CN105181848A - 血府逐瘀汤及胶囊的uplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱检测方法，属于柱色谱法领域。本发明将血府逐瘀汤粉末或胶囊内容物和对照品溶液分别进行超高效液相色谱分析。色谱条件为：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长：280nm，柱温：30～50℃，流速：0.3～0.5mL·min^-1，进样量：2μL。分析血府逐瘀汤和胶囊指纹图谱信息共获得30个共有峰，以野漆树苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，再通过标准品比对的方法，鉴定了16个共有峰。本发明方法全面、快速、可靠，通过该方法获得比较全面的多种成分的指纹图谱信息，从而为血府逐瘀汤及胶囊质量控制提供参考依据。

Description

血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明属于柱色谱法领域，具体是一种血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱检测方法。

背景技术

指纹图谱是建立在中药化学成分研究的基础上，通过多种分析技术对中药复杂体系进行系统研究，从而表征药品质量的一种方法。中药指纹图谱研究从药材的生产、粗加工、中间体、成品等各个方面开展相似性和相关性分析，发现质量的变异和缺陷，从而全面、特异地控制中药的质量，特别适用于中药及复方制剂复杂体系的质量控制研究。中药及中药制剂组方药味多，成分复杂，很难用其中一个或几个有效成分的含量来控制中药制剂的质量。截至目前，在中药的生产和流通中，中药产品质量控制主要通过单成分定量，并不能对产品的质量进行全面控制。因此建立一种综合评价中药质量的方法是必然趋势。

血府逐瘀汤源自清代王清任的《医林改错》，是诸活血化瘀方中最具代表性的经方，具有活血化瘀，行气止痛的功效，临床应用广泛。原方由当归、地黄、桃仁、枳壳、牛膝、赤芍、柴胡、甘草、川芎、桔梗、红花十一味药组成，是在桃红四物汤（活血化瘀而养血）、四逆散（行气和血而舒肝）基础上加桔梗、牛膝而成。方中当归、桃仁、红花活血化瘀兼和血，为君药；赤芍、川芎增强君药活血化瘀作用，地黄滋阴养血为臣药；桔梗能载药上行入血府（胸中）；柴胡疏肝解郁，升举清阳，与枳壳配伍，理气散结之力尤著；牛膝行血逐瘀，引瘀血下行，同为佐药；甘草缓急和中，为使药；全方体现了血药与气药的配伍、升药与降药的有机结合。血府逐瘀汤作为经典名方，临床疗效确切，基于血府逐瘀汤研究开发了多个现代制剂，包括血府逐瘀片、泡腾片、丸、颗粒、口服液、胶囊、软胶囊等剂型。

发明内容

本发明就是为了解决现有技术不能全面、科学评价血府逐瘀汤及胶囊的质量的问题，所提出的一种血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱检测方法。

本发明是按照以下技术内容实现的。

一种血府逐瘀汤及胶囊的UPLC(超高效液相色谱)指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

a．对照品溶液的制备

分别称取芍药苷、野漆树苷、芍药内酯苷、甘草素、柚皮素、竹节参皂苷IVa、柚皮苷、没食子酸、甘草苷、甘草酸、绿原酸、蜕皮甾醇、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚、羟基红花黄色素A对照品并溶于50%甲醇水溶液，制成1 mg•mL^-1的对照品储备液；取各对照品储备液100 μL，置于2 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；

b．供试品溶液的制备

分别取血府逐瘀汤粉末或胶囊内容物，用50%甲醇水溶液溶解，超声处理后，再加入50%甲醇水溶液，制成0.02g·mL^-1的供试品溶液；

c. 色谱条件

色谱柱：2.1×100 mm，1.7 μm ，ACQUITY UPLC^® BEH C18；流动相以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，其体积比为流动相A占3～97%，流动相B占97%～3%，进行梯度洗脱；检测波长：280 nm，柱温：30～50℃，流速：0.3～0.5 mL·min^-1，进样量：2 μL；

d. 将步骤a和b所制备的溶液按照步骤c的色谱条件进行超高效液相色谱测定。

本发明获得了如下有益效果。

本发明有效的解决了现有技术不能全面、科学评价血府逐瘀汤及胶囊质量的问题。本发明建立的血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱的检测方法符合指纹图谱方法学研究要求，进一步阐明了血府逐瘀汤及胶囊的化学物质基础；本发明所述方法可用于血府逐瘀汤及胶囊的质量控制与评价，有效的保证了血府逐瘀产品的质量，对血府逐瘀汤及胶囊的质量控制具有重要意义。本发明所述方法精密度高、重现性及稳定性好，对血府逐瘀汤及胶囊质量进行了全面评价，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明血府逐瘀汤对照指纹图谱；

图2是本发明标准品色谱图；

图3是本发明3批血府逐瘀汤的指纹图谱；

图4是本发明13批血府逐瘀胶囊的指纹图谱。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明做进一步说明。

本发明所述血府逐瘀胶囊，由天津宏仁堂药业有限公司提供；

本发明所述血府逐瘀汤，由本实验室自制。

具体的制备方法如下：

血府逐瘀汤：当归9克、生地9克、桃仁12克、枳壳6克、牛膝9克、赤芍6克、柴胡3克、甘草6克、川芎4.5克、桔梗4.5克、红花9克，8倍量蒸馏水浸泡1小时，加热回流提取2小时，冷却后倒出提取液；药渣加8倍量蒸馏水再加热回流提取2小时；合并两次提取液，减压浓缩得浸膏；浸膏40 ℃真空干燥得血府逐瘀汤干浸膏，粉碎，即可。

血府逐瘀胶囊：当归81克、生地81克、桃仁108克、枳壳54克、牛膝81克、赤芍54克、柴胡27克、甘草27克、川芎40克、桔梗40克、红花81克，以上十一味，取桃仁半量，当归、赤芍、麸炒枳壳、川芎、柴胡，粉碎成细粉，过筛，混匀；其余红花等五味及剩余桃仁加水煎煮三次，煎液滤过，合并滤液，浓缩成稠膏，与上述粉末混匀，制成颗粒，干燥，粉碎，过筛，装入胶囊，制成1000粒即得。

实施例1：血府逐瘀汤指纹图谱测定方法的建立

1.1 仪器

ACQUITY超高效液相色谱仪（美国Waters公司，包括Waters ACQUITY二元泵，DAD检测器，自动进样器，在线脱气机，柱温箱，Empower色谱工作站）；超纯水仪（Milli-Q，美国Millipore公司）；Vortex-5涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；J25低温高速离心机（美国Thermo Forma公司）；十万分之一天平（METTLER TOLEDO XS205，瑞士METTLER公司）；万分之一天平（METTLER TOLEDO AL204，瑞士METTLER公司）；SCIENTZ SB 25-12DTN超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；JSP-200粉粹机（浙江永康金穗机械制造厂）。

1.2 试药与试剂

样品：血府逐瘀胶囊：天津宏仁堂药业有限公司，批号为E03051、E03052、E03053、E03054、E03055、E03056、E03057、E03058、E03059、E03060、E03061、E03062、E03063。

血府逐瘀汤：实验室自制。

标准品：芍药苷（RS0453）、野漆树苷（THB-TS40S）、芍药内酯苷（RS0042）、柚皮素（THB-2S340）、竹节参皂苷IVa（THB-1S375）购自于天津拓海生物科技有限公司；柚皮苷（110722-200610）、没食子酸（110831-200803）、甘草苷（111610-201106）、甘草酸（110731-201317）购自中国食品药品检定研究院；绿原酸（WOZ-4-2）、蜕皮甾醇、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚、甘草素（纯度≥98%）购自天津中新药业研究中心；羟基红花黄色素A（Q-008-14073）购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

试剂：乙腈（美国Sigma-Aldrich有限公司），甲酸（天津市大茂化学试剂厂），纯净水（实验室自制）。

1.3 供试品溶液的制备

取血府逐瘀汤粉末适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液适量，超声20 min，取出，放凉，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，即可。

1.4 对照品溶液的制备：

取芍药苷、野漆树苷、芍药内酯苷、甘草素、柚皮素、竹节参皂苷IVa、柚皮苷、没食子酸、甘草苷、甘草酸、绿原酸、蜕皮甾醇、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚、羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，分别加入50%甲醇水溶液，制成1 mg•mL^-1的溶液，作为对照品储备液。取各对照品储备液100 μL，置于2 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

1.5 对照试验

吸取对照品溶液2 μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图和保留时间，即得。

1.6 色谱条件：

色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18 （2.1×100 mm, 1.7 μm）；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，其体积配比为流动相A占3～97%，流动相B占97%～3%，进行梯度洗脱；具体洗脱体积浓度配制比为：

0～8 min，流动相A所占的体积比3～8%，流动相B占的体积比为97%～92%；

8～24 min，流动相A所占的体积比8～19%，流动相B占的体积比为92%～81%；

24～35 min，流动相A所占的体积比19～45%，流动相B占的体积比为81%～55%；

检测波长：280 nm，柱温：50 ℃，流速：0.3 mL·min^-1，精密吸取供试品溶液2 μL注入超高效液相色谱仪，记录35 min色谱图，得到血府逐瘀汤指纹图谱。

1.7 共有峰的确定

分析血府逐瘀汤指纹图谱信息（如图1所示），获得30个共有峰，以21号峰（野漆树苷）为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积；通过标准品（如图2所示）比对的方法，鉴定了16个共有峰。

实验结果显示：供试品指纹图谱中共有30个特征峰，以参照峰野漆树苷的保留时间和峰面积为1，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，其相对保留时间应为规定值的±5%之内。

依照该方法生成的指纹图谱中有30个共有峰，以野漆树苷为参照峰，其相对保留时间应为规定值的±5%：1号峰：0.076±0.004；2号峰：0.098±0.005；3号峰：0.119±0.006；4号峰：0.153±0.008；5号峰：0.178±0.009；6号峰：0.203±0.010；7号峰：0.296±0.015；8号峰：0.308±0.015；9号峰：0.332±0.017；10号峰：0.359±0.018；11号峰：0.384±0.019；12号峰：0.459±0.023；13号峰：0.527±0.026；14号峰：0.550±0.027；15号峰：0.596±0.030；16号峰：0.699±0.035；17号峰：0.829±0.041；18号峰：0.892±0.045；19号峰：0.920±0.046；20号峰：0.974±0.049；21号峰（S）号峰：1.000；22号峰：1.042±0.052；23号峰：1.065±0.053；24号峰：1.096±0.055；25号峰：1.308±0.065；26号峰：1.318±0.066；27号峰： 1.349±0.067；28号峰：1.376±0.069；29号峰：1.389±0.069；30号峰：1.592±0.080。

依照本发明测定方法生成的指纹图谱中有30个特征峰，以野漆树苷为参照峰，得到血府逐瘀汤的共有峰（峰面积占总峰面积＞3%）的相对峰面积为：1号峰：1.385±0.007；16号峰：1.067±0.016；19号峰：1.301±0.037；20号峰：11.286±0.064；21号峰（S）：1.000；24号峰：9.274±0.058。

再进一步地，依照该方法生成的UPLC指纹图谱特征峰中，以野漆树苷为参照峰，得到血府逐瘀胶囊的共有峰（峰面积占总峰面积＞3%）的相对峰面积为：2号峰：1.932±0.794；3号峰：0.554±0.314；15号峰：0.669±0.068；17号峰：0.674±0.170；18号峰：0.908±0.209； 19号峰：0.612±0.140；20号峰：6.904±0.582；21号峰（S）：1.000；22号峰：0.589±0.154；24号峰：6.961±1.781。

血府逐瘀汤指纹图谱中30个共有峰中，经过分析，1号峰为没食子酸、2号峰未鉴定、3号峰未鉴定、4号峰未鉴定、5号峰未鉴定、6号峰未鉴定、7号峰为绿原酸、8号峰未鉴定、9号峰未鉴定、10号峰为羟基红花黄色素A、11号峰未鉴定、12号峰未鉴定、13号峰为芍药内酯苷、14号峰未鉴定、15号峰为芍药苷、16号峰为甘草苷、17号峰未鉴定、18号峰为蜕皮甾醇、19号峰未鉴定、20号峰为柚皮苷、21号峰（S）为野漆树苷、22号峰为橙皮苷、23号峰为甘草素、24号峰为新橙皮苷、25号峰为柚皮素、26号峰未鉴定、27号峰为山奈酚、28号峰为竹节参皂苷IVa、29号峰未鉴定、30号峰为甘草酸。

1.8 方法学研究

1.8.1 精密度试验

取同一份供试品溶液，按照“1.6项”下色谱条件进样，连续进样6次，记录色谱图，以21号峰作为参照峰，计算各个峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1、表2。

结果表明，峰面积占总峰面积大于3%的色谱峰的相对峰面积和各共有峰的相对保留时间基本一致（RSD < 1.68%），表明仪器精密度良好。

1.8.2 重现性试验

取同一批次血府逐瘀汤粉末，按照“1.3项”下方法制备供试品溶液6份，按照“1.6项”下色谱条件进样，记录色谱图，以21号峰作为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，结果见表3、表4。

结果表明，峰面积占总峰面积大于3％的色谱峰的相对峰面积和各共有峰的相对保留时间基本一致（RSD < 1.49%），表明该方法重复性良好。

1.8.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按照“1.6”项下色谱条件进样，在相同条件下分别于0、2、4、6、8、10 h进行测定，记录色谱图，以21号峰作为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，结果见表5、表6。

结果表明，峰面积占总峰面积大于3%的色谱峰的相对峰面积和各共有峰的相对保留时间基本一致（RSD < 2.88%），表明血府逐瘀汤在10 h内稳定。

1.8.4 延迟测试

取血府逐瘀汤粉末，按照“1.3项”下方法制备供试品溶液，按照“1.6项”下色谱条件进样，延长测试时间至1 h，观察有无滞后峰出现。结果表明：无滞后峰出现。

实施例2：血府逐瘀汤指纹图谱的建立

2.1 供试品溶液的制备

取3个不同批次血府逐瘀汤粉末，取约0.5 g，精密称定，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液适量，超声20 min，取出，放凉，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，即可。

2.2 色谱条件：

色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18（2.1×100 mm, 1.7 μm）；以乙睛为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，其体积配比为流动相A占3～97%，流动相B占97%～3%，进行梯度洗脱；具体洗脱体积浓度配制比为：

0～8 min，流动相A所占的体积比3～8%，流动相B占的体积比为97%～92%；

8～24 min，流动相A所占的体积比8～19%，流动相B占的体积比为92%～81%；

24～35 min，流动相A所占的体积比19～45%，流动相B占的体积比为81%～55%；

检测波长：280 nm，柱温：50 ℃，流速：0.3 mL·min^-1， 精密吸取供试品溶液2 μL注入超高效液相色谱仪，记录35 min色谱图，得到3批次血府逐瘀汤指纹图谱（如图3所示），记录并计算血府逐瘀汤共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表7、表8。

从表8中可以看出，3批血府逐瘀汤共有峰中峰面积占总峰面积比例大于3%的有6个共有峰，通过共有峰的相对峰面积的分析，其RSD值的范围3.47~ 30.17%。

对3批血府逐瘀汤中各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的比较分析，并建立血府逐瘀汤UPLC指纹图谱，UPLC指纹图谱的建立为血府逐瘀汤的质量控制提供了可靠依据，可应用于血府逐瘀汤的质量控制与评价，提高血府逐瘀汤的质量检测标准。

实施例3：血府逐瘀胶囊指纹图谱的建立

3.1 供试品溶液的制备

取13个不同批次血府逐瘀胶囊内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液适量，超声20 min，取出，放凉，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，即可。

3.2 色谱条件：

色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18 （2.1×100 mm, 1.7 μm）；以乙睛为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，其体积配比为流动相A占3～97%，流动相B占97%～3%，进行梯度洗脱；具体洗脱体积浓度配制比为：

0～8 min，流动相A所占的体积比3～8%，流动相B占的体积比为97%～92%；

8～24 min，流动相A所占的体积比8～19%，流动相B占的体积比为92%～81%；

24～35 min，流动相A所占的体积比19～45%，流动相B占的体积比为81%～55%；

检测波长：280 nm，柱温：50 ℃，流速：0.3 mL·min^-1，精密吸取供试品溶液2 μL注入超高效液相色谱仪，记录35 min色谱图，得到13批血府逐瘀胶囊指纹图谱（如图4所示），记录并计算血府逐瘀胶囊共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表9、表10。

从表10中可以看出，13批血府逐瘀胶囊共有峰中峰面积占总峰面积大于3%的共有10个共有峰，通过对共有峰的相对峰面积的分析，其RSD值的范围为8.43~56.70%。

对13批血府逐瘀胶囊中各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的比较分析，并建立血府逐瘀胶囊UPLC指纹图谱，UPLC指纹图谱的建立为血府逐瘀胶囊的质量控制提供了可靠依据，可应用于血府逐瘀胶囊的质量控制与评价，提高血府逐瘀胶囊的质量检测标准。

综上所述，本发明建立的血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱的检测方法，以野漆树苷为参照峰，建立了一种血府逐瘀汤和胶囊的UPLC指纹图谱，标定了30个共有峰。采用标准品比对的方法，对血府逐瘀汤和胶囊的指纹图谱共有峰进行了分析研究，鉴定了绿原酸、羟基红花黄色素A、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素等16个共有峰，进一步阐明了血府逐瘀汤及胶囊的化学物质基础。

上述测定的30个有效成分能较全面表征血府逐瘀汤及胶囊内在质量。上述鉴定的成分中羟基红花黄色素A、柚皮素、山奈酚、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等成分，现代药理学实验表明，这些有效成分可抑制血小板聚集，具有抗血栓的作用，与血府逐瘀汤及胶囊具有活血化瘀，行气止痛的功效相关，能有效保证成品的质量，对血府逐瘀汤及胶囊的质量控制具有重要意义。

本发明建立的血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱测定方法，可用于血府逐瘀汤及胶囊的质量控制与评价，是全面评价质量的有效手段。本发明建立的血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱检测方法，各剂型特征峰相对保留时间基本一致，说明该分析方法稳定性较好。实验结果表明，该方法具有精密度高，重现性及稳定性好的特点，说明该检测方法能够测定血府逐瘀汤及胶囊中的有效成分。

本发明采用UPLC-DAD（超高效液相色谱仪—二极管阵列检测器）技术，建立了血府逐瘀汤及胶囊的指纹图谱，选取的峰面积占总峰面积大于3%的色谱峰的相对峰面积和相对保留时间RSD值均小于3.0%，基本符合指纹图谱方法学研究要求。

Claims (3)

1.一种血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

a．对照品溶液的制备

分别称取芍药苷、野漆树苷、芍药内酯苷、甘草素、柚皮素、竹节参皂苷IVa、柚皮苷、没食子酸、甘草苷、甘草酸、绿原酸、蜕皮甾醇、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚、羟基红花黄色素A对照品并溶于50%甲醇水溶液，制成1 mg•mL^-1的对照品储备液；取各对照品储备液100 μL，置于2 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液;

b．供试品溶液的制备

分别取血府逐瘀汤粉末或胶囊内容物，用50%甲醇水溶液溶解，超声处理后，再加入50%甲醇水溶液，制成0.02g·mL^-1的供试品溶液；

c. 色谱条件

色谱柱：2.1×100 mm，1.7 μm ，ACQUITY UPLC^® BEH C18；流动相以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，其体积比为流动相A占3～97%，流动相B占97%～3%，进行梯度洗脱；检测波长：280 nm，柱温：30～50℃，流速：0.3～0.5 mL·min^-1，进样量：2 μL；

d. 将步骤a和b所制备的溶液按照步骤c的色谱条件进行超高效液相色谱测定。

2.根据权利要求1所述的一种血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤b中的色谱条件为：柱温：50 ℃，流速：0.3 mL·min^-1。

3.根据权利要求1所述的一种血府逐瘀汤及胶囊的UPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤c色谱条件中流动相所采用的梯度洗脱条件为：

0～8 min时，流动相A所占的体积比3～8%，流动相B占的体积比为97%～92%；

8～24 min时，流动相A所占的体积比8～19%，流动相B占的体积比为92%～81%；

24～35 min时，流动相A所占的体积比19～45%，流动相B占的体积比为81%～55%。