本发明的梯度洗脱程序。

2、柱温考察

①25℃

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	16.01	1.43
(+)-儿茶素	47.10	2.35

②30℃

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	14.48	4.32
(+)-儿茶素	42.97	4.05

③35℃

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	14.97	1.74
(+)-儿茶素	44.34	3.57

结果显示，柱温为30℃时效果较优。

3、流速考察

①0.8mL/min

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	17.73	0.95
(+)-儿茶素	46.55	1.50

②1.0mL/min

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	14.54	1.81
(+)-儿茶素	42.81	1.9

③1.2mL/min

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	11.56	0.73
(+)-儿茶素	35.29	1.97

结果显示，流速1.0mL/min时效果较优。

4、色谱柱考察

①岛津Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm，5μm)

②TIANHE Kromasil C18(200mm×4.6mm，5μm)

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	11.04	1.66
(+)-儿茶素	35.65	0.85

③Grace Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)

检测目标化合物	保留时间	分离度
			没食子酸	13.36	1.12
(+)-儿茶素	39.99	1.65

结果显示，色谱柱为岛津Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm，5μm)时效果较优。

综上所述，本发明成功建立了地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的HPLC测定方法，可以简便、快速、准确地同时测定没食子酸和(+)-儿茶素的含量，可以更全面地监控地榆类制剂中的活性成分含量，更真实地反映药品的内在质量，为地榆类制剂的质量控制提供了有效保障。

Claims

1.同时测定地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的HPLC方法，其特征在于：它包括以下步骤：

色谱条件如下：

色谱柱：C18色谱柱；

检测波长：280nm；

梯度洗脱程序如下：

2.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为25℃～35℃。

3.根据权利要求2所述的HPLC方法，其特征在于：所述柱温为30℃。

4.根据权利要求1-3任一项所述的HPLC方法，其特征在于：所述色谱条件的流速1.0mL/min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的HPLC方法，其特征在于：所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。

6.根据权利要求5所述的HPLC方法，其特征在于：所述色谱柱为岛津Inertsil ODS-3。

7.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(1)中，所述甲醇的浓度是5％；步骤(2)中，所述甲醇的浓度是50％，所述提取是超声提取或回流提取；步骤 (3)中，所述流动相B为磷酸体积浓度为0.05％的水溶液，所述色谱条件的进样量为20μL。

8.根据权利要求7所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(2)中，所述样品与甲醇的重量体积比为0.12g/mL。

9.根据权利要求1-8任一项所述的HPLC方法，其特征在于：所述地榆类制剂是以地榆原粉为原料，加上药学上可接受的辅料制备得到的制剂，优选为片剂。

10.根据权利要求9所述的HPLC方法，其特征在于：所述片剂是地榆升白片。