KR20150000157A

KR20150000157A - 누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에

Info

Publication number: KR20150000157A
Application number: KR1020130072203A
Authority: KR
Inventors: 김성렬; 구태원; 최광호; 강석우; 박승원; 김동욱; 이상훈
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-01-02
Also published as: KR101533602B1

Abstract

본 발명은 누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에에 관한 것이다.
본 발명의 누에 면역반응 유도용 조성물은 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 유효성분을 포함하는 것을 특징으로 그 제조방법은 유산균을 배양하는 제1단계; 상기 배양된 유산균을 원심분리한 후 상등액을 제거하여 균체를 획득한 다음, 버퍼를 넣어 유산균현탁액을 제조하는 제2단계; 상기 유산균 현탁액을 초음파 분해로 인해 유산균의 세포를 파쇄하여 유산균 세포파쇄물을 제조하는 제3단계; 상기 유산균 세포파쇄물에 부탄올을 첨가하여 추출한 다음 원심분리한 후, 상등액을 제거하여 단백질이 제거된 하등액을 얻는 제4단계; 상기 하등액은 1차 동결건조하여 동결건조물을 제조하는 제5단계; 상기 동결건조물을 물로 녹인 후, 이를 투석한 다음 2차 동결건조하여 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 제조하는 제 6단계 및, 상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 포함하는 누에 면역반응 유도용 조성물을 제조하는 제7단계;를 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 누에의 체액성 면역반응으로 생성되는 항균성 단백질 발현을 유도하는 누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에가 제공된다.

Description

누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에{Compositions for inducing an immune response of silkworm and silkworm having anitmicrobial induced an immune response by using the same}

본 발명은 누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 누에의 체액성 면역반응으로 생성되는 항균성 단백질 발현을 유도하는 누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에에 관한 것이다.

누에는 한자로 잠(蠶)이라고 하며, 누에나방(Bombyx mori, 문화어: 누에나비)의 애벌레로서, 알깨기 시작후 10 ~ 14일만 알에서 부화한 누에는 1령 누에 또는 개미누에라 하여, 까맣고 털이 많고 약 5 mm 정도로 개미와 비슷한 형태가 특징이며, 3령이 지나야지만 누에 특유의 형태가 나타난다.

누에가 5령이 된지 5~6일째부터 토사구에서 실을 뽑아 고치를 짓게 되는데 고치 상태에서 12~13일이 지나면 나방이 되며, 양잠산업에서는 고치를 이용하여 실크를 생산하고 있다.

동의보감에 나와 있는 천연 자양 강정 식품인 누에 번데기는 한방에서는 잠용자(蠶踊子)라고 부르며, 성질이 고르고 맛이 달며 독이 없어, 풍과 여윈 것을 다스린다고 하였다.

최근 국내의 누에와 관련된 산업 시장은 전통적인 양잠 산업인 누에고치 생산에서 벗어나, 누에를 소재로 하는 기능성 식품과 천연물의약품과 관련된 기술개발이 활발하게 이루어지고 있는데, 동결건조로 제조된 누에분말은 1995년부터 상품화되기 시작하였으며, 5령3일 누에의 알콜 추출물을 생강, 계피, 타우린과 함께 혼합한 기능성 항당뇨 음료(한국등록특허 제10-0354151호), 누에 번데기 유래의 지방산을 유효성분으로 하는 고지혈증 예방 및 치료 조성물(한국등록특허 제10-0732727호), 누에 체액 추출물을 이용한 건강기능식품(한국공개특허 제2010-0020463호) 등이 대표적으로 개발되어 있으며, 혈당조절제, 면역증강, 항피로 등 효능으로 누에분말을 주성분으로 한 건강기능식품이 다수 출시되었다.

그러나, 누에 자체를 분말화하여 사용하거나 누에를 추출하여 식품 또는 약품의 소재로 사용되어져 왔을뿐, 누에를 동물에 발생하는 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 소재로 활용하기 위해 누에의 면역을 유도하는 방법에 대한 연구는 이루어진 바가 없다.

본 발명의 목적은 누에의 체액성 면역반응으로 생성되는 항균성 단백질 발현을 유도하는 누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에를 제공하기 위한 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 누에 면역반응 유도용 조성물은 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 유효성분을 포함하여 누에의 체액성 면역반응으로 생성되는 항균성 단백질 발현을 유도하는 것이 특징이다.

상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물은 상기 조성물 전체 1ml당 0.5~5 mg을 포함하는 것이 특징이다.

상기 유산균은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum)인 것이 특징이다.

상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물은 세포막 성분인 펩티도글리칸(Peptidoglycan) 및 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)이 포함된 것이 특징이다.

상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물은 초음파 분해로 상기 유산균의 세포를 파쇄 한 후, 부탄올로 단백질을 제거하여 얻은 것이 특징이다.

본 발명의 누에 면역반응 유도용 조성물의 제조방법은 유산균을 배양하는 제1단계; 상기 배양된 유산균을 원심분리한 후 상등액을 제거하여 균체를 획득한 다음, 버퍼를 넣어 유산균현탁액을 제조하는 제2단계; 상기 유산균 현탁액을 초음파 분해로 인해 유산균의 세포를 파쇄하여 유산균 세포파쇄물을 제조하는 제3단계; 상기 유산균 세포파쇄물에 부탄올을 첨가하여 추출한 다음 원심분리한 후, 상등액을 제거하여 단백질이 제거된 하등액을 얻는 제4단계; 상기 하등액은 1차 동결건조하여 동결건조물을 제조하는 제5단계; 상기 동결건조물을 물로 녹인 후, 이를 투석한 다음 2차 동결건조하여 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 제조하는 제 6단계 및, 상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 포함하는 누에 면역반응 유도용 조성물을 제조하는 제7단계;를 포함하는 것이 특징이다.

본 발명의 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에의 제조방법은 상기의 누에 면역반응 유도용 조성물을 준비하는 단계; 및, 상기 준비한 누에 면역반응 유도용 조성물을 누에 유충의 체강에 주입하는 단계;를 포함하는 것이 특징이다.

상기 누에 유충은 5령 5일인 것이 특징이다.

상기 준비한 누에 면역반응 유도용 조성물은 상기 누에 1충당 50~60㎕를 배면을 통한 체강에 주입하는 것이 특징이다.

본 발명의 항균활성이 부가된 누에는 상기의 항균활성이 부가된 누에의 제조방법에 의해 면역이 유도되어 제조되는 것이 특징이다.

상기 항균활성은 가금 장내 주요 병원균인 살모넬라균(Salmonella Enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균활성인 것이 특징이다.

본 발명의 항균활성이 부가된 누에의 사용방법은 상기 항균활성이 부가된 누에를 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 천연항생제 또는 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 사료첨가제로 사용되는 것이 특징이다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의해, 누에의 체액성 면역반응으로 생성되는 항균성 단백질 발현을 유도하는 누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에가 제공됨에 따라 동물 성장촉진용 천연항생제 및 세균성 질환 예방 사료첨가제의 개발이 가능하게 된다.

도 1은 본 발명의 누에 면역반응 유도용 조성물의 유효성분인 유산균 파쇄액 추출물 제조방법도를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예1에서 제조된 면역유도용 주사제 접종을 통한 면역유도 누에 대량 생산 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 임의로 선별된 면역유도 누에 체액의 대장균에 대한 항균활성 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 후보 면역유도제의 주사 접종(대조구, 실시예1, 비교예)에 따른 누에 면역유도 효율을 분석하기 위해 대장균을 대상으로 누에 체액성 단백질에 대한 항균활성결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예1의 면역유도용 주사제(유산균 파쇄액 추출물)의 주사농도 및 면역유도 시간에 따른 누에 면역유도 효율을 분석하기 위해 대장균을 대상으로 누에 체액성 단백질에 대한 항균활성결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 2의 면역유도 누에 분말 추출물의 살모넬라균(Salmonella Enteritidis)에 대한 항균활성결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 2의 면역유도 누에 분말 추출물의 병원성 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균활성결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.

본 발명은 천연항생제로써 인체 및 동물에 발생하는 세균성 질환을 예방하거나 동물 성장촉진용 천연항생제 개발을 위한 목적으로, 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 유효성분을 포함하여 누에의 체액성 면역반응으로 생성되는 항균성 단백질 발현을 유도하는 누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도되어 항균활성이 부가된 누에를 제공한다.

설명하면, 항균성이 부가된 누에 생산을 위해서 면역유도 후보물질로 유산균, 유산균 세포벽 및 유산균 파쇄액 추출물을 제조하여 다양한 농도로 누에 체강에 주사하여 면역유도 시간에 따른 항균활성을 검정한 결과 유산균 파쇄액 추출물 주사 접종에서 가장 우수한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

이에 본 발명의 발명자들은 상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 포함하는 누에 면역반응 유도용 조성물을 개발하게 된 것이며, 이들 조성물을 누에에 주입하면 누에의 체액성 면역반응으로 생성되는 항균성 단백질 발현을 유도함으로써 항균활성이 부가된 누에가 생산된다.

이하, 상기의 누에 면역반응 유도용 조성물의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. 제1단계; 유산균 배양

먼저 유산균을 배양한다.

상기 유산균으로는 일명 젖산균이라고 불리우는 것으로서, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 모든 유산균은 사용이 가능하나, 바람직하게는 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum)를 사용한다.

2. 제2단계; 유산균 현탁액 제조

상기 배양된 유산균을 원심분리한 후 상등액을 제거하여 균체를 획득한 다음, 버퍼를 넣어 유산균현탁액을 제조한다.

이때, 상기 배양된 유산균의 세포막 성분을 최소화 하기위해 8,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하는 것이 좋다,

또한, 상기 버퍼로는 유산균현탁액의 당화율을 높이기 위해 pH가 4.7인 버퍼 0.1M sodium citrate buffer를 사용하는 것이 좋다.

3. 제3단계; 유산균 세포파쇄물 제조

상기 유산균 현탁액을 초음파 분해로 인해 유산균의 세포를 파쇄하여 유산균 세포파쇄물을 제조한다.

이는, 하기 단백질 제거를 위해 유산균의 세포가 파쇄된 상태여야 하는 것으로서 상기 배양된 유산균의 세포막 성분을 최소화 하면서, 상기 초음파분해(sonication)가 이루어지도록 상기 초음파 분해는 0.5~1시간동안 이루어지는 것이 좋다.

4. 제4단계; 단백질이 제거된 하등액 제조

상기 유산균 세포파쇄물에 부탄올을 첨가하여 추출한 다음 원심분리한 후, 상등액을 제거하여 단백질이 제거된 하등액을 얻는다.

이때, 상기 부탄올은 상기 유산균 세포 파쇄물과 동일한 양을 넣어 추출하는 것이 좋으며, 상기 원심분리 또한 상기 배양된 유산균의 세포막 성분을 최소화 하기위해 8,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하는 것이 좋다.

또한, 단백질 제거율을 높이기 위해 상기 제조된 하등액에 하등액과 동일양의 부탄올을 첨가하여 상기와 같은 추출과정을 1~3회 이상 반복하여 단백질을 제거하기도 한다.

5. 제5 및 6단계; 동결건조후 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물 제조

상기 하등액은 1차 동결건조하여 동결건조물을 제조하는 제5단계를 거친 후, 상기 동결건조물을 물로 녹인 후, 이를 투석한 다음 2차 동결건조하여 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 제조한다.

이때, 상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물에는 세포막 성분인 펩티도글리칸(Peptidoglycan) 및 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)이 포함되어 있다.

6. 누에 면역반응 유도용 조성물 제조

이렇게 제조된 상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물은 누에 면역반응 유도용 조성물의 유효성분으로 포함하도록 하는 것으로서, 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 천연항생제 또는 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 사료첨가제로 사용되는 하기 항균활성을 나타내는 누에를 제조하기 위해 상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물은 상기 조성물 전체 1ml당 0.5~5 mg을 포함하는 것이 적합하다.

이는 0.5mg 미만으로 함유될 경우 본 발명이 목적하는 누에 면역유도능을 나타내기 어려우며, 5mg을 초과하여 함유될 경우에는 누에에 주입시 상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물의 과도한 주입량으로 인해 누에 성장에 오히려 악영향을 미칠 우려가 있게 된다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 본 발명의 면역 반응 유도용 조성물을 이용하여 항균활성이 부가된 누에를 대량생산할 수 있음을 확인하였다.

설명하면, 동결 건조된 유산균 파쇄액 추출물을 1mg/ml 농도로 멸균된 식염수에 녹여 주사액의 형태로 제조된 본 발명의 면역 반응 유도용 조성물을 누에 1충당 50~60㎕씩 5령 5일째 누에 유충의 배면을 통한 체강에 주사하여 면역화함으로서 항균성이 부가된 면역유도 누에를 대량생산이 가능함을 알 수 있다.

이렇게 생성된 본 발명의 항균성이 무가된 누에는 가금 질병 및 위장관 손상을 유발하는 가금 장내 주요 병원균인 살모넬라균(Salmonella Enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)에 탁월한 항균활성을 나타냄을 확인한바, 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 인체에 무해하면서 인체 또는 식물체에 발생하는 세균성 질환 예방 및 치료에 효과적인 약학적 조성물 또는 사료용 조성물로 유용하게 이용가능함이 당업자에게 당연할 것이다.

이때, 상기 약학적 조성물로 사용할 경우에는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 함유될 수도 있는데, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피하 주입 또는 피부를 통한 국소 투여(경피 투여)가 바람직하며, 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

이러한 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 주사제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 항균활성이 부가된 누에를 사료용 조성물로 사용할 경우, 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등의 동물, 바람직하게는 포유류에 대한 사료용 조성물로 사용된다.

이러한 사료용 조성물은 사료 원료에 적절하게 배합하여 사료로 제공되는데, 이때, 사료 원료로서는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다.

특히, 본 발명의 항균활성이 부가된 누에가 함유된 동물용 사료를 동물에게 일상적으로 섭취시킬 경우 병원성 미생물에 대한 감염 등을 예방할 수도 있게 된다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예1 및 비교예> 항균활성이 부가된 면역유도 누에 생산을 위한 주사제 선발 및 제조

누에 체액성 면역반응을 유도하기 위한 주사제로 인체 및 동물에 안전하고 그람양성균과 유사한 세포막 구조를 지닌 유산균(Lactobacillus plantarum)을 배양하여 사용하였다.

즉, 항균성이 강화된 누에 생산을 위해서 면역유도 후보물질로 생균, 유산균 세포벽 및 유산균 파쇄액 추출물을 제조하여 다양한 농도로 누에 체강에 주사한 다음 면역유도 시간에 따른 항균활성 검정을 통하여 면역유도 효율 분석을 실시하였다.

1) 실시예1; 유산균 파쇄액 추출물 제조(도 1에 제시됨)

초음파 분해 및 부탄올 추출을 통하여 세포막 성분인 펩티도글리칸(Peptidoglycan) 및 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)이 포함된 추출물을 제조하였다.

즉, 락토바실러스 MRS 액체 배지에서 배양된 유산균을 4℃에서 8,000rpm으로 10분간 원심분리를 통하여 균체를 획득한 다음, 0.1M sodium citrate buffer(pH 4.7) 50 ml를 넣어 현탁 한 뒤, 초음파분해(sonication)를 1시간 동안 수행하여 세포를 파쇄하였다.

상기 파쇄액에서 단백질을 제거하기 위해서 동일한 부피의 부탄올을 첨가한 후, 실온(24℃)에서 30분간 교반을 통하여 추출한 다음, 8,000rpm에서 30분간 원심분리하여 분획하였다.

상등액을 버리고 하등액만 획득한 다음 동일한 부피의 부탄올을 넣고 위와 같은 추출을 반복하였다.

단백질이 제거된 세포 파쇄물은 -40℃에서 24시간동안 동결 건조하였다.

상기 동결건조물을 멸균된 증류수 10 ml를 넣고 녹인 다음, 이를 투석막에 넣고 3차 증류수에서 60시간동안 투석하였고, 3차 증류수는 12시간 마다 교환하였다.

투석을 마친 샘플은 -40℃에서 24시간동안 동결 건조하여 무게를 측정하였다.

측정된 상기 동결건조물은 15, 10, 5, 1 및 0.5mg/ml 등 다양한 농도로 멸균된 식염수에 녹여 누에 면역유도 시험에 사용하였다.

2) 비교예: 유산균 세포벽 분리

락토바실러스 MRS 액체 배지에서 배양된 유산균을 원심분리를 통하여 균체를 획득한 다음, 동결 건조하였다.

동결 건조된 균체를 10배량의 살균된 증류수에 현탁 한 후 100℃에서 20분간 가열한 다음 1,500g에서 10분간 원심 분리하여 파괴되지 않은 균을 제거하였고, 상등액을 다시 6,500g에서 30분간 원심 분리하였다.

침전된 세포벽을 수집하여 증류수로 3회 세척한 다음 동결 건조하여 무게를 측정한 후 멸균된 식염수에 일정한 농도로 녹여 누에 면역유도 시험에 사용하였다.

<실시예 2> 항균활성이 부가된 면역유도 누에 대량생산 및 건조분말 제조

면역유도 누에 대량생산을 위하여 동결 건조된 유산균 파쇄액 추출물(실시예1)을 1mg/ml 농도로 멸균된 식염수에 녹여 주사액을 제조하였다.

뽕잎으로 사육된 5령 5일째 누에 유충은 10~15분간 침수시켜 비활성화시킨 다음, 도 2에서 보는바와 같이 자동주사기를 이용하여 주사액 50ul를 배면을 통한 체강 주사로 면역화 하였다.

항균활성이 증가된 면역유도 누에를 대량 생산을 위하여 약 6만 마리 누에를 대상으로 면역유도용 주사액을 접종하였다.

주사 접종한 누에는 뽕잎을 급이 하여 18~24시간 동안 면역유도한 다음 -20℃에서 냉동 보관하였다.

임의로 선별한 면역유도된 누에로부터 체액을 채취하여 상기의 방법으로 체액성 단백질을 분리한 후, 대장균에 대한 항균활성 검정을 통하여 면역유도 유무를 확인하였다(도 3). 냉동 보관된 면역유도 누에는 70℃에서 24시간 동안 열풍 건조한 다음 분말화 하였다. 이후 항균활성 검정에 사용하였다.

<실험예 1> 누에 면역유도용 주사제 선발을 위한 항균활성 검정

1) 실험방법

누에 면역유도 주사제 선발을 위하여 다양한 농도의 유산균(대조구), 유산균 세포벽(비교예) 및 유산균 파쇄액 추출물(실시예1)을 누에 유충 체강에 주사하여 면역유도 한 후 유도 시간별로 누에 체액을 채취하여 항균활성을 검정하였다.

즉, 후보 유도물질이 함유된 50㎕ 수용액을 누에(금옥잠) 5령 5일째 유충 배면을 통하여 체강에 주사 접종한 후 유도 시간별(6시간, 10시간, 22시간)로 각각 유충 10마리로부터 체액을 채취하였다.

체액은 90℃에서 10분간 열처리한 다음 13,000rpm, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리 후 상등액을 분리하여 항균활성 검정에 사용하였다.

항균활성 검정은 방사선 확산 분석법(radial diffusion assay)을 통하여 병원성 대장균(E. coli KACC 1039)에 대한 항균활성을 배지상에서 가시화하여 병원균 생육억제를 나타내는 Inhibition zone의 크기로 비교 분석하였다.

2) 실험결과

상기 실험결과 도 4에 나타나 있듯이, 생균 주사 접종의 경우 대체로 매우 낮은 항균활성을 나타냈었으며, 유산균 세포벽 주사 접종에서는 주사 농도 0.5mg/ml 이상인 경우 높은 치사율을 보였으며 0.5mg/ml 이하 농도에서는 치사율은 감소하였지만 낮은 항균활성을 나타냈었다.

또한, 유산균 파쇄액 추출물 주사 접종시 5~10mg/ml 주사 농도에서 10시간 경과 후 가장 높은 항균활성을 보였다.

따라서 누에 면역유도를 위한 유도물질로 유산균 파쇄액 추출물이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

즉, 항균성이 증가된 누에를 생산하기 위한 누에 면역유도용 주사제로 유산균(Lactobacillus plantarum) 파쇄액 추출물이 적합함을 알 수 있었다.

<실험예 2> 면역유도 누에 대량생산을 위한 유도 조건 구명

1) 실험방법

최적의 누에 면역유도 조건을 수립하기 위해서 누에 면역유도용 주사제로 선정된 유산균 파쇄액 추출물(실시예1)의 주사농도 및 유도시간에 따른 면역유도 효율을 대장균에 대한 항균활성 분석을 통하여 검정하였다.

즉, 누에 면역유도 주사제(유산균 파쇄액 추출물)를 10, 5, 1 및 0.5mg/ml 농도로 멸균된 식염수에 녹여 주사액을 제조한 다음, 각 농도별 주사액 50㎕을 누에(금옥잠) 5령 5일째 유충 배면을 통하여 체강에 주사 접종하였으며 면역유도 후 6, 10, 18 및 22시간 경과에 따라 각각 유충 10마리로부터 체액을 채취하여 대장균에 대한 항균활성 검정에 사용하였다.

채취된 체액은 90℃에서 10분간 열처리한 다음 13,000rpm, 4℃ 조건에서 10분간 원심을 통하여 체액성 단백질을 추출하였으며 이후 항균활성 검정에 사용하였다. 항균활성 검정은 방사선 확산 분석법(radial diffusion assay)을 통하여 병원성 대장균(E. coli KACC 1039)에 대한 항균활성을 배지상에서 가시화하여 병원균 생육억제를 나타내는 Inhibition zone의 크기로 비교 분석하였다. 이상의 실험은 3회 반복하여 수행하였다.

2) 실험결과

도 5에 나타나 있듯이, 5mg/ml 와 1mg/ml 주사농도에서 가장 우수한 항균활성을 보였으면 주사 접종 후 18시간 면역 유도된 시료에서 가장 높은 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

따라서 항균성이 증가된 면역유도 누에 생산을 위해서 면역유도 주사제의 적정 농도는 1mg/ml로 면역유도 시간은 18시간으로 결정하였다.

<실험예 3> 면역유도 누에 분말의 항균활성 검정

1) 실험방법

실시예2에서 제조된 건조된 면역유도 누에 분말에 대한 항균활성 검정은 가금 질병 및 위장관 손상 관련 병원균인 살모넬라균(Salmonella Enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)을 대상으로 실시하였다.

먼저 누에분말로부터 항균성 단백질이 포함된 추출물을 제조하였다.

즉, 누에 분말에 10배 부피의 0.3% 아세트산 용액을 넣어 현탁 한 뒤, 실온에서 1시간 동안 교반을 통하여 추출한 다음 4,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 획득하였다.

상기 분리된 상등액은 90℃에서 10분간 열처리한 다음 13,000rpm, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리하여 항균성 단백질이 포함된 추출물을 획득하였다.

분리된 추출물은 90℃동결건조하여 무게를 측정한 다음 멸균된 0.01% 아세트산 용액에 일정한 농도로 녹여 항균활성 검정에 사용하였다.

살모넬라균(S. Enteritidis) 및 대장균(E. coli)을 LB배지에서 배양하여 얻은 1×10⁵ 세포와 다양한 농도의 누에 분말 추출물을 섞은 후 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음, 배양액을 LB 아가 플레이트에 도말하여 균주를 가시화시켰다.

2) 실험결과

도 6에 나타나 있듯이, 살모넬라균(S. Enteritidis)에 0.01% 아세트산을 처리한 대조구에서는 많은 수의 콜로니를 발견할 수 있었으나 2000ppm 농도의 면역유도 누에 분말 추출물을 첨가한 경우에 균이 조금 자랐으며 4000ppm 농도의 경우에는 균의 성장이 완전히 억제되어 콜로니가 보이지 않음을 확인하였다.

또한, 도 7에 나타나 있듯이, 대장균(E. coli)에 0.01% 아세트산을 처리한 대조구에서는 많은 수의 콜로니를 발견할 수 있었고 2000ppm 농도의 면역유도 누에 분말 추출물을 첨가한 경우에는 균의 성장이 완전히 억제되어 콜로니가 보이지 않음을 확인하였다.

상기의 결과로부터, 본 연구에서 생산된 면역유도 누에 분말은 가금 질병 및 위장관 손상을 유발하는 살모넬라균(S. Enteritidis) 및 대장균(E. coli)에 탁월한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의해, 누에의 체액성 면역반응으로 생성되는 항균성 단백질 발현을 유도하는 누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 제조되어 항균활성이 부가된 누에가 제공됨에 따라 동물 성장촉진용 천연항생제 및 세균성 질환 예방 사료첨가제의 개발이 가능하게 됨을 알 수 있었다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 유효성분을 포함하여 누에의 체액성 면역반응으로 생성되는 항균성 단백질 발현을 유도하는,
누에 면역반응 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물은 상기 조성물 전체 1ml당 0.5~5 mg을 포함하는,
누에 면역반응 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum)인 것이 특징인,
누에 면역반응 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물은 세포막 성분인 펩티도글리칸(Peptidoglycan) 및 리포테이코익산(lipoteichoic acid, LTA)이 포함된 것이 특징인,
누에 면역반응 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물은 초음파 분해로 상기 유산균의 세포를 파쇄 한 후, 부탄올로 단백질을 제거하여 얻은 것이 특징인,
누에 면역반응 유도용 조성물.
유산균을 배양하는 제1단계;
상기 배양된 유산균을 원심분리한 후 상등액을 제거하여 균체를 획득한 다음, 버퍼를 넣어 유산균현탁액을 제조하는 제2단계;
상기 유산균 현탁액을 초음파 분해로 인해 유산균의 세포를 파쇄하여 유산균 세포파쇄물을 제조하는 제3단계;
상기 유산균 세포파쇄물에 부탄올을 첨가하여 추출한 다음 원심분리한 후, 상등액을 제거하여 단백질이 제거된 하등액을 얻는 제4단계;
상기 하등액은 1차 동결건조하여 동결건조물을 제조하는 제5단계;
상기 동결건조물을 물로 녹인 후, 이를 투석한 다음 2차 동결건조하여 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 제조하는 제 6단계 및,
상기 단백질이 제거된 유산균 파쇄액 추출물을 포함하는 누에 면역반응 유도용 조성물을 제조하는 제7단계;를 포함하는,
누에 면역반응 유도용 조성물의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 선택된 어느 한항의 누에 면역반응 유도용 조성물을 준비하는 단계; 및,
상기 준비한 누에 면역반응 유도용 조성물을 누에 유충의 체강에 주입하는 단계;를 포함하는,
항균활성이 부가된 누에의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 누에 유충은 5령 5일인 것이 특징인,
항균활성이 부가된 누에의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 준비한 누에 면역반응 유도용 조성물은 상기 누에 1충당 50~60㎕를 배면을 통한 체강에 주입하는 것이 특징인,
항균활성이 부가된 누에의 제조방법.
제7항의 항균활성이 부가된 누에의 제조방법에 의해 면역이 유도되어 제조된,
항균활성이 부가된 누에.
제10항에 있어서,
상기 항균활성은 가금 장내 주요 병원균인 살모넬라균(Salmonella Enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균활성인 것이 특징인,
항균활성이 부가된 누에.
제10항 또는 제11항의 상기 항균활성이 부가된 누에는 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 천연항생제 또는 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 사료첨가제로 사용되는,
항균활성이 부가된 누에의 사용방법.