CN113281428B - 一种玉女煎基准物质的制备方法与指纹图谱的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种玉女煎基准物质的制备方法。本发明进一步提供一种玉女煎基准物质及包含玉女煎基准物质的玉女煎的制剂。本发明还提供一种玉女煎基准物质的指纹图谱的检测方法。本发明另外提供一种玉女煎基准物质的标准指纹图谱的构建方法和玉女煎基准物质的指纹图谱的质量控制方法。本发明提供的一种玉女煎基准物质的制备方法与指纹图谱的检测方法，能够获得具有优异质量的玉女煎，其质量稳定、不合格率低，还建立了玉女煎的高效液相指纹图谱，有利于整体控制玉女煎的内在质量，为更好地建立玉女煎整体质量控制评价体系提供科学试验依据。

Description

一种玉女煎基准物质的制备方法与指纹图谱的检测方法
技术领域
本发明属于中药制备及其成分的质量控制与检测的技术领域，涉及一种玉女煎基准物质的制备方法与指纹图谱的检测方法，具体涉及一种玉女煎基准物质的制备方法、玉女煎的指纹图谱的检测方法、玉女煎的标准指纹图谱的构建方法、玉女煎基准物质的指纹图谱的质量控制方法。
背景技术
玉女煎出自《景岳全书·新方八阵》卷五十一方，由明代著名医家张景岳所创，由生石膏、熟地、麦冬、知母、牛膝组成。方中石膏清胃火之有余，为君药；熟地滋水之不足为臣药，二药合用，是清火而又壮水之法；知母苦寒质润，助石膏以泻火清胃，无苦燥伤阴之虑，麦门冬养胃阴，协熟地以滋肾阴，兼顾其本，均为佐药；牛膝导热引血下行，以降上炎之火，而止上溢之血，为使药。诸药合用，共奏清热解毒，滋阴降火之功。此方具有清胃泻火，滋阴增液之功。主治少阴不足，阳明有余，即所谓胃热阴虚证，如头痛，牙痛，齿松牙衄，烦热干渴，舌红苔黄而干，亦治消渴，消谷善饥等。现代临床常用于治疗牙龈炎、糖尿病、急性口腔炎等胃热阴虚者，且有良好的临床效果。玉女煎作为经典名方，已被2018年国家中医药管理局所公布的《古代经典名方目录(第一批)》所收录。该方无配伍禁忌，适用范围广，对胃热阴虚证疗效显著，临床主要用于治疗口腔溃疡、糖尿病、急性口腔炎等疾病，且在国内尚无上市品种，具有较好的开发前景。
玉女煎原方由“生石膏三五钱，熟地三五钱或一两，麦冬二钱，知母、牛膝各钱半”组成。原书所载其煎服法为“水一盅半，煎七分，温服或冷服”。《景岳全书》成于景岳晚年，在其殁后刊行。现存最早为明崇祯十三年(1640)年刻本、乾隆三十三年(1768)越郡藜照楼重镌本、《四库全书》本及清康熙年间多种刻本。1949年后有影印本和排印本出版。由于《景岳全书》成书较晚，故对玉女煎有所记载的古籍以清代古籍为主。世代医家在在临床使用玉女煎时，在其原有基础上有所发展，景岳论及本方的加减法指出火之盛极者，加栀子、地骨皮之属亦可，如汗多、渴者，加北五味十四粒；如小水不利，或火不能降者，加泽泻一钱五分；如金水俱亏，因精损气者，加人参二三钱尤妙。国家中医药管理局公布的《古代经典名方目录(第一批)》中收录的玉女煎汤与《景岳全书》记载的处方一致，组成为:生石膏三、五钱，熟地三、五钱或一两，麦冬二钱，知母、牛膝各一钱半，确定了玉女煎经典名方研究的处方。
在中药经典名方研究中，“经典名方基准物质”的制备是重点研究工作，是指以古代医籍中记载的古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准，除成型工艺外，其余制备方法应当与古代医籍记载基本一致。在经典名方玉女煎的研究中，玉女煎的基准物质除了采用标准煎液进行呈现外，有必要将其制备成浸膏粉(中间提取物)，便于储存和后期制剂成型工艺。
同时，由于中药指纹图谱技术是经典名方基准物质质量控制的重要手段。目前已公开的“一种玉女煎标准汤的HPLC指纹图谱测定方法”专利中虽然已建立了玉女煎指纹图谱，但是其采用的玉女煎处方为“生石膏15g，熟地15g，麦冬6g，知母4.5g，牛膝4.5g”，与国家中医药管理局公布的《古代经典名方目录(第一批)》中收录的玉女煎汤以及《景岳全书》记载的玉女煎的处方明显不一致，同时其公布的玉女煎指纹图谱中虽然指定了25个特征共有峰，只通过对照品比对指认了其中3个共有峰:芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷，并只通过质谱数据库推测了其中12个特征峰。
另外，在雷莉妍等的“玉女煎HPLC指纹图谱研究”文章中虽然也建立了玉女煎中17个特征共有峰的指纹图谱，但是仍仅指认了其中5个共有峰:5-羟甲基糠醛、芒果苷、毛蕊花糖苷、蜕皮甾酮和甲基麦冬二氢高异黄酮A。在该研究中，采用相似度软件评价了指纹图谱的相似性，有必要进一步完善研究。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种玉女煎基准物质的制备方法与指纹图谱的检测方法，不仅通过控制玉女煎标准煎液浓缩过程中浓缩温度和干燥温度，有效的提高了玉女煎中芒果苷和知母皂苷BⅡ的转移率，最大限度还原了玉女煎标准煎液的质量。同时采用高效液相色谱技术建立玉女煎基准物质的指纹图谱，选择其中23个色谱峰作为特征共有峰，并对其中7个特征共有峰进行了定性鉴别。另外，分别采用相似度评价和特征共有峰模式分别计算了15批玉女煎基准物质的指纹图谱的关键参数，包括相似度、各特征峰相对保留时间和相对峰面积以及特征峰总峰面积占共有峰面积的比例，用于限定玉女煎基准物质指纹图谱的特征参数范围。本发明公开的玉女煎基准物质的指纹图谱是目前玉女煎质量控制最为全面的一种方法，对控制玉女煎的质量和保证临床疗效具有重要意义。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种玉女煎基准物质的制备方法，包括：将中药原料混合后水提，获得的水提液进行浓缩后冷冻干燥、粉碎，获得浸膏粉以提供玉女煎基准物质。
优选地，所述中药原料按重量份计，包括如下组分：生石膏18～19份；熟地37～38份；麦冬7～8份；知母5～6份；牛膝5～6份。
更优选地，所述中药原料按重量份计，包括如下组分：生石膏18.65份；熟地37.3份；麦冬7.4份；知母5.6份；牛膝5.6份。
优选地，所述水提为加水进行浸泡，先武火后文火煎煮后过滤。
更优选地，所述加水量为中药原料重量的5～7倍量，优选为中药原料重量的6倍量。即所述水提中加水量为1倍中药原料重量的5～7倍量，优选为6倍量。
更优选地，所述浸泡时间为20～60min，优选为30min。
更优选地，所述武火煎煮的液温为99.5～100.5℃。
更优选地，所述文火煎煮的液温为85.0～90.0℃。
更优选地，所述煎煮后水提液体积为加水量体积的66～74％，优选为70％。
更优选地，所述武火煎煮的时间为4～6min，优选为5min。
更优选地，所述文火煎煮的时间为25～35min，优选为30min。
优选地，所述浓缩为减压浓缩，所述减压浓缩至1:1～2(每1毫升水提液含有1-2克中药原料)，浓缩温度为40～60℃，浓缩压力为-0.08～-0.1Mpa。
优选地，所述冷冻干燥中，冷冻温度为-20～-80℃；冷冻时间为11-13h，优选为12h；干燥温度为-45～-55℃；干燥时间为18-22h，优选为20h。所述冷冻干燥在冷冻干燥机中进行。
上述玉女煎中多种成分具有药理作用，例如，熟地在方中为滋阴之药，现代药理显示熟地黄的水提液具有抗焦虑、抗肿瘤、促进内皮细胞增殖以及增强学习记忆力等作用；其醇提液具有抗衰老，促进红细胞新生的作用；其中抗氧化、抗突变以及增强机体免疫力等作用与熟地多糖相关；5-羟甲基糠醛可以增强大鼠红细胞变形性；梓醇、二氢梓醇、毛蕊花糖苷等则可以预防糖尿病大鼠的骨质流失。
知母性苦寒，在方中助石膏清胃火，兼滋阴之效，知母中的皂苷类及黄酮类是其主要的药理活性成分。芒果苷及其葡糖苷使知母在胰岛素耐受试验中能够降低血糖水平；知母皂苷BⅢ(Timosaponin-BIII，TBIII)和反式异扁柏脂素(trans-hinokiresinol，t-HL)能够对神经炎症相关的神经生成性疾病有治疗意义。知母皂苷BⅡ作为知母的主要活性成分和指标性成分，约占知母总皂苷的74％，对老年痴呆症、脑缺血、抗血小板凝集、抗氧化、降血压、降血糖、抗骨质疏松、抗抑郁、降脂等具有一定作用，对大鼠脑缺血导致的学习和记忆障碍具有显著的改善作用。
麦冬养胃阴，亦可助熟地滋肾阴，其块根中富含有多糖、皂苷、黄酮等有效成分，具有强心、利尿、抗菌等药理作用，临床可用于抗炎、抗心血管疾病、抗肿瘤、抗衰老、免疫调节等，在治疗心律失常、糖尿病、久咳不愈等方面具有良好的效果。研究发现麦冬多糖MDG-1可治疗心血管疾病，同时麦冬多糖还能降血糖、降血脂、对免疫系统起到调节作用、对心肌缺血起到保护作用；麦冬甾体皂苷对阿霉素引导的慢性心力衰竭具有心脏保护作用；甲基麦冬黄酮A具有抗氧化的作用。
牛膝在方中可引热下行，现代药理学研究发现其具有降血压、抗炎、镇痛、调节免疫、抗肿瘤、抗衰老等方面的药理作用，牛膝中的甾酮类物质对成骨样细胞增殖有促进作用，为牛膝补肝肾、强筋骨提供了有力依据；牛膝多肽可减少炎症介质的产生，为其作为一种具有明确机制的神经保护剂开发提供了新思路和新靶点；β-蜕皮甾酮可以预防泼尼松龙和地塞米松诱导的骨质疏松。
本发明第二方面提供一种玉女煎基准物质，由上述方法制备获得。
本发明第三方面提供一种玉女煎的制剂，包含上述玉女煎基准物质。
优选地，所述玉女煎的制剂中包含一种或者多种常规的药学上可接受的载体。
优选地，所述制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、注射剂或外用药物制剂中的一种。
本发明第四方面提供一种玉女煎基准物质的指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：将玉女煎基准物质样品加第一溶剂溶解、超声、第一次过滤，取续滤液浓缩后加第二溶剂溶解、第二次过滤，获得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：提供对照品溶液，所述对照品溶液包括5-羟甲基糠醛、新芒果苷、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、麦冬甲基黄烷酮A对照品和第三溶剂；
3)测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱(HPLC)法分别测定供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，
从而获得玉女煎基准物质的指纹图谱。
优选地，步骤1)中，所述第一溶剂为乙醇的水溶液。
更优选地，所述乙醇的水溶液为体积百分比为70～80％的乙醇水溶液，优选为75％。
优选地，步骤1)中，所述玉女煎基准物质样品加入的质量与第一溶剂加入的体积之比为3：45～55，g/mL，优选为3:50。
优选地，步骤1)中，所述超声时间为25-35min，优选为30min。
优选地，步骤1)中，所述第一次过滤是指：取超声后上清液过滤膜，放弃初滤液后，获得续滤液。
优选地，步骤1)中，所述续滤液浓缩至近干。
优选地，步骤1)或2)中，所述第二溶剂为甲醇的水溶液。
更优选地，所述甲醇的水溶液为体积百分比为45～55％的甲醇水溶液，优选为50％。
优选地，步骤1)中，所述玉女煎基准物质样品加入的质量与第二溶剂加入的体积之比为3：4～6，g/mL，优选为3:5。
优选地，步骤1)中，所述第一次过滤和/或第二次过滤为滤膜过滤，采用的滤膜为0.45μm微孔滤膜。
优选地，步骤2)中，所述第三溶剂为甲醇。
优选地，步骤2)中，所述5-羟甲基糠醛的CAS号为67-47-0，所述新芒果苷的CAS号为64809-67-2，所述芒果苷的CAS号为4773-96-0，所述β-蜕皮甾酮的CAS号为5289-74-7，所述毛蕊花糖苷的CAS号为61276-17-3，所述异毛蕊花糖苷的CAS号为61303-13-7，所述麦冬甲基黄烷酮A的CAS号为74805-92-8。
优选地，步骤2)中，所述对照品溶液过滤后取续滤液，所述过滤为滤膜过滤，采用的滤膜为0.45μm微孔滤膜。
优选地，步骤3)中，所述供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，是根据对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的色谱柱为C18反相色谱柱。
更优选地，所述高效液相色谱法中的色谱柱为Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的检测器为可变波长扫描紫外检测器(VWD)。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的柱温为25～40℃。更优选地，所述高效液相色谱法中的柱温为30℃。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的进样量为10～20μL。更优选地，所述高效液相色谱法中的进样量为10μL。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，流速为0.5～2.0mL/min。更优选地，所述高效液相色谱法中，流速为1.0mL/min。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，检测波长为250～334nm，优选为258nm。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，流动相为0.05～0.2％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.05～0.2％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为65min；梯度洗脱。
更优选地，所述高效液相色谱法中，流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为65min；梯度洗脱。
所述0.05～0.2％磷酸水溶液为体积百分数为0.05～0.2％的磷酸水溶液。所述0.1％磷酸水溶液为体积百分数为0.1％的磷酸水溶液。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0～45min，A相：B相体积比为98：2～65：35；
45～55min，A相：B相体积比为65：35～0：100；
55～60min，A相：B相体积比为0：100～98：2；
60～65min，A相：B相体积比为98：2～98：2。
本发明第五方面提供一种玉女煎基准物质的标准指纹图谱的构建方法，包括：通过采用前述玉女煎基准物质的指纹图谱的检测方法分别对多批玉女煎基准物质样品进行检测，获得多批玉女煎基准物质样品的指纹图谱生成共有模式对照图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间、各共有特征峰面积与总峰面积的比值，并根据相对保留时间对玉女煎基准物质样品指纹图谱中指标成分进行归属定位，建立玉女煎基准物质的标准指纹图谱。
优选地，所述玉女煎基准物质样品的检测批次为10～20批，优选为15批。
优选地，所述共有模式对照图谱中，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件对多批玉女煎基准物质样品的指纹图谱进行相似度比较。
更优选地，所述多批玉女煎基准物质样品的指纹图谱进行相似度比较时，选取“时间窗宽度”为0.1min计算，进行全谱峰匹配。
更优选地，所述多批玉女煎基准物质样品的指纹图谱的相似度≥0.95。
优选地，所述玉女煎基准物质的标准指纹图谱如图11所示，以各共有特征峰的保留时间与参照峰的保留时间比值作为相对保留时间，包括23个共有特征峰，以14号峰为参照峰(S峰，保留时间为1.000)，其他22个共有特征峰的相对保留时间依次为：1号峰为0.304；2号峰为0.364；3号峰为0.395；4号峰为0.440；5号峰为0.450；6号峰为0.518；7号峰为0.562；8号峰为0.601；9号峰为0.699；10号峰为0.759；11号峰为0.777；12号峰为0.792；13号峰为0.953；15号峰为1.065；16号峰为1.080；17号峰为1.184；18号峰为1.297；19号峰为1.345；20号峰为1.452；21号峰为1.554；22号峰为2.308；23号峰为2.492；上述除14号峰外22个共有特征峰的相对保留时间的相对偏差均≤±10％。
优选地，所述玉女煎基准物质的标准指纹图谱中共有特征峰面积占总峰面积≥80％。
更优选地，所述玉女煎基准物质的标准指纹图谱中共有特征峰面积占总峰面积为80.03～83.91％。
进一步优选地，所述玉女煎基准物质的标准指纹图谱中共有特征峰面积占总峰面积为81.91±0.396％。
更优选地，所述玉女煎基准物质的标准指纹图谱中，定位确定7个指纹峰：6号峰为5-羟甲基糠醛，11号峰为新芒果苷，14号峰为芒果苷，18号峰为β-蜕皮甾酮，19号峰为毛蕊花糖苷，20号峰为异毛蕊花糖苷，23号峰为麦冬甲基黄烷酮A。
更优选地，所述玉女煎基准物质的标准指纹图谱中，所述2、6、9、10、15、19、20、21号峰归属于熟地黄，所述11、12、14、22号峰归属于知母，所述8、23号峰归属于麦冬，所述12、16、17、18号峰归属于牛膝，没有峰归属于生石膏。
本发明第六方面提供一种玉女煎基准物质的指纹图谱的质量控制方法，包括：采用前述玉女煎基准物质的指纹图谱的检测方法获得玉女煎基准物质样品的指纹图谱，与采用前述玉女煎基准物质的标准指纹图谱的构建方法获得的玉女煎基准物质的标准指纹图谱，进行相似度比较。
优选地，所述相似度比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件进行。
优选地，所述相似度≥0.95。
本发明中的用水均为纯净水。
如上所述，本发明提供的一种玉女煎基准物质的制备方法与指纹图谱的检测方法，基于对具有代表性的生石膏、熟地、麦冬、知母、牛膝各15批药材的质量研究，采用Excel对饮片进行排列组合后生产15批玉女煎处方，按照玉女煎古代用法进行15批玉女煎的标准煎液的制备，并浓缩和干燥制备玉女煎的基准物质，以知母皂苷BII、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷、地黄苷D等为指标，优选其玉女煎基准物质的制备方法。并采用高效液相色谱法进行15批玉女煎基准物质的指纹图谱研究，确定其指纹图谱关键特征参数。
本发明在处方考证的基础上，以古代医籍中记载的制备方法制备的标准煎液为依据，结合现代中药制药技术，尽可能还原玉女煎的古代用法，探索玉女煎基准物质的制备工艺，通过优选的制备步骤及其条件，能够获得具有优异质量的玉女煎。相比常规方法制备的玉女煎，其质量稳定、不合格率低，不同批次的玉女煎一致性好。特别是，在经典名方玉女煎的基准物质研究过程中，我们发现其浓缩和干燥工艺对于玉女煎中芒果苷和知母皂苷BⅡ二者成分的转移率影响较大，目前未见相关文献和专利进行报道。
同时，根据目前关于玉女煎指纹图谱检测方法出现的不足，本发明采用高效液相色谱法建立玉女煎基准物质的指纹图谱，确认其中23个色谱峰为共有特征峰，采用对照品比对的方法，标定了5-羟甲基糠醛、新芒果苷、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、麦冬甲基黄烷酮A共7个指纹峰，相比现有技术，增加了对新芒果苷和异毛蕊花糖苷的研究，增加了在玉女煎中含量较高的5-羟甲基糠醛和异毛蕊花糖苷、麦冬甲基黄烷酮A化学成分的定性鉴别。并从共有特征峰相对保留时间以及共有特征峰面积占总峰面积的比例进行指纹图谱关键特征参数的计算和表征，可用于控制玉女煎基准物质的质量，为玉女煎复方制剂的合理开发提供了研究基础，并用于玉女煎基准物质制备工艺研究及质量控制方法研究。该方法从整体上评价玉女煎内在化学物质的种类及传递规律。
另外，本发明在处方考证的基础上，以古代医籍中记载的煎煮方法制备的标准煎液为依据，结合现代中药制药技术，尽可能还原玉女煎的古代用法，探索玉女煎基准物质的制备工艺，最大限度保障了指标成分知母皂苷BII、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷和地黄苷D的转移率。同时通过建立玉女煎基准物质的高效液相指纹图谱，整体控制玉女煎的内在质量，为更好地建立玉女煎整体质量控制评价体系提供科学试验依据。
附图说明
图1示为不同洗脱梯度下玉女煎基准物质的指纹图谱的检测色谱图。
图2显示为玉女煎基准物质的指纹图谱的精密度实验色谱图。
图3显示为玉女煎基准物质的指纹图谱的重复性实验色谱图。
图4显示为玉女煎基准物质的指纹图谱的稳定性实验色谱图。
图5显示为玉女煎基准物质的共有特征峰中生石膏专属性色谱图。
图6显示为玉女煎基准物质的共有特征峰中熟地专属性色谱图。
图7显示为玉女煎基准物质的共有特征峰中知母专属性色谱图。
图8显示为玉女煎基准物质的共有特征峰中麦冬专属性色谱图。
图9显示为玉女煎基准物质的共有特征峰中牛膝专属性色谱图。
图10显示为15批玉女煎基准物质的指纹图谱的共有模式对照图。
图11显示为玉女煎基准物质的标准指纹图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
芒果苷(批号111607-201704，纯度98.1％)、β-蜕皮甾酮(批号111638-201706，纯度98.3％)、毛蕊花糖苷(批号111530-201713，纯度95.2％)，以上对照片均购自中国食品药品检定研究院。新芒果苷(批号C13S8G43633，纯度98.0％)、异毛蕊花糖苷(批号W17J10C90785，纯度98.0％)、5-羟甲基糠醛(批号H12M9Z61023，纯度98.0％)，以上对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。麦冬甲基黄烷酮A(批号18010315，纯度99.97％)，购自成都曼斯特生物科技有限公司。知母皂苷BII(批号260024-202007，纯度98.72％)、地黄苷D(批号040005-202005，纯度98.66％)，以上对照品均购自上海鸿永生物科技有限公司。
甲醇(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(色谱纯)，均来自于国药集团化学试剂有限公司。
15批次生石膏、熟地、麦冬、知母、牛膝为常规使用的生石膏、熟地、麦冬、知母、牛膝药材，从市场上购买获得。
2、仪器
Agilent-1260高效液相色谱仪：可变波长扫描紫外检测器(G7114A)；四元恒带真空脱气机流泵(G7112B)，自动进样器(G7129A)，柱温箱(G7116A)，美国安捷伦公司；XS105DU电子天平(梅特勒-托利多中国)；SB-5200DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BSA124S分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。
实施例1
按重量份计，取生石膏18.65g，熟地37.3g，知母、牛膝各5.6g，麦冬7.4g，加入6倍量水浸泡30分钟，煎煮1次，武火在100℃煎煮5min，文火在88℃煎煮30min，获得的水提液在50℃、浓缩压力为-0.09Mpa下进行浓缩至1:1，再将浓缩液在-80℃下冷冻12h、再在-50℃下干燥20h，经粉碎处理后获得浸膏粉，即得玉女煎基准物质样品1#。
实施例2
1、供试品和对照品的制备
取实施例1制备的玉女煎基准物质样品1#3g，加50ml的75％乙醇水溶液，超声30min，放冷滤过，取续滤液，浓缩至近干，加50％甲醇水溶液溶解并定容至5ml容量瓶，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液1#。
分别取5-羟甲基糠醛、新芒果苷、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷及麦冬甲基黄烷酮A对照品，加甲醇溶解并定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得对照品溶液。
2、色谱条件
高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；检测波长：258nm；流速：1.0ml/min；进样量：10μL；流动相：0.1％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为65min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-45min，A相：B相体积比为98：2-65：35；
45-55min，A相：B相体积比为65：35-0：100；
55-60min，A相：B相体积比为0：100-98：2；
60-65min，A相：B相体积比为98：2-98：2。
3、测定
采用上述步骤2中的色谱条件的高效液相色谱法分别测定上述步骤1中供试品溶液1#和对照品溶液，获得供试品溶液1#的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱。其中，所述供试品溶液1#的指纹图谱，要与对照品溶液的指纹图谱进行比较，根据对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液1#的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液1#指纹图谱中的指标成分进行归属定位，获得玉女煎基准物质的指纹图谱。
实施例3
采用上述实施例2中建立的玉女煎基准物质的指纹图谱的检测方法对15批玉女煎基准物质样品进行检测，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，得到的供试品的指纹图谱数据的AIA格式，导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件中，选择15批次玉女煎基准物质的色谱图中均存在的色谱峰作为共有特征峰，15批玉女煎基准物质的指纹图谱的共有模式对照图，结果见图10。
如图10所示的共有模式对照图谱中，15批玉女煎基准物质的指纹图谱进行相似度比较时，选取“时间窗宽度”为0.1min计算，进行全谱峰匹配。15批玉女煎基准物质的指纹图谱的相似度均大于0.95。以图10中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间、各共有特征峰面积与总峰面积的比值，并根据相对保留时间对玉女煎基准物质样品指纹图谱中指标成分进行归属定位，建立玉女煎基准物质的标准指纹图谱。玉女煎基准物质的标准指纹图谱见图11。从图11可以看出14号峰的色谱峰(保留时间RT≌23.19min，峰面积百分比A％≌23.54％)积分百分比较大，因此选择14号峰为参照峰(标号为S，相对峰面积和保留时间为1.000)。
玉女煎的标准指纹图谱以各共有特征峰的保留时间与参照峰的保留时间比值作为相对保留时间，包括23个共有特征峰，以14号峰为参照峰(S峰，保留时间为1.000)，其他22个共有特征峰的相对保留时间依次为：1号峰为0.303-0.304；2号峰为0.363-0.365；3号峰为0.394-0.396；4号峰为0.439-0.442；5号峰为0.449-0.452；6号峰为0.517-0.519；7号峰为0.561-0.563；8号峰为0.600-0.602；9号峰为0.698-0.700；10号峰为0.758-0.760；11号峰为0.776-0.778；12号峰为0.792-0.793；13号峰为0.951-0.955；15号峰为1.065-1.066；16号峰为1.079-1.082；17号峰为1.183-1.185；18号峰为1.296-1.298；19号峰为1.344-1.347；20号峰为1.451-1.454；21号峰为1.552-1.556；22号峰间为2.305-2.318；23号峰为2.489-2.496。
同时，定位确定7个指纹峰：6号峰为5-羟甲基糠醛，11号峰为新芒果苷，14号峰为芒果苷，18号峰为β-蜕皮甾酮，19号峰为毛蕊花糖苷，20号峰为异毛蕊花糖苷，23号峰为麦冬甲基黄烷酮A。
根据15批次供试品HPLC图谱所给出的相关参数，计算图谱中非共有峰面积、共有特征峰面积及占总峰面积的百分比。结果显示23个共有特征峰面积占总峰面积为80.03～83.91％，非共有峰面积不超过总峰面积的20％。
实施例4指纹图谱相似度模式方法学考察
1、精密度
按实施例2下供试液的处理方法，取同一供试品溶液，按实施例2下色谱条件重复进样6次，记录色谱图。通过指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)评价相似度，相似度均大于0.95，表明仪器的精密度良好。具体实验结果见表1、图2。
表1玉女煎基准物质的指纹图谱的精密度实验结果
Figure GDA0003909744470000111
Figure GDA0003909744470000121
2、重复性
按照实施例2下供试品溶液制备方法，平行处理6份，以实施例2下的色谱条件进样，记录色谱图。通过指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)评价相似度，相似度均大于0.95，结果表明:表明方法的重复性良好。具体实验结果见表2、图3。
表2玉女煎基准物质的指纹图谱的重复性实验结果
Figure GDA0003909744470000122
3、稳定性
按实施例2下供试液的处理方法，取同一供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10，12，24h后进行测定，记录色谱图。通过指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)评价相似度，相似度均大于0.95，结果表明：供试品溶液在24h内稳定。具体实验结果见表3、图4。
表3玉女煎基准物质的指纹图谱的稳定性实验结果
Figure GDA0003909744470000123
4、15批基准物质的相似度分析
将色谱图导入国家药典委颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版)得到15批指纹图谱生成的共有模式对照图谱，并计算其相似度。结果表明15批玉女煎基准物质的指纹图谱相似度在0.963-0.991，玉女煎的指纹图谱与其物质基准的标准图图谱比，相似度均大于0.95。
实施例5专属性考察
将玉女煎基准物质的处方中生石膏、熟地、麦冬、知母、牛膝单独提取液与阴性样品。按照实施例2下供试品溶液制备方法和色谱条件进样，记录色谱图。结果如下。
1、生石膏专属性
生石膏专属性指纹图谱色谱图中，无生石膏特征色谱峰，见图5。
2、熟地专属性
熟地专属性指纹图谱色谱图中，峰2、6、9、10、15、19、20、21归属于熟地，其中，峰6为5-羟甲基糠醛，峰19为毛蕊花糖苷，峰20为异毛蕊花糖苷，见图6。
3、知母专属性
知母专属性指纹图谱色谱图中，峰11、12、14、22归属于知母，其中，峰11为新芒果苷，峰14为芒果苷，见图7。
4、麦冬专属性
麦冬专属性指纹图谱色谱图中，峰8、23归属于麦冬，其中，峰23为麦冬甲基黄烷酮A，见图8。
5、牛膝专属性
牛膝专属性指纹图谱色谱图中，峰12、16、17、18归属于牛膝，其中，峰18为β-蜕皮甾酮，见图9。
实施例6
将实施例1中的玉女煎基准物质样品1#，分别采用不同的梯度洗脱程序进行测定，其它色谱检测条件同实施例2中的步骤2。梯度洗脱程序的具体内容见表4、5、6、7、8。测定结果的色谱图见图1。
表4梯度洗脱条件1
Figure GDA0003909744470000131
Figure GDA0003909744470000141
表5梯度洗脱条件2
Figure GDA0003909744470000142
表6梯度洗脱条件3
Figure GDA0003909744470000143
表7梯度洗脱条件4
Figure GDA0003909744470000144
表8梯度洗脱条件5
Figure GDA0003909744470000145
结果发现，梯度洗脱条件5的色谱图较其他条件分离效果较好，能够分离主要成分，且基线较平稳，故选择梯度洗脱条件5作为本发明的高效液相色谱法中的梯度洗脱条件。
实施例7
1、玉女煎基准物质的制备
取15批次生石膏、熟地、麦冬、知母、牛膝，按实施例1中的制备方法制备获得15批玉女煎基准物质样品。
2、指标成分指定
选择知母皂苷BⅡ、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷和地黄苷D作为指标成分。
3、供试品溶液和对照品溶液制备
将步骤1制备的15批玉女煎基准物质样品分别精密称定0.5g，加入5ml的水复溶，然后取1ml用甲醇定容至2ml的容量瓶，过0.45μm微孔滤膜，即得15批浸膏粉供试品溶液。
对照品溶液包括知母皂苷BⅡ、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷和地黄苷D对照品和甲醇。参照《中国药典》中对照品溶液的制备方法。
4、色谱条件
采用高效液相色谱法测定知母皂苷BⅡ、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷和地黄苷D的含量。其中知母皂苷BⅡ色谱条件参照《中国药典》2020版知母药材中知母皂苷BⅡ成分含量测定方法。芒果苷色谱条件参照《中国药典》2020版知母药材中芒果苷成分含量测定方法。β-蜕皮甾酮色谱条件参照《中国药典》2020版牛膝药材中β-蜕皮甾酮成分含量测定方法。毛蕊花糖苷色谱条件参照《中国药典》2015版熟地饮片中毛蕊花糖苷成分含量测定方法。地黄苷D色谱条件参照《中国药典》2020版熟地黄饮片中地黄苷D成分含量测定方法。
5、转移率的计算
按步骤4的色谱条件测定获得知母药材中知母皂苷BⅡ和芒果苷、牛膝药材中β-蜕皮甾酮、熟地饮片中毛蕊花糖苷和地黄苷D的含量。同时，按步骤4的色谱条件测定步骤3中的供试品溶液(浸膏粉供试品溶液)和对照品溶液，获得供试品溶液中知母皂苷BⅡ、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷和地黄苷D的含量。
按公式(1)计算转移率，所述公式(1)为：Z(％)＝A/B*100％，
式中，Z为转移率，％；A为供试品溶液中指标成分含量；B为药材中指标成分含量。
6、玉女煎基准物质转移率的计算
采用高效液相色谱法对1-15批玉女煎基准物质进行指标成分含量测定，并计算转移率。实验结果见表9。
表9 15批玉女煎基准物质转移率(％)测定结果(n＝3)
Figure GDA0003909744470000151
Figure GDA0003909744470000161
结果发现，知母皂苷BⅡ的转移率为10.50～16.89％，在均值14.02％的70～130％(9.82～18.23％)之间；芒果苷的转移率范围为31.09～44.22％，在均值的35.36％的70～130％(24.75～45.97％)之间；毛蕊花糖苷的转移率范围为34.90～57.77％，在均值44.16％的70～130％(30.91～57.41％)之间；β-蜕皮甾酮的转移率范围为50.48～79.44％，在均值66.07％的70～130％(46.25～85.89％)之间；地黄苷D的转移率为37.87～46.45％，在均值42.10％的70～130％(29.47～54.73％)之间。说明本法采用减压浓缩和冷冻干燥的工艺制备玉女煎基准物质，避免在浓缩干燥过程中对玉女煎中化学成分产生较大影响，能够避免高温浓缩和干燥对其主要成分的含量的影响，制备的玉女煎基准物质的质量可靠稳定。
综上所述，本发明提供的一种玉女煎基准物质的制备方法与指纹图谱的质量控制方法，能够获得具有优异质量的玉女煎，其质量稳定、不合格率低，还建立了玉女煎的高效液相指纹图谱，有利于整体控制玉女煎的内在质量，为更好地建立玉女煎整体质量控制评价体系提供科学试验依据。所以，本发明克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.一种玉女煎基准物质的指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：将玉女煎基准物质样品加第一溶剂溶解、超声、第一次过滤，取续滤液浓缩后加第二溶剂溶解、第二次过滤，获得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：提供对照品溶液，所述对照品溶液包括5-羟甲基糠醛、新芒果苷、芒果苷、β-蜕皮甾酮、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、麦冬甲基黄烷酮A对照品和第三溶剂；
3)测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得玉女煎基准物质的指纹图谱；
所述第一溶剂为乙醇的水溶液；所述第二溶剂为甲醇的水溶液；所述第三溶剂为甲醇；
步骤3)中，所述高效液相色谱法的检测条件为：色谱柱为C18反相色谱柱；检测器为可变波长扫描紫外检测器；柱温为25～40℃；进样量为10～20μL；流速为0.5～2.0mL/min；检测波长为250～334nm；流动相为0.05～0.2％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.05～0.2％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为65min；梯度洗脱；
所述梯度洗脱的具体程序为：0～45min，A相：B相体积比为98：2～65：35；45～55min，A相：B相体积比为65：35～0：100；55～60min，A相：B相体积比为0：100～98：2；60～65min，A相：B相体积比为98：2～98：2；
所述玉女煎基准物质由以下方法制备，所述制备方法包括：将中药原料混合后水提，获得的水提液进行浓缩后冷冻干燥、粉碎，获得浸膏粉以提供玉女煎基准物质；
所述中药原料按重量份计，包括如下组分：生石膏18～19份；熟地37～38份；麦冬7～8份；知母5～6份；牛膝5～6份。
2.根据权利要求1所述的一种玉女煎基准物质的指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1)或2)中包括以下条件中的任一项或多项：
B1)所述玉女煎基准物质样品加入的质量与第一溶剂加入的体积之比为3：45～55，g/mL；
B2)所述超声时间为25-35min；
B3)所述玉女煎基准物质样品加入的质量与第二溶剂加入的体积之比为3：4～6，g/mL。
3.一种玉女煎基准物质的标准指纹图谱的构建方法，包括：通过采用权利要求1-2任一所述的玉女煎基准物质的指纹图谱的检测方法分别对多批玉女煎基准物质样品进行检测，获得多批玉女煎基准物质样品的指纹图谱生成共有模式对照图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间、各共有特征峰面积与总峰面积的比值，并根据相对保留时间对玉女煎基准物质样品指纹图谱中指标成分进行归属定位，建立玉女煎基准物质的标准指纹图谱。
4.根据权利要求3所述的一种玉女煎基准物质的标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述玉女煎基准物质的标准指纹图谱以各共有特征峰的保留时间与参照峰的保留时间比值作为相对保留时间，包括23个共有特征峰，以14号峰为参照峰S峰，保留时间为1.000，其他22个共有特征峰的相对保留时间依次为：1号峰为0.304；2号峰为0.364；3号峰为0.395；4号峰为0.440；5号峰为0.450；6号峰为0.518；7号峰为0.562；8号峰为0.601；9号峰为0.699；10号峰为0.759；11号峰为0.777；12号峰为0.792；13号峰为0.953；15号峰为1.065；16号峰为1.080；17号峰为1.184；18号峰为1.297；19号峰为1.345；20号峰为1.452；21号峰为1.554；22号峰为2.308；23号峰为2.492；上述除14号峰外22个共有特征峰的相对保留时间的相对偏差均≤±10％。
5.根据权利要求3所述的一种玉女煎基准物质的标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述玉女煎基准物质的标准指纹图谱中共有特征峰面积占总峰面积≥80％。
6.根据权利要求4所述的一种玉女煎基准物质的标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述玉女煎基准物质的标准指纹图谱中，定位确定7个指纹峰：6号峰为5-羟甲基糠醛，11号峰为新芒果苷，14号峰为芒果苷，18号峰为β-蜕皮甾酮，19号峰为毛蕊花糖苷，20号峰为异毛蕊花糖苷，23号峰为麦冬甲基黄烷酮A。
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