CN109406645A - 一种小儿定喘口服液中麻黄、炒苦杏仁、甘草、黄芩的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药品检测技术领域，特别涉及一种同时鉴别小儿定喘口服液中麻黄、炒苦杏仁、黄芩和甘草的检测方法。对待检物进行高效液相色谱仪检测得到色谱图，对色谱图进行分析。通过对小儿定喘口服液中存在与麻黄、炒苦杏仁、黄芩和甘草及苯甲酸钠相应的色谱峰进行筛选，实现了上述四味药材及苯甲酸钠的准确定性鉴别；该方法环保、高效，重现性好，可用于小儿定喘口服液的定性质量控制。

Description

一种小儿定喘口服液中麻黄、炒苦杏仁、甘草、黄芩的检测 方法

技术领域

本发明涉及药品检测技术领域，特别涉及一种同时鉴别小儿定喘口服液中麻黄、炒苦杏仁、甘草、黄芩四味药材及苯甲酸钠的定性检测方法。

背景技术

中成药的定性鉴别目前多依赖于薄层色谱法，该方法因成本低、对实验室硬件要求不高，故应用非常广泛。但薄层色谱法分辨率不高，试验中需要使用大量高毒有机溶剂，对环境和检验人员身体健康带来很多危害，且该检验只能手动操作，每次只能对一味药进行定性检测，效率非常低下，所以有必要采用分辨率更高、低毒和效率更高的高效液相色谱法来代替薄层色谱法进行检验。

目前高效液相色谱仪已经成为药品检验实验室必备的仪器，高效液相色谱法具有很高的色谱分离能力，且试验中不使用高毒化学试剂，检验过程主要依靠仪器来完成，该方法在药品含量测定方面应用非常广泛，但定性研究方面应用较少。通过选择合适的色谱的条件，该方法可以同时对多味药进行定性检测，远优于一个薄层色谱检验项仅能对一味药进行定性检验，可以大大提高工作效率。因该方法可以同时对多味药进行定性检测，而不是分列成一个个薄层鉴别项单独定性检测某一味药，能从整体上对中药真伪进行控制，也更符合中医用药整体观的要求。

CN201610463280.9公开了一种感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法，步骤如下：(1)制备对照品溶液：分别配制甘草酸、甘草苷、绿原酸、木犀草苷对照品溶液；(2)制备供试品溶液：称取苦甘冲剂，进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(3)采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：梯度洗脱，所述梯度洗脱的流动相A为乙腈，B为0.05～5％甲酸水溶液，检测波长254nm；(4)评价相似度：供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。该方法具有良好的精密度、重复性、稳定性，采用HPLC指纹图谱技术可以有效地控制苦甘冲剂的质量。此方法在结果判定时采用相似度评价，这种判定结果不够准确，不能达到定性检测的要求。采用指纹图谱技术并通过计算相似度来评价和控制药品质量，无法解决部分样品中出现色谱峰缺失的问题，因为指纹图谱相似度计算时，峰面积大的峰所占相似度值的权重也大，很多峰面积相对较小的色谱峰对相似度值贡献较少，无论他们是否存在基本不影响相似度的计算值，也就是说药品质量发生了改变，但无法通过相似度值的大小来反映出来，也就是说相似度很高的样品并不代表两者质量一致性很高，而且出现缺失的色谱峰时也无法明确是哪几味药出问题了。

发明内容

为了解决以上现有技术中薄层色谱法定性检测中药中存在的分辨率低、环境污染问题严重和检验效率低的问题，以及指纹图谱法无法解决峰面积较小色谱峰缺失及产生的原因等问题，本申请提供了一种检测友好、效率高的同时鉴别小儿定喘口服液中麻黄、炒苦杏仁、甘草、黄芩四味药材及苯甲酸钠的检测方法。本研究在同一色谱条件下可以同时鉴别处方中上述四味药材及苯甲酸钠，大大优于传统的薄层鉴别法和指纹图谱法。

小儿定喘口服液是由麻黄、炒苦杏仁、莱菔子、葶苈子、紫苏子、黄芩、桑白皮、石膏、大青叶、鱼腥草和甘草十一味药组成，现行质量标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-628(Z-109)-2001-2009Z-2017，该标准通过薄层色谱法对麻黄、黄芩、大青叶、甘草四味药进行定性检测。查阅相关文献未见有采用高效液相色谱法对本品进行定性检测方面的报道。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种小儿定喘口服液中麻黄、炒苦杏仁、甘草、黄芩的检测方法，包括以下步骤：

（1）待检物使用醇类提取后得到的提取物进行高效液相色谱仪检测得到色谱图，

（2）通过苯甲酸钠对照品确定色谱图中的苯甲酸钠色谱峰，以苯甲酸钠色谱峰为参照峰，若相对保留时间0.26±5%和0.27±5%同时有色谱峰出现，则待检物原料药中含有麻黄，若相对保留时间0.26±5%和0.27±5%无色谱峰出现，则待检物原料药中不含有麻黄；若相对保留时间0.50±5%和0.51±5%同时有色谱峰出现，则待检物原料药中含有炒苦杏仁，若相对保留时间0.50±5%和0.51±5%无色谱峰出现，则待检物原料药中不含有炒苦杏仁；若相对保留时间1.05±5%、1.15±5%、1.58±5%、1.71±5%、1.79±5%、1.85±5%和2.12±5%同时有色谱峰出现，则待检物原料药中含有黄芩，若相对保留时间1.05±5%、1.15±5%、1.58±5%、1.71±5%、1.79±5%、1.85±5%和2.12±5%无色谱峰出现，则待检物原料药中不含有黄芩；若相对保留时间0.42±5%、1.02±5%和2.07±5%同时有色谱峰出现，则待检物原料药中含有甘草，若相对保留时间0.42±5%、1.02±5%和2.07±5%无色谱峰出现，则待检物原料药中不含有甘草。

一种中药含有多种化学成分，并且部分化学成分结构非常类似，导致具有相似的色谱保留行为，很难分离，使得他们的色谱峰的保留时间很接近，这很正常，但如果缩小±5%的值，可能会导致无法准确识别相关色谱峰，导致结果偏离情况的出现，故要解决这个问题，方法中必须规定麻黄、炒苦杏仁、黄芩和甘草分别具有的2、2、7和3个色谱峰且均不能缺失，方表示检测出麻黄、炒苦杏仁、黄芩和甘草，判为合格。任何一味药中所具有的色谱峰出现缺少的情况，均判为不合格。

所述的检测方法，优选色谱条件：色谱柱Agilent extend C18 5µm, 4.6×250mm；以乙腈为流动相A，以0.5%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，0～5 min，5% 流动相A，5～20min, 5→9% 流动相A，20～64 min，9→21%流动相A，64～80 min，21→30% 流动相A，80～95min，30→80% 流动相A，95～105 min，80→100% 流动相A，105～115 min，100→5% 流动相A；柱温25℃，流速为1.0ml/min；波长210±2nm。

所述的检测方法，优选理论塔板数按苯甲酸钠峰计算不少于50000。

所述的检测方法，优选步骤（1）中使用甲醇提取。

所述的检测方法，优选步骤（1）中提取时使用超声处理，超声功率250W，频率40kHz。

一般的薄层色谱法鉴别麻黄、炒苦杏仁、黄芩和甘草四味药材，需要四个不同的薄层鉴别试验，费时费力，且需要盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、黄芩苷、甘草酸铵等多种昂贵的对照品和相应对照药材，方能对薄层色谱中主斑点进行定性确认，结果判定也只关注主斑点是否存在。而采用该文研究方法，不需要各种价格不菲的对照品，仅需要价格低廉的苯甲酸钠对照品作为对照物质，通过引入相对保留时间这一因素，对16个主要特征色谱峰进行比对，就可以对上述四味药进行非常准确的定性鉴别，该方法远远优于薄层色谱法仅能分别对主斑点是否存在进行评判的方法。

对中药质量进行评价的核心原则是真伪优劣，而且必须是真伪在前，优劣在后。目前很多文献方法采用HPLC法测定中成药中一个或多个成分含量来进行质量控制，这实质上是对中成药的优劣进行评价，测定的几个指标成分在很多中成药中是普遍存在的，不具有专属性，而中药起作用是很多种成分协同起作用的结果，所以简单测定一个或几个指标成分含量无法有效地对中药质量进行有效控制，且属于本末倒置。若要准确对中药进行质量控制，必须先解决真伪问题，需要对真伪方面进行有效的质量控制，通过本文方法可以采用多个色谱峰的有无来协同判定中药的真伪，牢牢抓住了中药质量控制的核心真伪问题，任何色谱峰的缺失均表示样品出现质量问题，可以判定为不合格，而且能够分析出哪一味药材引起的问题。本方法通过选择保留时间恰好在中间值附近的苯甲酸为参照峰，可以减少对其它色谱峰计算相对保留时间的影响，可以提高试验结果的重现性水平，且苯甲酸性质稳定、廉价易得，大大降低了检测成本，经多次试验验证，该方法可以同时对方中麻黄、炒苦杏仁、甘草、黄芩进行有效控制，而且每一味药均通过多个色谱峰即对应的多个化学成分来进行综合评价，且任何色谱峰的缺失均判样品不合格，规定非常严格，大大提高了小儿定喘口服液真伪方面的质量控制水平，对药品质量的可控性提出了更高的要求。

试验过程中使用了中国食品药品检定研究院提供的麻黄、苦杏仁、黄芩和甘草对照药材及盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、绿原酸、苯甲酸钠、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵对照品，处理后进行高效液相色谱法检测。试验过程中收集了某制药有限公司生产的7个批次的小儿定喘口服液样品，在波长210nm±2nm下，均可保证供试品溶液呈现16个主要特征色谱峰，通过与对照药材和对照品色谱峰进行比对，对主要色谱峰进行了药味归属，并对部分色谱峰进行了确认，供试品溶液呈现的14个主要特征色谱峰分别来自麻黄、炒苦杏仁、黄芩和甘草四味药材，另2个特征色谱峰分别为苯甲酸钠及绿原酸。

为保证试验结果的准确性，在规定色谱条件下，供试品溶液中各色谱峰的相对保留时间应控制在±5%以内，超出该范围，则判为不合格。供试品溶液中任何色谱峰的缺失，则结果判为不合格。

本发明的有益效果：

1、通过对小儿定喘口服液中16个色谱峰进归属，确定了其中14个色谱峰分别来自麻黄、炒苦杏仁、黄芩和甘草，实现了上述四味药材的准确定性鉴别；

2、通过对小儿定喘口服液中另2个色谱峰进归属，确定峰4为专属性不强的绿原酸对照品色谱峰，峰7为口服液制剂中添加的防腐剂苯甲酸钠的色谱峰；

3、本发明方法可以很好解决色谱峰缺失问题，任何规定色谱峰的缺失都可以明确出哪一味药材出问题，是一种简单、明了和高效的检测方法，并且环保，重现性好，可用于小儿定喘口服液的定性质量控制。

附图说明

图1 麻黄对照药材溶液的HPLC色谱图；

图2苦杏仁对照药材溶液的HPLC色谱图；

图3黄芩对照药材溶液的HPLC色谱图；

图4甘草对照药材溶液的HPLC色谱图；

图5混合对照品溶液HPLC色谱图；峰1为盐酸麻黄碱、峰2为盐酸伪麻黄碱、峰4为绿原酸、峰6为苦杏仁苷、峰7为苯甲酸钠、峰11为黄芩苷、峰14为黄芩素、峰15为甘草酸铵；

图6供试品溶液的HPLC色谱图，样1，批号141105；

图7供试品溶液的HPLC色谱图，样2，批号161110；

图8供试品溶液的HPLC色谱图，样3，批号161251；

图9麻黄阴性对照溶液的HPLC色谱图；

图10 炒苦杏仁阴性对照溶液的HPLC色谱图；

图11 黄芩阴性对照溶液的HPLC色谱图；

图12 甘草阴性对照溶液的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1.仪器与试药

仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2448 DAD检测器；Mettler ToledoXSE205电子天平；BK-600C超声波清洗仪（巴克超声设备有限公司）

试药：盐酸麻黄碱对照品（批号：171241-201508）、盐酸伪麻黄碱对照品（批号：171237-201208）、绿原酸对照品（批号：110753-201415）、苦杏仁苷对照品（批号：110820-201607）、苯甲酸钠对照品（批号：100433-201702）、黄芩苷对照品（批号：110715-201609）、甘草酸铵对照品（批号：110731-201619）、黄芩素对照品（批号：111595-201306）、麻黄对照药材（批号：121051-200704）、苦杏仁（东北杏）对照药材（批号：121554-200702）、黄芩对照药材（批号：120955-201309）、甘草（甘草）对照药材（批号：120904-201308）均由中国食品药品检定研究院提供；小儿定喘口服液均为市售样品；乙腈为色谱纯。

2.方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1供试品溶液的制备

取本品，精密量取10ml，置锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2对照药材溶液的制备

取麻黄、苦杏仁、黄芩和甘草对照药材各约0.20g，分别精密称定，精密加入50%甲醇20ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材溶液。

2.1.3 参照品溶液的制备

精密称取苯甲酸钠对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含1.0mg的对照溶液，即得。

2.1.4混合对照品溶液的制备

精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、绿原酸、苯甲酸钠、黄芩苷、黄芩素和甘草酸铵对照品适量，加50%甲醇制成每1ml各含约0.1～1.0mg的对照品溶液，即得。

2.1.5 阴性对照溶液的制备

取实验室自制的麻黄阴性样品、甘草阴性样品、炒苦杏仁阴性样品和黄芩阴性样品，各精密量取10ml，置锥形瓶中，分别精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为阴性对照溶液。

2.2色谱条件与系统适用性试验

参考相关文献，采用如下色谱条件：色谱柱Agilent extend C18（5µm, 4.6×250mm）；以乙腈为流动相A，以0.5%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，0～5 min，5% A，5～20 min, 5→9% A，20～64 min，9→21%A，64～80 min，21→30% A，80～95 min，30→80% A，95～105min，80→100% A，105～115 min，100→5% A；DAD检测器（190～400nm）；柱温25℃；流速为1.0ml/min；波长210nm；理论塔板数按苯甲酸钠峰计算不得少于50 000。

2.3检测波长的选择及色谱峰的归属

分别精密吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各10µl，注入液相色谱仪，进行定性分析。因麻黄、炒苦杏仁、黄芩和甘草所含化学成分复杂，各成分的最大吸收波长差异显著，若从检测灵敏度方面考虑，可以采用多波长检测，但该方法呈现的色谱图不具有整体观，而采用紫外末端吸收波长210nm进行检测，可以在同一张色谱图上同时呈现上述四味药材的特征色谱峰，便于不同样品色谱图间的比较，经试验发现在210nm波长下，供试品溶液色谱图中可以分别呈现出麻黄、苦杏仁、黄芩和甘草的2、2、7和3个特征色谱峰，麻黄对照药材溶液色谱中的2个主要特征峰为峰1、峰2，苦杏仁对照药材溶液色谱中的2个主要特征峰为峰5、峰6，甘草对照药材溶液色谱中的3个主要特征峰为峰3、峰8和峰15，黄芩对照药材溶液色谱中的7个主要特征峰为峰9、峰10、峰11、峰12、峰13、峰14和峰16，图谱分别见图1～6，且相应的阴性对照溶液色谱均没有干扰，说明在该波长条件下可以同时检测上述四味药材，故选择210nm作为检测波长，考虑到不同色谱仪的波长准确度一般控制在±2nm范围内，故检测波长确定为210±2nm，波长的微小变化不影响色谱峰相对保留时间的计算，仅会对色谱峰的峰面积产生一些影响。

2.4 色谱峰的确认

精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液各10µl，注入液相色谱仪，进行分析，图谱见图5。峰1为盐酸麻黄碱、峰2为盐酸伪麻黄碱、峰4为绿原酸、峰6为苦杏仁苷、峰7为苯甲酸钠、峰11为黄芩苷、峰14为黄芩素、峰15为甘草酸铵。

2.5 参照色谱峰的选择

在波长210nm下，供试品溶液呈现16个主要的特征色谱峰，7号色谱峰为苯甲酸钠，其色谱峰的保留时间恰好居中，且苯甲酸钠廉价易得，故可以利用该主色谱峰作为参照峰，来计算其他色谱峰的相对保留时间，这样计算所得相对保留时间偏差较小。

2.6 色谱柱等其他色谱条件的确定

因通过相对保留时间的方式来对色谱峰进行定位，对整个色谱条件要求较高。试验中发现更换不同厂家色谱柱的固定相（均为十八烷基键合硅胶）对相对保留时间影响显著，部分厂家的色谱柱获得的相对保留时间的偏差非常大，远超出5%的可接受的范围，部分色谱峰的相对保留时间的偏差达到15%以上，故采用相对保留时间法进行色谱峰定位，应固定色谱柱的类型和牌号，并应固定柱温及流速等可能对色谱峰保留时间产生影响的色谱条件，以确保相对保留时间在可接受范围内的变动。

采用色谱柱Agilent extend C18（5µm, 4.6×250mm）；柱温25℃；流速为1.0ml/min；波长210nm；并在规定流动相条件下，以苯甲酸钠为参照峰计算其余色谱峰的相对保留时间分别为0.26、0.27、0.42、0.44、0.50、0.51、1.02、1.05、1.15、1.58、1.71、1.79、1.85、2.07和2.12。各色谱峰的相对保留时间应控制在±5%以内。

实施例2相对保留时间的精密度试验考察

精密吸取供试品溶液（样3，批号161251）10µl，连续进样6次，以苯甲酸钠峰为参照峰，计算16个主要的特征色谱峰的相对保留时间。

表1 16个主要的特征色谱峰的相对保留时间的精密度试验考察结果

上述结果可知，16个色谱峰的相对保留时间的RSD均小于2%，提示本方法的精密度试验良好。

实施例3相对保留时间的稳定性试验考察

精密吸取供试品溶液（样3，批号161251）10µl，分别在0、2、4、8、16和24h进样，以苯甲酸钠峰为参照峰，计算16个主要的特征色谱峰的相对保留时间。

表2 16个主要的特征色谱峰的相对保留时间的稳定性试验考察结果

上述结果可知，16个色谱峰的相对保留时间的RSD均小于2%，提示本品在24h稳定性良好。

实施例4样品的测定

小儿定喘口服液为某制药有限公司独家品种，本实验取7批样品（批号分别为141105、161110、161251、161252、170211、171007和171009）及自制的4种阴性对照样品进行考察，结果如下：

表3 16个主要的特征色谱峰的相对保留时间的不同批次样品的考察结果

（“/”表示未检出该色谱峰）

上表结果可知，7批样品中均能检出16个特征色谱峰，均为合格，而4种阴性样品均未能检出相应的药味色谱峰，提示该方法具有很好的鉴别效果，可用于本品的定性检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种小儿定喘口服液中麻黄、炒苦杏仁、甘草、黄芩的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）待检物使用醇类提取后得到的提取物进行高效液相色谱仪检测得到色谱图，

（2）通过苯甲酸钠对照品确定色谱图中的苯甲酸钠色谱峰，以苯甲酸钠色谱峰为参照峰，若相对保留时间0.26±5%和0.27±5%同时有色谱峰出现，则待检物原料药中含有麻黄，若相对保留时间0.26±5%和0.27±5%无色谱峰出现，则待检物原料药中不含有麻黄；若相对保留时间0.50±5%和0.51±5%同时有色谱峰出现，则待检物原料药中含有炒苦杏仁，若相对保留时间0.50±5%和0.51±5%无色谱峰出现，则待检物原料药中不含有炒苦杏仁；若相对保留时间1.05±5%、1.15±5%、1.58±5%、1.71±5%、1.79±5%、1.85±5%和2.12±5%同时有色谱峰出现，则待检物原料药中含有黄芩，若相对保留时间1.05±5%、1.15±5%、1.58±5%、1.71±5%、1.79±5%、1.85±5%和2.12±5%无色谱峰出现，则待检物原料药中不含有黄芩；若相对保留时间0.42±5%、1.02±5%和2.07±5%同时有色谱峰出现，则待检物原料药中含有甘草，若相对保留时间0.42±5%、1.02±5%和2.07±5%无色谱峰出现，则待检物原料药中不含有甘草。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于色谱条件：色谱柱Agilent extend C185µm, 4.6×250mm；以乙腈为流动相A，以0.5%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，0～5 min，5%流动相A，5～20 min, 5→9% 流动相A，20～64 min，9→21%流动相A，64～80 min，21→30%流动相A，80～95 min，30→80% 流动相A，95～105 min，80→100% 流动相A，105～115 min，100→5% 流动相A；柱温25℃，流速为1.0ml/min；波长210±2nm。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于理论塔板数按苯甲酸钠峰计算不少于50000。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤（1）中使用甲醇提取。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤（1）中提取时使用超声处理，超声功率250W，频率40kHz。