KR20120127316A - 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법 - Google Patents

생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120127316A
KR20120127316A KR1020120050419A KR20120050419A KR20120127316A KR 20120127316 A KR20120127316 A KR 20120127316A KR 1020120050419 A KR1020120050419 A KR 1020120050419A KR 20120050419 A KR20120050419 A KR 20120050419A KR 20120127316 A KR20120127316 A KR 20120127316A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
caffeine
catechin
solution
methanol
biological sample
Prior art date
Application number
KR1020120050419A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101387872B1 (ko
Inventor
최양호
김지민
Original Assignee
경상대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상대학교산학협력단 filed Critical 경상대학교산학협력단
Priority to KR1020120050419A priority Critical patent/KR101387872B1/ko
Publication of KR20120127316A publication Critical patent/KR20120127316A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101387872B1 publication Critical patent/KR101387872B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/08—Eggs, e.g. by candling
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/12—Meat; Fish
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 HPLC를 이용하여 녹차성분을 함유하는 생물의 검체 내 카페인 및 카테킨을 용이하게 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 HPLC를 이용한 분석방법을 이용하면 실제 녹차성분을 섭취한 닭, 젖소, 돼지 등의 축산 동물로부터 채취된 간, 근육, 장액, 혈액 등의 조직 생검(biopsy), 계란 및 우유 등의 축산물, 또는 이의 가공물로부터 카테킨 및 카페인과 같은 유용물질을 동시에 용이하게 분리 및 분석할 수 있는 효과가 있으며, 이와 같은 분석법을 이용하여 생물 검체 내 신규한 녹차성분을 동정할 수도 있어 축산관련 산업 발전에 큰 도움을 줄 수 있다.

Description

생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법{Method for the co-detection of catechins and caffeine in biospecimens}
본 발명은 HPLC를 이용하여 녹차성분을 함유하는 생물의 검체로부터 카페인 및 카테킨을 용이하게 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.
녹차는 차나무(Camellia sinensis)의 잎을 말린 것으로서, 최근 인간의 건강에 대한 관심이 증대됨에 따라 그 소비가 급증하고 있다. 녹차에는 카페인(caffeine), 카테킨(catechin)류, 플라보노이드(flavonoids), 토코페롤류, 플로오로화물(fluoride), 다당류, 비타민, 아스코르빈산, 테아닌(theanine), 아미노산 등 여러 기능성 물질을 함유하고 있어 일반 식물과는 달리 혈액 순환, 항암, 항산화, 노화억제, 항당뇨, 항균, 인체 독성 제거 등의 여러 생리활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 현재도 그 효능에 대한 연구가 계속하여 이루어지고 있다.
그 중에서도 카테킨 성분은 녹차에서 찾아볼 수 있는 고유의 성분으로 강한 항산화 효과와 항암성 기능 등 매우 유용한 생리 활성을 가지고 있으며, 녹차가 여러 생리활성을 발휘하는 데 가장 중요한 역할을 하는 성분이다. 이로 인해 다른 물질들보다 더 많은 연구가 진행되고 있으며, 카테킨의 긍정적 효과로서는 콜레스테롤 감소, 항산화, 혈소판 응고 방지 등이 있다. 녹차에 포함된 카테킨 성분으로는 갈로카테킨(gallocatechin: GC), 에피카테킨(epicatechin: EC), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate: ECG), 에피갈로카테킨(epigallocatechin: EGC), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigalocatechin gallate: EGCG) 등이 있다.
녹차에 함유된 카테킨의 함량은 일반적으로 차 재배지역의 기후, 토양 등의 재배 환경과 채취 시기에 따라 성분의 함량과 조성 비율이 다르게 나타나지만, 카테킨 함량은 평균적으로 차 잎의 총 건중량 대비 10 ~ 15%이며, 가장 활성이 뛰어난 것으로 알려진 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG)가 카테킨 성분 중 50 ~ 60%를 차지한다고 알려져 있다.
따라서 현재까지 녹차로부터 기능성 물질을 분리하기 위한 기술은 크게 녹차로부터 카테킨을 분리하는 기술과 그 카테킨 중에서 가장 생리활성이 높은 것으로 알려진 에피갈로카테킨 갈레이트를 분리하기 위한 기술로 대별할 수 있다.
분리 수단으로 HPLC를 주로 이용하고 있으나 대부분 아세트산이나 인산 등 완충용시약 등의 pH 조절제를 HPLC 이동상에 첨가하여 사용하고 있다. 단순히 이들 성분의 분석만을 목적으로 할 때는 이들 pH 조절제가 첨가되어도 문제가 없으나, HPLC에 의해 목적성분을 분리 제조하고자 할 때 산 등은 목적성분의 손실을 가져올 수 있으며, 이동상 용액에 공존하는 인산 등의 완충용 시약의 목적성분과 다시 한 번 분리하여야 하는 어려움이 존재한다.
나아가 녹차의 카테킨은 다양한 생리활성 효과 및 약리적 효과로 인해 여러 가지 형태의 식품 및 기능성 소재로의 이용 가능성이 연구되고 있으나, 이들 카테킨의 활성성에 비해 분석방법에 대한 포괄적인 연구는 미흡한 실정이며, 카페인과 카테킨을 동시에 분리할 수 있는 방법에 대해서는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 HPLC를 이용하여 생물 검체 내 녹차 성분 분석방법을 확립하고자, 아스코르브산, 메탄올/에틸 아세테이트 및 디티온산나트륨(sodium dithionite)/Na2EDTA를 포함하는 혼합용매에 채취된 생물 검체를 균질화하고, 이렇게 균질화된 시료를 원심분리한 후 HLB 컬럼을 이용하여 카테킨 및 카페인을 분리하는 과정을 통하여 검체 내 카테킨과 카페인을 동시에 효과적으로 분석할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시 분석하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대상 생물로부터 검체를 채취하여 준비하는 단계; 준비된 생물 검체를 아스코르브산-EDTA와 혼합하는 단계; 상기 혼합물을 메탄올/에틸 아세테이트 용액과 0.3M 디티온산나트륨(sodium dithionite)/0.1% Na2EDTA 용액으로 균질화하는 단계; 상기 균질화된 용액을 농축시켜 HLB 컬럼에 적용하는 단계; HLB 컬럼에서 에틸 아세테이트를 이용하여 카페인을 추출하는 단계; 및 HLB 컬럼에서 아스코르브산-EDTA 및 메탄올/에틸 아세테이트 용액을 이용하여 카테킨을 추출하는 단계를 포함하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 대상 생물은 닭, 오리, 돼지, 소, 젖소 등의 축산용 가축일 수 있다. 또한, 생물 검체는 대상 생물로부터 채취된 간, 근육, 장액, 혈액 등의 조직 생검(biopsy), 계란 및 우유 등의 축산물, 및 이의 가공물을 포함하는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카테킨은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG), 에피카테킨(epicatechin, EC), 갈로카테킨 갈레이트(gallocatechin gallate, GCG), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate, ECG) 및 카테킨 갈레이트(catechin gallate, CG)를 포함하는 군으로부터 하나 이상 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메탄올/에틸 아세테이트 용액은 메탄올과 에틸아세테이트가 2 : 1로 혼합된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메탄올/에틸 아세테이트 용액과 상기 0.3M 디티온산나트륨(sodium dithionite)/0.1% Na2EDTA 용액은 부피비로 1 : 1이 되도록 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 농축시키는 공정은 상기 균질화된 용액을 원심분리한 후 상층액을 질소가스를 이용하여 농축시켜 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HLB 컬럼에 적용하는 공정은 농축된 용액을 포스페이트 버퍼(pH 7)로 희석하는 단계; HLB 컬럼을 메탄올과 증류수로 세척한 후, 상기 희석된 용액을 HLB 컬럼에 적용하는 단계; 및 포스페이트 버퍼(pH 3)와 포스페이트 버퍼(pH 7)를 차례로 적용하여 불순물을 제거한 후 메탄올로 컬럼을 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명은 상기 추출된 카테킨과 카페인 용액을 질소가스로 농축시킨 후 메탄올로 용해하고, 이를 여과한 후 HPLC로 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 HPLC를 이용한 분석방법을 이용하면 실제 가축 등의 생물 검체 내에 포함되어 있는 카테킨 및 카페인과 같은 유용물질을 용이하게 분리 및 분석할 수 있는 효과가 있고, 녹차사료를 섭취한 닭 등의 가축으로부터 수득한 생검, 축산물 및 이의 가공물 등으로부터 신규한 녹차성분을 동정할 수 있으며, 나아가 가축 뿐 아니라 녹차의 활성성분을 함유하는 동물 및 식물 등의 생물 검체로부터 여러 가지 녹차성분을 동시에 용이하게 분석할 수 있는 방법으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 카테킨(EGCG, EC, GCG, ECG, CG) 및 카페인(Caffeine) 표준용액을 HPLC를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 녹차 내 카테킨(EGCG, EC, GCG, ECG, CG) 및 카페인(Caffeine)을 HPLC를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 방법 1(Method 1)과 방법 2(Method 2)를 이용하여 추정한 카테킨 및 카페인 표준용액(Standard)에 대한 회수율을 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 녹차사료 처리구(0%, 1%)의 난황(egg yolk) 및 난백(egg white) 내 카테킨(EGCG, EC) 및 카페인(Caffeine)을 HPLC를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 각 녹차사료 처리구(0%, 0.4%, 1%)의 난황(egg yolk) 및 난백(egg white) 내 카테킨(EGCG, EC) 및 카페인(Caffeine) 함량 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시 분석하는 방법에 관한 것으로, HPLC를 이용하여 카테킨과 카페인을 동시에 효과적으로 분석할 수 있다는 점에 그 특징이 있다.
본 발명에 따르면 HPLC를 이용하여 생물 검체 내 녹차 성분 분석방법을 확립하고자, 아스코르브산-EDTA, 메탄올/에틸 아세테이트 및 디티온산 나트륨/Na2EDTA를 포함하는 혼합용매에 생물 검체를 균질화하고, 이렇게 균질화된 검체 시료를 원심분리한 후 HLB 컬럼을 이용하여 카테킨 및 카페인을 분리하는 과정을 통하여 생물 검체 내 카테킨과 카페인을 동시에 효과적으로 분석할 수 있다.
본 발명에서 녹차는 시중에 판매되는 가루녹차, 티백 녹차, 잎 녹차, 수확되어 건조된 녹차잎을 모두 포함할 수 있으며, 가축에게 단독으로 또는 다른 사료와 혼합하여 급여할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 카테킨은 현재까지 녹차의 카테킨 성분으로 알려진 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG), 에피카테킨(epicatechin, EC), 갈로카테킨 갈레이트(gallocatechin gallate, GCG), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate, ECG), 카테킨 갈레이트(catechin gallate, CG)를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법은 구체적으로, (a) 대상 생물로부터 검체를 채취하여 준비하는 단계; (b) 준비된 생물 검체를 아스코르브산-EDTA과 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 메탄올/에틸 아세테이트 용액과 0.3M 디티온산나트륨(sodium dithionite)/0.1% Na2EDTA 용액으로 균질화하는 단계; (d) 상기 균질화된 용액을 농축시켜 HLB 컬럼에 적용하는 단계; (e) HLB 컬럼에서 에틸 아세테이트를 이용하여 카페인을 추출하는 단계; 및 (f) HLB 컬럼에서 아스코르브산-EDTA 및 메탄올/에틸 아세테이트 용액을 이용하여 카테킨을 추출하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 대상 생물은 녹차 성분을 함유하거나 섭취할 수 있는 동물이나 식물 종이라면 어느 것이나 가능하며, 바람직하게는 닭, 돼지, 젖소 등의 가축일 수 있다. 또한, 생물 검체는 대상 생물로부터 채취된 간, 근육, 장액, 혈액 등의 조직 생검(biopsy), 계란 및 우유 등의 축산물, 및 이의 가공물을 포함하는 군으로부터 선택된 것일 수 있고, 가공물로는 축산물을 가공하여 만든 것이라면 어느 것이나 해당되며, 예를 들면 빵, 치즈, 가공 우유 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 의하면, 생물 검체로서 녹차를 섭취한 닭으로부터 채취한 간, 근육 조직 및 계란의 난황(egg yolk) 또는 난백(egg white)을 사용하여 분석을 수행하였으나 이는 본 발명의 우수성을 입증하기 위해 하나의 예를 제시한 것일 뿐 이에 제한되는 것은 아니며, 이로부터 가축 뿐 아니라 녹차 성분을 함유하는 모든 동물 및 식물의 검체로부터도 본 발명의 방법을 통해 동일한 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
본 발명을 보다 구체적으로 살펴보면, 먼저 대상 생물로부터 검체를 채취하여 준비하는데, 본 발명의 일실시예에 따르면 이때 상기 검체가 대상 생물의 근육, 간 등의 조직 생검인 경우에는 채취된 조직을 즉시 액체질소로 냉동시킨 후 추후 분석까지 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하고, 이후 분석시 그대로 사용하거나 컷팅(cutting), 슬라이싱(slicing), 찹핑(chopping) 등의 방법으로 분쇄하여 준비할 수 있다. 또한, 계란, 우유 등의 축산물 및 이의 가공물인 경우에는 채취 분리한 후 즉시 동결 건조시켜 분쇄하고 추후 분석까지 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하여 준비할 수 있다.
이후, 준비된 생물 검체를 아스코르브산-EDTA와 혼합하는데, 이때 아스코르브산-EDTA는 50 ~ 150ul의 양으로 사용할 수 있다.
다음으로 혼합물을 메탄올/에틸 아세테이트 용액과 0.3M 디티온산나트륨(sodium dithionite)/0.1% Na2EDTA 용액으로 균질화시킨다. 여기서 균질화에 사용한 메탄올/에틸 아세테이트 용액은 메탄올과 에틸아세테이트가 2 : 1 로 혼합된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 메탄올/에틸 아세테이트 용액과 0.3M 디티온산나트륨(sodium dithionite)/0.1% Na2EDTA 용액을 부피비로 1 : 1이 되도록 사용할 수 있으며, 예를 들어 0.1 ~ 0.5ml 범위의 양으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다음으로 균질화된 용액을 농축시켜 HLB 컬럼에 적용할 수 있는데, 이때 농축 공정은 바람직하게는 균질화된 용액을 원심분리한 후 상층액을 질소가스를 이용하여 농축시켜 수행할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 4℃에서 10,000g로 원심분리한 후 상층액을 질소가스로 약 0.2ml 까지 농축시켰으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서는 이렇게 농축된 용액을 HLB 컬럼에 적용하는 단계를 수행할 수 있는데, 이때 상기 단계는 농축된 용액을 포스페이트 버퍼(pH 7)로 희석하는 단계; HLB 컬럼을 메탄올과 증류수로 세척한 후 상기 희석된 용액을 컬럼에 적용하는 단계; 및 포스페이트 버퍼(pH 3)와 포스페이트 버퍼(pH 7)를 차례로 적용하여 불순물을 제거한 후 메탄올로 컬럼을 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 여기에서, 포스페이트 버퍼는 0.03 ~ 0.07M 포스페이트 버퍼를 사용할 수 있으며, 0.5 ~ 2ml의 양으로 사용할 수 있다.
이후, HLB 컬럼에서 에틸 아세테이트를 이용하여 카페인을 추출하는데, 에틸 아세테이트는 7 ~ 13ml의 양으로 사용할 수 있다.
또한, HLB 컬럼에서 1 ~ 3% 아스코르브산-EDTA 및 메탄올/에틸 아세테이트 용액(2 : 1)을 이용하여 카테킨을 추출하는데, 카테킨의 추출은 30 ~ 40℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 그리고 아스코르브산-EDTA는 15 ~ 25ul의 양으로 사용할 수 있으며, 메탄올/에틸 아세테이트 용액(2 : 1)은 5 ~ 15ml의 양으로 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 35에서 20ul 2% 아스코르브산-EDTA와, 10ml 메탄올/에틸 아세테이트 용액(2 : 1)을 사용하여 카테킨을 추출하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
마지막으로 추출된 카테킨과 카페인 용액은 질소가스로 완전히 농축시킨 후 메탄올로 용해하고, 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석한다. HPLC를 이용하여 분석할 때 해당업계에 공지된 방법으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 녹차의 주성분인 카페인이 닭의 난황 및 난백 뿐 아니라 간 및 근육 조직에서 섭취된 녹차 함량에 비례하여 현저하게 검출되는 것을 확인하였다. 한편, EGCG 및 EC 등의 카테킨은 1% 녹차사료를 섭취한 산란계의 난황에서만 증가하는 것으로 나타났다(도 4, 도 5 및 표 7 참조).
본 발명의 일실시예에 따르면, 섭취된 녹차 성분이 가축의 조직 내에 축적되는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 생물 검체로부터 녹차 성분을 HPLC로 용이하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 HPLC를 이용한 활성물질 분석방법은 실제 가축을 포함하는 동물 및 식물의 검체에 함유되어 있는 카테킨 및 카페인을 용이하게 동시에 검출하는데 사용될 수 있으며, 이러한 분석방법을 이용하여 동물 및 식물의 검체로부터 용이하게 녹차의 다른 성분들도 동정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 해당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
<1-1> 재료
에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG; E4143), 에피카테킨(epicatechin, EC; E4018), 갈로카테킨 갈레이트(gallocatechin gallate, GCG; G6782), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate, ECG; E3893), 카테킨 갈레이트(catechin gallate, CG; C0692), 카페인(C0750) 및 아스코르브산(A5960)은 Sigma (USA) 제품을 사용하였으며, 디티온산나트륨(Sodium dithionite)은 TCI(Japan)의 제품을 사용하였다.
Waters Oasis HLB 30mg 컬럼(columns)은 Waters(Milford, MA)에서 구입하여 사용하였고, 그 외 시약과 HPLC용 용액들은 Burdick & Jackson(USA)의 제품을 사용하였다.
<1-2> 실험용 동물
111일령의 단관 갈색 Hy-line 계통 레그혼종 암탉(Single Comb Brown Hy-Line Leghorn hens)을 크기가 동일한 2개의 사육실에 설치된 4칸이 한 조인 3단 직립형 케이지에 1칸에 1수씩 개별적으로 수용하였다. 사육실의 온도는 20±2℃ 내외로 유지하였고, 140일령부터 오전 6시에 점등하여 오후 9시에 소등하였다(15시간 점등). 시험 기간 동안 사료와 물은 제한 없이 공급하였다. 시험 사료는 0% 녹차사료(100% 기초사료), 0.4% 녹차사료(99.6% 기초사료 + 0.4% 녹차) 및 1% 녹차사료(99% 기초사료 + 1% 녹차)를 사용하였다(표 1 참조). 시험에 사용된 녹차는 경상남도 하동군에서 8월에 수확된 후 열 건조된 가루형태의 녹차를 사용하였다. 시험 사료 섭취 후 4주째에 산란계의 계란을 처리구 당 5개씩 무작위로 선택하여 난황과 난백을 분리한 후 동결건조를 시켰다. 이들은 실험에 사용할 때까지 -80℃에서 보관되었다.
시험 사료 조성(%)
조성 주(weeks)
16~18 19~32
Corn 59.05 56.05
Wheat bran 12.9 5
Soybean meal 17.4 20
Corn gluten meal 2.8 4
Limestone 5 12
Dicalcium phosphate 1.5 1.5
Methionone 0.3 0.3
Lysine 0.3 0.4
Vitamin-mineral mixture 0.5 0.5
Salts 0.25 0.25
합계 100 100
<1-3> HPLC 분석조건
세 가지의 기울기 용리법(gradient elution)을 사용하였다. 이동상 A는 100% 3차 증류수를, 이동상 B는 100% 메탄올을, 그리고 이동상 C는 1% 포름산(formic acid, pH 2.3)을 사용하였다. 크로마토그래피 분석 조건은 하기 표 2와 같으며, 주입량(injection volume)은 10ul, UV는 280nm, 컬럼의 온도는 30℃로 유지하고, 컬럼(column)은 Atlantis dC18 3um, 4.6×150mm를 사용하였다.
크로마토그래피 분석 조건
시간(min) 이동상 A 이동상 B 이동상 C 유속(ml/min)
0 70 20 10 1
10 60 30 10 1
20 30 60 10 1
30 70 20 10 1
< 실시예 2>
카테킨 및 카페인 표준용액 제조
50% 메탄올에 EGCG, EC, GCG, ECG, CG 및 카페인을 용해시켜 40ug/ml 카테킨 및 카페인 표준용액(standard working solution)을 만든 후 -20℃에서 보관하였다. 40 ug/ml 카테킨 및 카페인 표준용액을 HPLC로 분석한 결과, 카페인, EGCG, EC, GCG, ECG, CG의 순서대로 피크(peak)가 확인되었다(도 1 및 표 3 참조).
카테킨 및 카페인 표준용액 HPLC 분석결과
카페인 EGCG EC GCG ECG CG
시간(time) 10.5 11.6 12.6 15.2 16.3 17.8
영역(area) 4,612,160 ±13,676 1,981,159 ±9,834 13,304,067 ±5,318 2,639,486 ±17,617 3,217,908 ±25,314 3,362,698 ±35,965
< 실시예 3>
녹차 내 카테킨 및 카페인 분석
60℃로 가열된 100ml 50% 메탄올에 녹차를 2g 넣은 후 진탕배양기(shaking incubator; SI-600, Lab Companion)에서 30분 동안 100rpm으로 혼합하였다. 그리고 약 30분 동안 상온에 방치한 후 0.2ul 필터 유닛(Sartorius Stedim, 1776)으로 여과하였으며, 이 용액을 HPLC로 분석하였다.
그 결과, 녹차 내 카테킨 및 카페인의 함량은 EGCG가 가장 많았고, ECG, 카페인, GCG, EC의 순으로 나타났으며 CG는 검출되지 않았다(도 2 및 표 4 참조).
녹차 내의 카테킨 및 카페인의 함량
카페인 EGCG EC GCG ECG CG
함량
(mg/g)		 22.9±0.1 61.7±0.4 12.3±0.1 15.8±11.0 50.1±35.0 -
< 실시예 4>
생물 검체 내 녹차 성분 분석
<4-1> 표준용액 내 카페인 및 카테킨 분석방법 비교
본 발명의 분석 방법의 우수성을 확인하기 위해, 40 ug/ml 카테킨 및 카페인 표준용액을 대상으로 다음과 같이 방법 1 및 방법 2의 두 가지 실험방법으로 HPLC 분석을 수행하여 비교하였다.
방법 1
40ul/ml 카테킨 및 카페인 표준용액 900ul과 2% 아스코르브산-EDTA 100ul를 혼합하였다. 그리고 메탄올/에틸 아세테이트(2:1) 0.25ml와 0.3M 디티온산나트륨(sodium dithionite)/0.1%(w/v) Na2EDTA 0.25ml를 넣고 균질화하였다. 균질화된 샘플을 4℃에서 10,000g로 원심 분리한 후 상층액을 질소가스로 약 0.2ml까지 농축시켰다. 농축된 샘플을 0.05M phosphate buffer(pH 7) 1ml로 희석하였다. HLB 컬럼에 메탄올 1ml와 3차 증류수 2ml를 차례로 넣어 세척한 후, 희석된 샘플을 천천히 컬럼에 흘려 적용하였다. 그리고 0.05M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, pH 3) 1ml와 0.05M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, pH 7) 1ml를 차례로 넣어서 불필요한 물질들을 HLB 컬럼에서 제거하였고, 5% 메탄올 1ml로 컬럼을 세척하였다. 에틸 아세테이트 10ml를 이용하여 HLB 컬럼에서 카페인을 추출하였고, 35에서 2% 아스코르브산-EDTA 20ul와 메탄올:에틸 아세테이트(2:1) 10ml를 이용하여 HLB 컬럼에서 카테킨을 추출하였다. 추출된 카테킨과 카페인 용액을 질소가스로 완전히 농축시킨 후 50% 메탄올 1ml로 녹였다. 0.2ul 필터 유닛으로 여과한 후 HPLC 를 이용하여 분석하였다.
방법 2
40ul/ml 카테킨 및 카페인 표준용액 900ul와 2% 아스코르브산-EDTA 100ul를 혼합하였다. 100% 메탄올 1ml를 넣어 혼합하고 0.2ul 필터 유닛으로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다.
분석 결과
40ug/ml 카테킨 및 카페인 표준용액을 방법 1과 방법 2로 분석하여 표준용액에 대한 성분별 회수율을 추정한 결과, 방법 1의 회수율은 69% 카페인, 68% EGCG, 52% EG, 67% GCG, 63% ECG 및 62% CG로 나타났으며, 방법 2의 회수율(42% 카페인, 45% EGCG, 43% EG, 44% GCG, 41% ECG 및 43% CG)보다 현저히 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 3 및 표 5 참조).
분석방법 성분별 회수율 (%), * P<0.05
카페인 EGCG EC GCG ECG CG
방법 1 69 ± 4* 68 ± 2* 52 ± 4 67 ± 2* 63 ± 3* 62 ± 2*
방법 2 42 ± 1 45 ± 1 43 ± 1 44 ± 1 41 ± 1 43 ± 1
<4-2> 생물 검체 내 카테킨 및 카페인 분석
카테킨 및 카페인의 함량이 높게 나타난 방법 1을 선택하여 40ul/ml 카테킨, 카페인 표준용액 또는 녹차추출물을 함유하는 생물 검체 내 녹차 성분의 회수율을 알아보았다. 0% 녹차사료를 섭취한 닭의 난황(100mg) 및 난백(50mg)에 40ul/ml 카테킨 및 카페인 표준용액 또는 20mg/ml의 녹차추출물을 각각 250ul씩 주입하여 상기 <4-1>의 방법 1과 동일한 방법으로 분석을 수행하였다.
그 결과, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 표준용액의 경우 난황 내 성분별 회수율은 46% 카페인, 18% EGCG, 21% EG, 24% GCG, 25% ECG 및 29% CG로 나타났으며, 난백 내 회수율은 82% 카페인, 47% EGCG, 68% EG, 47% GCG, 66% ECG 및 52% CG로 나타났다. 또한, 녹차추출물의 경우 난황 내 성분별 회수율은 62% 카페인, 25% EGCG, 33% EG, 30% GCG 및 24% ECG 였고, 난백 내 회수율은 66% 카페인, 39% EGCG, 48% EG, 38% GCG 및 42% ECG 로 나타났다.
분석대상 성분별 회수율 (%), * P<0.05
카페인 EGCG EC GCG ECG CG
표준용액 난백 82 ± 9* 47 ± 4* 68 ± 6* 47 ± 9 66 ± 6* 52 ± 9
난황 46 ± 1 18 ± 1 21 ± 1 24 ± 2 25 ± 2 29 ± 2
녹차추출물 난백 66 ± 1 39 ± 1* 48 ± 1* 38 ± 3 42 ± 1* -
난황 62 ± 2 25 ± 1 33 ± 2 30 ± 2 24 ± 1 -
< 실시예 5>
닭의 검체 내 녹차성분 분석
계란 내 녹차성분 분석
생물 검체 내 녹차 성분 분석법을 확립하기 위해, 상기 실시예 1에서 볼 수 있는 바와 같이 0%, 0.4% 또는 1%의 녹차사료를 섭취시켜 사육한 각 처리구의 닭으로부터 채취된 난황 100mg 및 난백 50mg을 대상으로 방법 1을 이용하여 검체 내 녹차 성분을 분석하였다.
그 결과, 난황(egg yolk) 및 난백(egg white)에는 카페인과 카테킨류인 EGCG 및 EC가 현저하게 검출되었다(도 4, 도 5 및 표 7 참조). 난황 및 난백에서 카페인은 사료 내 녹차의 함량과 비례하지만, 카테킨은 1% 녹차사료를 섭취한 산란계의 난황에서만 증가하였다(P < 0.05).
분석대상 성분별 회수율 (%), a,b,c 동일컬럼 내 P<0.05
녹차사료 함량(%) 카페인 EGCG EC 총량
난백 0 0.9 ± 0.4a 0.2 ± 0.1a 0.3 ± 0.2a 1.4 ± 0.3a
0.4 7.7 ± 0.6b 1.5 ± 0.7a 1.4 ± 0.4b 10.5 ± 1.1b
1 24.3 ± 3.5c 0.7 ± 0.3a 0.3 ± 0.2a 25.3 ± 3.4c
난황 0 0.4 ± 0.2a 1.3 ± 0.4a 1.2 ± 0.6a 2.9 ± 0.9a
0.4 3.2 ± 0.3b 1.2 ± 0.6a 1.0 ± 0.4a 5.4 ± 1.2a
1 5.5 ± 0.4c 4.1 ± 0.7b 3.5 ± 0.7b 13.0 ± 0.9b
전체계란 0 1.3 ± 0.4a 1.5 ± 0.4a 1.4 ± 0.5a 4.3 ± 0.7a
0.4 10.9 ± 0.7b 2.6 ± 0.8a 2.4 ± 0.7ab 15.9 ± 1.9b
1 29.7 ± 3.8c 4.8 ± 0.8b 3.8 ± 0.8b 38.3 ± 3.2c
*a,b,c:각 계란성분(난황,난백 및 전체계란)에서 카테킨 및 카페인 함량은 유의적으로 차이가 있음(P<0.05).
조직 생검 내 녹차성분 분석
또한, 상기 실시예 1에서 볼 수 있는 바와 같이 0%, 0.4% 또는 1%의 녹차사료를 섭취시켜 사육한 각 처리구의 닭으로부터 간 및 가슴 근육 조직을 채취하여 즉시 액체질소로 냉동시킨 후 추후 분석까지 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였으며 이후 찹핑(chopping) 등의 방법으로 원하는 크기로 잘게 잘라 준비하였다. 얻어진 검체 시료를 대상으로 방법 1을 이용하여 검체 내 녹차 성분을 분석하였다.
그 결과, 근육 및 간의 조직 생검으로부터 카테킨 류는 검출되지 않았으나 카페인이 현저하게 검출되는 것을 확인하였다(표 8 참조). 따라서, 상기 방법을 이용하여 녹차 성분을 함유하는 동물 및 식물의 검체로부터 카페인 및 카테킨을 동시에 효과적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
녹차사료 함량 조직 별 카페인 검출량(ug/g), a,b,c 동일컬럼 내 P<0.05
근육 간
0% 0.7 ± 0.4a 0.0 ± 0.0a
0.4% 1.9 ± 0.4ab 1.3 ± 0.2b
1% 3.0 ± 0.6b 2.8 ± 0.6c
상기와 같은 결과들을 종합해 볼 때, 사료에 포함된 녹차 성분이 이를 섭취한 동물의 근육, 간 등의 조직 뿐 아니라 계란 및 우유 등의 축산물 내에도 축적되는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 방법을 이용하여 생물 검체 내 함유된 여러 가지 녹차 성분들을 HPLC로 용이하게 동시에 검출할 수 있음을 알 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 대상 생물로부터 검체를 채취하여 준비하는 단계;
    준비된 생물 검체를 아스코르브산-EDTA와 혼합하는 단계;
    상기 혼합물을 메탄올/에틸 아세테이트 용액과 0.3M 디티온산나트륨(sodium dithionite)/0.1% Na2EDTA 용액으로 균질화하는 단계;
    상기 균질화된 용액을 농축시켜 HLB 컬럼에 적용하는 단계;
    HLB 컬럼에서 에틸 아세테이트를 이용하여 카페인을 추출하는 단계; 및
    HLB 컬럼에서 아스코르브산-EDTA 및 메탄올/에틸 아세테이트 용액을 이용하여 카테킨을 추출하는 단계를 포함하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 대상 생물은 닭, 오리, 돼지, 소, 젖소를 포함하는 축산용 가축인 것을 특징으로 하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생물 검체는 대상 생물로부터 채취된 간, 근육, 장액, 혈액을 포함하는 조직 생검(biopsy), 계란 및 우유를 포함하는 축산물, 및 이의 가공물을 포함하는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 카테킨은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG), 에피카테킨(epicatechin, EC), 갈로카테킨 갈레이트(gallocatechin gallate, GCG), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate, ECG) 및 카테킨 갈레이트(catechin gallate, CG)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 메탄올/에틸 아세테이트 용액은 메탄올과 에틸아세테이트가 2 : 1로 혼합된 것을 특징으로 하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 메탄올/에틸 아세테이트 용액과 상기 0.3M 디티온산나트륨(sodium dithionite)/0.1% Na2EDTA 용액은 부피비로 1 : 1이 되도록 사용하는 것을 특징으로 하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 균질화된 용액을 농축시키는 공정이 상기 균질화된 용액을 원심분리한 후 상층액을 질소가스를 이용하여 농축시켜 수행되는 것을 특징으로 하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 HLB 컬럼에 적용하는 공정은
    농축된 용액을 포스페이트 버퍼(pH 7)로 희석하는 단계;
    HLB 컬럼을 메탄올과 증류수로 세척한 후, 상기 희석된 용액을 컬럼에 적용하는 단계; 및
    포스페이트 버퍼(pH 3)와 포스페이트 버퍼(pH 7)를 차례로 적용하여 불순물을 제거한 후 메탄올로 컬럼을 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 추출된 카테킨과 카페인 용액을 질소가스로 완전히 농축시킨 후 메탄올로 용해하고, 이를 여과한 후 HPLC로 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법.
KR1020120050419A 2011-05-11 2012-05-11 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법 KR101387872B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120050419A KR101387872B1 (ko) 2011-05-11 2012-05-11 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20110044142 2011-05-11
KR1020110044142 2011-05-11
KR1020120050419A KR101387872B1 (ko) 2011-05-11 2012-05-11 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120127316A true KR20120127316A (ko) 2012-11-21
KR101387872B1 KR101387872B1 (ko) 2014-04-22

Family

ID=47512522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120050419A KR101387872B1 (ko) 2011-05-11 2012-05-11 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101387872B1 (ko)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103940920A (zh) * 2013-10-16 2014-07-23 贵州省茶叶研究所 茶叶中儿茶素类含量的检测方法
KR20150131190A (ko) * 2013-03-15 2015-11-24 올텍 법인회사 동물 사료를 분석하기 위한 시스템 및 방법
CN105738501A (zh) * 2016-01-29 2016-07-06 成都地奥制药集团有限公司 同时测定地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的hplc方法
CN106770794A (zh) * 2017-01-20 2017-05-31 刘玥 归芍茶的检测方法
CN108226366A (zh) * 2017-11-29 2018-06-29 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种茶饮料中天然咖啡因的鉴定方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2691136C2 (ru) * 2014-11-18 2019-06-11 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед Способ проведения высокопроизводительной тестовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU720701B2 (en) 1996-11-29 2000-06-08 Unilever Plc Black leaf tea
JP2005504958A (ja) * 2001-06-27 2005-02-17 ユニゲン・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 治療剤発見のために、天然産物ライブラリーを作製、スクリーニングおよびデレプリケーションする方法
KR20030060723A (ko) * 2002-01-09 2003-07-16 박근형 차엽으로부터 카페인, 에피갈로카테킨, 에피카테킨,에피갈로카테킨갈레이트, 에피카테킨갈레이트의 분리 및제조방법
KR100975148B1 (ko) * 2008-03-12 2010-08-11 경상대학교산학협력단 카테킨 함량을 선별하는 반응액, 이를 이용한 카테킨고함유 차나무 선별방법 및 고 카테킨 차 제품

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150131190A (ko) * 2013-03-15 2015-11-24 올텍 법인회사 동물 사료를 분석하기 위한 시스템 및 방법
CN103940920A (zh) * 2013-10-16 2014-07-23 贵州省茶叶研究所 茶叶中儿茶素类含量的检测方法
CN103940920B (zh) * 2013-10-16 2016-04-13 贵州省茶叶研究所 茶叶中儿茶素类含量的检测方法
CN105738501A (zh) * 2016-01-29 2016-07-06 成都地奥制药集团有限公司 同时测定地榆类制剂中没食子酸和(+)-儿茶素含量的hplc方法
CN106770794A (zh) * 2017-01-20 2017-05-31 刘玥 归芍茶的检测方法
CN108226366A (zh) * 2017-11-29 2018-06-29 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种茶饮料中天然咖啡因的鉴定方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101387872B1 (ko) 2014-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101387872B1 (ko) 생물 검체 내 카페인 및 카테킨을 동시분석하는 방법
Khalaji et al. Black cumin seeds, Artemisia leaves (Artemisia sieberi), and Camellia L. plant extract as phytogenic products in broiler diets and their effects on performance, blood constituents, immunity, and cecal microbial population
Grabber et al. Acetone enhances the direct analysis of procyanidin-and prodelphinidin-based condensed tannins in Lotus species by the butanol–HCl–iron assay
Di Trana et al. Effects of Sulla forage (Sulla coronarium L.) on the oxidative status and milk polyphenol content in goats
Valcheva-Kuzmanova et al. Hypoglycemic and hypolipidemic effects of Aronia melanocarpa fruit juice in streptozotocin-induced diabetic rats.
Alnidawi et al. Moringa oleifera leaves in broiler diets: Effect on chicken performance and health
Saratsis et al. In vivo and in vitro efficacy of sainfoin (Onobrychis viciifolia) against Eimeria spp in lambs
Andersen et al. Phyto-oestrogens in herbage and milk from cows grazing white clover, red clover, lucerne or chicory-rich pastures
WO2006080019A1 (en) Bee-food, honey made by bees fed with it, and uses of such honey
Pascariu et al. Effects of wine by-products on growth performance, complete blood count and total antioxidant status in broilers
James et al. Hypocholesterolemic effects of Nauclea latifolia (Smith) fruit studied in albino rats
Alagbe et al. Effects of dried Centella asiatica leaf meal as an herbal feed additive on the growth performance, haematology and serum biochemistry of broiler chicken
Agusetyaningsih et al. Effect of encapsulated leaf extract on the physiological conditions, immune competency, and antioxidative status of broilers at high stocking density
KR101189605B1 (ko) 인슐린 유사 성장인자 분비 및 뼈 골격 성장 촉진용 백하수오 추출물과 속단 추출물 및 그 제조방법
Badr et al. Productive performance and meat quality of commercial Cobb chicken fed diets containing different levels of prickly pear fruits (Opuntia ficus indica) peel
Uushona et al. Ruminant meat production and quality enhancement, nematode suppression and greenhouse gas emission mitigation: A sustainable paradigm for valorisation of Acacia leaves
JP2020534357A (ja) タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、ならびにその調製方法およびアルコール性脂肪肝を治療する用途
Islam et al. Phytochemical screening and anthelmintic activity of alcoholic extract of fruits of Eleocharis dulcis
KR20100111570A (ko) 약쑥 발효물을 포함하는 유해세균 억제용 사료 첨가제의 제조방법 및 상기 사료 첨가제 급여에 의한 계란의 생산방법
EP2560664A2 (en) Method for enhancing milk quantity and quality
Rahardjo et al. Effect of the extraction solvent polarity and the ratio of feed and solvent on the phytochemical content and antioxidant activity of red betel leaves (piper crocatum)
Oliveira et al. Impact of Seasonal and Organ-Related Fluctuations on the Anthelmintic Properties and Chemical Profile of Cladium mariscus (L.) Pohl Extracts
Verdecia et al. Effect of re-growth age in the content of secondary metabolites from Neonotonia wightii in the Valle del Cauto, Cuba
CUNHA et al. Microencapsulated herbal components in the diet of Lacaune ewes: impacts on physiology and milk production and quality
KR101747245B1 (ko) 귀뚜라미 분획물을 유효 성분으로 포함하는 트롬빈 활성 저해 항응고 조성물 및 식품조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180409

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee