CN114252518B - 一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，属于中药制剂分析技术领域。所述的指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：桑白皮汤物质基准的制备；供试品溶液的制备；对照品溶液的制备；利用高效液相色谱仪测定；桑白皮汤指纹图谱的构建。色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；检测波长为250nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃；进样量为10μl；甲醇和磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。该方法具有重复性好、稳定性和精密度高，操作简便等优点。采用本方法建立的桑白皮汤物质基准指纹图谱有23个共有峰，指认了4个共有特征峰，选择7号峰作为指纹图谱中的参照峰，对桑白皮汤物质基准进行了研究，为其后续研究开发奠定了基础。
Description
技术领域：
本发明涉及中药制剂分析技术领域，具体涉及经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。
背景技术：
桑白皮汤源自《景岳全书》，全方由9味药材组成，具有清火涤痰、止咳平喘之功效，是治疗痰热郁肺证的经典名方，原文为“外无风寒而雍火盛作喘或虽有微寒而重在火者，宜桑白皮汤主之”。痰热郁肺证表现为：发热，咳痰黄稠，喘促，烦燥，舌质红，苔黄腻，脉滑数，具有上述症状者，均可加减应用桑白皮汤。临床上常用其治疗慢性阻塞性肺病、支气管扩张、急慢性支气管炎、支气管哮喘。
中药方剂发挥药效为多成分多靶点同时作用，本方药材含有多种生物活性成分。桑白皮中含有多种黄酮类衍生物，有止咳、抑菌等功效；苦杏仁中含有苦杏仁苷，有镇咳平喘、抗炎镇痛、降血脂等作用；黄芩中含有黄芩苷，有抗炎、抗病毒和提高机体免疫功能等作用；黄连中含有盐酸小檗碱，有抗炎、解热、抗细菌毒素等作用。
以“整体性”和“模糊性”为特点的中药指纹图谱用于评价中药材、半成品、中药制剂的质量，可全面反映中药产品的内在质量。桑白皮汤化学成分复杂，通过中药指纹图谱能将其复杂的化学成分信息较全面的表征出来，用于桑白皮汤物质基准研究，为后续研究开发奠定基础。
发明内容：
本发明的主要目的是，提供一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。通过此方法保证桑白皮汤质量的稳定性、一致性和可控性。
为实现上述目的，本发明通过以下步骤实现：
一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1.桑白皮汤物质基准的制备：取桑白皮、姜半夏、紫苏子、苦杏仁、川贝母、栀子、黄芩、黄连、生姜片，加水，武火煮沸，转文火煎煮，滤过，冷冻干燥，得到桑白皮汤物质基准冻干粉。
2.供试品溶液的制备：取桑白皮汤物质基准冻干粉，精密称定，精密加入一定量溶剂，超声提取，放冷，滤过，取续滤液，过微孔滤膜，备用。
3.对照品溶液的制备：取苦杏仁苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、栀子苷对照品，精密称定，加适量溶剂溶解，过微孔滤膜，即得对照品溶液。
4.测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行测定，记录色谱图；
5.桑白皮汤物质基准指纹图谱的构建：将不同批次的桑白皮汤物质基准供试品色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择各批次桑白皮汤物质基准中共有色谱峰，生成桑白皮汤物质基准对照指纹图谱，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。
作为优选方案，以上所述的一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤1中，所述桑白皮汤物质基准的制备方法如下：取桑白皮12g、姜半夏12g、紫苏子12g、苦杏仁12g、川贝母12g、栀子12g、黄芩12g、黄连12g、生姜片75g，加水2000ml，武火煮沸，转文火煎煮至800ml，滤过，冷冻干燥，得到桑白皮汤物质基准冻干粉。
作为优选方案，以上所述的一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2中，所述供试品溶液的制备方法如下：取桑白皮汤物质基准约2g，精密称定，精密加入70％甲醇20ml，超声提取10min，放冷，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，备用。
作为优选方案，以上所述的一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤3中，所述对照品溶液的制备方法如下：取苦杏仁苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、栀子苷对照品，精密称定，分别加甲醇制成浓度为100μg/ml、60μg/ml、100μg/ml、50μg/ml的对照品溶液，过0.45μm微孔滤膜。
作为优选方案，以上所述的一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤4中，所述测定分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定。
作为优选方案，以上所述的一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤5中，桑白皮汤物质基准指纹图谱测定的色谱条件为：色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱柱(5μm，4.6×250mm)；流动相为甲醇(A)-0.1％磷酸溶液，梯度洗脱(A)：0-10min，8％-10％；10-15min，10％-17％；15-20min，17％；20-30min，17％-25％；30-32min，25％-28％；32-37min，28％；37-50min，28％-41％；50-60min，41％-50％；65-70min，50％-57％；70-75min，57％-62％；75-80min，62％-75％；80-82min，75％-8％；82-85min，8％。流速1ml/min；柱温25℃；进样量10μl；检测波长250nm。
作为优选方案，以上所述的一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤5中，所述建立方法得到的指纹图谱中含有23个共有峰，其中4号峰为苦杏仁苷，7号峰为栀子苷，14号峰为盐酸小檗碱，16号峰为黄芩苷。各共有峰以7号峰为参照峰的相对峰面积和相对保留时间如下：
表1 15批样品共有峰相对峰面积(以栀子苷作为参照)
表2 15批样品共有峰相对保留时间(以栀子苷作为参照)
使用前述方法测定15批桑白皮汤物质基准样品，得到15个批次的桑白皮汤物质基准指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版评价各批次桑白皮汤物质基准HPLC图谱的相似度，15批桑白皮汤物质基准的相似度均大于0.99，表明桑白皮汤物质基准产品质量稳定。
相比现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明建立的桑白皮汤物质基准指纹图谱建立的方法简便可靠、稳定性和精密度高、重复性好。
(2)将本发明中建立的指纹图谱方法用于桑白皮汤物质基准的质量监控，能从整体上、全面有效地对桑白皮汤的质量进行控制，从而保证产品的稳定性、可靠性与安全性。
附图说明
图1为15批桑白皮汤物质基准HPLC指纹图谱和对照指纹图谱(R)。
图2检测波长对比。
图3对照品溶液及桑白皮汤物质基准HPLC指纹图谱。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细阐述，但本发明的保护范围并不局限于以下各实施例。
以下各实施例中所使用的仪器与试剂如下：
1.仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪；色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)。EL204型电子天平(梅特勒-托列多仪器上海有限公司)；SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；KQ-500VDB型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；LAM-0.5F型真空冷冻干燥机(山东新华医疗器械股份有限公司)；JY-CW型智能煎药包装机(济南玖延机械有限公司)。
2.药品与试剂
以下各实施例中所使用的药品和试剂：桑白皮汤中各药味经烟台市食品药品检验检测中心姜慧祯主任鉴定均为正品，按照《中国药典》2015年版一部方法检测，饮片均符合药典标准。苦杏仁苷(批号110820-201808)、黄芩苷(批号110715-201821)、盐酸小檗碱(批号110713-201814)、栀子苷(批号110749-201718)均购自于中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯；甲醇、磷酸为分析纯。
实施例1采用高效液相色谱法建立桑白皮汤物质基准的指纹图谱
1.桑白皮汤物质基准的制备方法如下：取桑白皮12g、姜半夏12g、紫苏子12g、苦杏仁12g、川贝母12g、栀子12g、黄芩12g、黄连12g、生姜片75g，加水2000ml，武火煮沸，转文火煎煮至800ml，滤过，冷冻干燥，得到桑白皮汤物质基准冻干粉。
2.供试品溶液的制备：取桑白皮汤物质基准约2g，精密称定，精密加入70％甲醇20ml，超声提取10min，放冷，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，备用。
3.对照品溶液的制备：取苦杏仁苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、栀子苷对照品，精密称定，分别加甲醇制成浓度为100μg/ml、60μg/ml、100μg/ml、50μg/ml的对照品溶液，过0.45μm微孔滤膜。
4.测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，进行测定，记录色谱图；
5.桑白皮汤物质基准指纹图谱的构建：将15个批次的桑白皮汤物质基准供试品色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择各批次桑白皮汤物质基准中共有色谱峰，生成桑白皮汤物质基准对照指纹图谱，以7号峰为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果如下：
表1 15批样品共有峰相对峰面积(以栀子苷作为参照)
表2 15批样品共有峰相对保留时间(以栀子苷作为参照)
6.使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2012A)”对15批桑白皮汤物质基准指纹图谱进行相似度评价，相似度均大于0.99，结果见表1。
表3 15批桑白皮汤物质基准相似度评价结果
实施例2桑白皮汤物质基准指纹图谱的方法学考察
1.梯度洗脱方式的选择
桑白皮汤物质基准颗粒是由十七味中药组成的复方制剂，所含化学成分较为复杂，因此采用梯度洗脱的方式。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇(A)-0.1％磷酸溶液，梯度洗脱(A)：0-10min，8％-10％；10-15min，10％-17％；15-20min，17％；20-30min，17％-25％；30-32min，25％-28％；32-37min，28％；37-50min，28％-41％；50-60min，41％-50％；65-70min，50％-57％；70-75min，57％-62％；75-80min，62％-75％；80-82min，75％-8％；82-85min，8％。流速1ml/min；柱温25℃；进样量10μl；检测波长250nm。
2.检测波长的选择
分别考察检测波长为207nm、230nm、250nm、280nm、300nm、330nm、360nm、400nm时供试品溶液色谱图中色谱峰的数量及分离度，结果见图2。
3.精密度试验
取供试品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，分别测定保留时间和峰面积，以栀子苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，结果见表2、表3。
表2精密度试验中各共有峰的相对保留时间
表3精密度试验中各共有峰的相对峰面积
1.稳定性试验
取同一桑白皮汤物质基准供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12h测定，以栀子苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，结果见表4、表5。
表4稳定性试验中各共有峰的相对保留时间
表5稳定性试验中各共有峰的相对峰面积
2.重复性试验
取同一批次的桑白皮汤物质基准样品，按上述供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液。按上述色谱条件测定。以栀子苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，结果见表6、表7。
表6重复性试验中各共有峰的相对保留时间
表7重复性试验中各共有峰的相对保峰面积
上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
Claims (5)
1.一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)桑白皮汤物质基准的制备：取桑白皮、姜半夏、紫苏子、苦杏仁、川贝母、栀子、黄芩、黄连、生姜片，加水，武火煮沸，转文火煎煮，滤过，冷冻干燥，得到桑白皮汤物质基准冻干粉；
(2)供试品溶液的制备：取桑白皮汤物质基准冻干粉，精密称定，精密加入一定量溶剂，超声提取，放冷，滤过，取续滤液，过微孔滤膜，备用；
(3)对照品溶液的制备：取苦杏仁苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、栀子苷对照品，精密称定，加适量溶剂溶解，过微孔滤膜，即得对照品溶液；
(4)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行测定，记录色谱图；
(5)桑白皮汤物质基准指纹图谱的构建：将不同批次的供试品色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择各批次供试品中共有的色谱峰，生成桑白皮汤物质基准对照指纹图谱，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间；
(6)桑白皮汤物质基准指纹图谱测定的色谱条件为：色谱柱为安捷伦ZORBAX EclipsePlus C18，5μm，4.6×250mm；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，0-10min，8％→10％A；10-15min，10％→17％A；15-20min，17％A；20-30min，17％→25％A；30-32min，25％→28％A；32-37min，28％A；37-50min，28％→41％A；50-60min，41％→50％A；65-70min，50％→57％A；70-75min，57％→62％A；75-80min，62％→75％A；80-82min，75％→8％A；82-85min，8％A；流速1ml/min；柱温25℃；进样量10μl；检测波长250nm。
2.根据权利要求1所述的一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，所述桑白皮汤物质基准的制备方法如下：取桑白皮12g、姜半夏12g、紫苏子12g、苦杏仁12g、川贝母12g、栀子12g、黄芩12g、黄连12g、生姜片75g，加水2000ml，武火煮沸，转文火煎煮至800ml，滤过，冷冻干燥，得到桑白皮汤物质基准冻干粉。
3.根据权利要求1所述的一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(2)中，所述供试品溶液的制备方法如下：取桑白皮汤物质基准约2g，精密称定，精密加入70％甲醇20ml，超声提取10min，放冷，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，备用。
4.根据权利要求1所述的一种桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，所述对照品溶液的制备方法如下：取苦杏仁苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、栀子苷对照品，精密称定，分别加甲醇制成浓度为100μg/ml、60μg/ml、100μg/ml、50μg/ml的对照品溶液，过0.45μm微孔滤膜。
5.根据权利要求1所述的一种经典名方桑白皮汤物质基准指纹图谱的建立方法，其特征在于，
步骤(5)中，建立方法得到的指纹图谱中含有23个共有峰，其中4号峰为苦杏仁苷，7号峰为栀子苷，14号峰为盐酸小檗碱，16号峰为黄芩苷，各共有峰以7号峰为参照峰的相对峰面积和相对保留时间如下：
表1 15批样品共有峰相对峰面积，以栀子苷作为参照
表2 15批样品共有峰相对保留时间，以栀子苷作为参照
。
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