CN106232805B - 新型噬菌体以及包含其的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)以及包含该噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)作为有效成分的组合物。此外，本发明涉及通过使用噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)或包含该噬菌体作为有效成分的组合物预防和/或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的方法。

Description

新型噬菌体以及包含其的组合物
技术领域
本发明涉及对沙门氏菌(Salmonella)具有特异性杀伤活性的新型噬菌体、包含其的组合物，以及使用所述新型噬菌体或组合物预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的方法。
背景技术
沙门氏菌是肠杆菌科的革兰氏阴性的普通厌氧菌(兼性厌氧菌)的属，并且是通常具有用于移动的周生鞭毛的无芽孢形成的杆菌。沙门氏菌是一种致病微生物，其不仅感染各种家畜，而且还感染人体以引起各种疾病。
已知，人体内的沙门氏菌病主要是由诸如猪肉等动物产品的摄取引起的。报道称，部分沙门氏菌具有对家禽的特异性并因此引起家禽感染以致于给农家和消费者造成巨大的损害的事例较多，并且已知的是感染家禽的沙门氏菌和这种被感染的家禽的进食导致人体内食物中毒。
具体地，根据美国疾病控制与预防中心(CDC)2005年的统计，在从遭受沙门氏菌引起的食物中毒的人分离出的沙门氏菌中，9种沙门氏菌与从家禽获得的沙门氏菌匹配，并且可以确认的是从遭受食物中毒的人分离出的最主要的沙门氏菌与从鸡分离出的最主要的沙门氏菌相符。
噬菌体是指感染特定细菌并防止和抑制该细菌生长的细菌特异性病毒。由于噬菌体具有比抗生素更强的宿主特异性而且最近出现对抗生素有抗性的细菌的问题和动物体内残留抗生素的问题都变得严重，噬菌体的应用已经引起高度关注。
然而，对噬菌体的大多数研究集中在控制大肠杆菌(Escherichia coli)、李斯特菌(Listeria)和梭菌(Chlorstridium)。沙门氏菌在人体内和动物体内均是传染性的，由此引起的危害并没有减少，并且能够在摄取细菌的吞噬细胞中生长，从而容易对抗生素产生抗性。因此，需要研制出能够有效控制沙门氏菌的噬菌体，并且具体地，需要噬菌体和相关技术的发展，从而控制家禽中沙门氏菌以预防由家禽中沙门氏菌引起的感染性疾病以及从而预防家禽介导的人体内食物中毒。
发明内容
技术问题
作为旨在有效地预防和治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的认真研究的结果，本发明人提供一种对沙门氏菌具有特异性杀伤活性的新型噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)。
此外，为了解决由于抗生素使用而引起的抗性细菌出现和肉类中抗生素残留问题，本发明提供包含噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)作为有效成分的抗生素、饲料用添加剂、用于非人类动物的饮用水用添加剂、饲料、用于非人类动物的饮用水、消毒剂或洗涤剂。
而且，本发明提供不仅用于预防和/或治疗由家禽中沙门氏菌引起的感染性疾病而且用于预防和/或治疗人体内食物中毒的组合物，其包含噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)作为有效成分，以及使用所述组合物预防或治疗疾病的方法。
技术方案
本发明的一个方面提供对沙门氏菌具有特异性杀伤活性的新型噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)。
本发明的另一个方面提供用于预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物，其包含噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)作为有效成分。
本发明的又一个方面提供包含噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)作为有效成分的抗生素、饲料用添加剂、用于非人类动物的饮用水用添加剂、饲料、用于非人类动物的饮用水、消毒剂或洗涤剂。
本发明的又一个方面提供预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的方法，其包括：给非人类动物施用噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)或包含噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)作为有效成分的组合物。
有益效果
根据本发明的噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)具有对沙门氏菌具有特异性杀伤活性的效果。
此外，根据本发明的噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)具有优异的耐酸性、耐热性和耐干燥性，因此具有不仅能够被用作在各种范围的温度、pH和干燥条件下预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的物质，而且能够被用作包含噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)作为有效成分的抗生素、饲料用添加剂、用于非人类动物的饮用水用添加剂、饲料、用于非人类动物的饮用水、消毒剂、洗涤剂等的效果。
而且，本发明提供噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)或包含噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)作为有效成分的抗生素，其由于与以往的抗生素相比对沙门氏菌的特异性较高，因此具有能够选择性地杀死特定致病细菌而不杀死有益细菌的效果，并且由于不引发耐药性，因此具有与以往的抗生素相比产品的有效期延长的效果。
而且，本发明具有能够通过给家禽施用噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)或包含噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)作为有效成分的组合物来预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的效果。
附图说明
图1是新型噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)(在下文中被称为“ΦCJ26”)的电子显微镜图像。
图2示出了新型噬菌体ΦCJ26的脉冲场凝胶电泳(PFGE)的结果。
图3示出了新型噬菌体ΦCJ26的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果。
图4是描绘新型噬菌体ΦCJ26的耐酸性实验的结果的图。
图5是描绘新型噬菌体ΦCJ26的耐热性实验的结果的图。
图6是描绘新型噬菌体ΦCJ26的耐干燥性实验的结果的图。
具体实施方式
在下文中，更详细地描述本发明的实施方式。在本文中将忽略本领域普通技术人员充分了解且能够推导出的细节描述。
本发明的一个实施方式提供对沙门氏菌亚种(ssp.)具有特异性杀伤活性的新型噬菌体ΦCJ26(KCCM11464P)(在下文中被称为“ΦCJ26”)。
沙门氏菌是一种致病微生物，其感染各种家畜并引起各种疾病，而且特别地当摄取了被沙门氏菌感染的鸡肉时能够在人体内引起食物中毒，因而在韩国引起食品介导(食源性)疾病的众多病原体中其被称为引起食物中毒的最频繁的病原性细菌。
目前，有报道称，沙门氏菌包含超过2500种血清型，大致分为对不同动物具有宿主特异性的菌株和不具有宿主特异性的菌株，并且在各种动物体中被发现作为寄生细菌。
根据血清学分类，沙门氏菌的例子可以包括但不限于，山夫登堡沙门氏菌(Salmonella senftenberg)、德尔卑沙门氏菌(Salmonella derby)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、甲型或丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A orC)、薛氏沙门氏菌(Salmonella schottmulleri)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、蒙得维的亚沙门氏菌(Salmonella montevideo)、纽波特沙门氏菌(Salmonella newport)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarum)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)、姆班达卡沙门氏菌(Salmonella mbandaka)、Salmonella abortusovi、马流产沙门氏菌(Salmonellaabortusequi)、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)、索菲亚沙门氏菌(Salmonellasofia)、汤姆森沙门氏菌(Salmonella Thomson)、哈瓦那沙门氏菌(Salmonella havana)、病牛沙门氏菌(Salmonella bovismorbificans)、肯塔基沙门氏菌(Salmonellakentucky)、婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)、海德沙门氏菌(Salmonella hadar)、亚利桑那沙门氏菌(Salmonella arizonae)和鸭沙门氏菌(Salmonella anatum)。
具体而言，根据本发明的一个实施方式的沙门氏菌可以是从家禽获得的沙门氏菌的菌株，并且沙门氏菌的菌株的实例可以是选自由如下组成的组的至少一种：山夫登堡沙门氏菌(Salmonella senftenberg)、蒙得维的亚沙门氏菌(Salmonella montevideo)、纽波特沙门氏菌(Salmonella newport)、肯塔基沙门氏菌(Salmonella Kentucky)、姆班达卡沙门氏菌(Salmonella mbandaka)、婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)、海德沙门氏菌(Salmonella hader)、德尔卑沙门氏菌(Salmonella derby)、汤姆森沙门氏菌(SalmonellaThomson)和猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)，但不限于此。
在本文中，家禽是家养禽类的总称。家禽不受特别的限制，并且可以是选由如下组成的组的至少一种：鸡、鹅、火鸡等等。具体而言，根据该实施方式的沙门氏菌可以从鸡获得。
根据该实施方式，沙门氏菌在普通培养基上生长良好，并且能够在约7℃至约48℃的温度下生长，其中理想的生长温度范围为约35℃至约37℃。具体而言，致病因子表达在约42℃下有效地进行。此外，沙门氏菌可以在4.5至9.0的pH范围下生长。
噬菌体是能够感染特定细菌并抑制细菌生长的细菌特异的病毒，并且是包含单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)作为遗传物质的病毒。
具体而言，根据本发明的实施方式的噬菌体ΦCJ26是具有如下特征的噬菌体：其具有选择性感染沙门氏菌的物种特异性，并且形态学上属于具有二十面体衣壳和长的非收缩性尾巴的长尾噬菌体家族(参见图1)。对噬菌体ΦCJ26的核苷酸序列与其他噬菌体的解码的核苷酸序列之间的同源性进行比较，并且结果示于表1中。噬菌体ΦCJ26示出在pH4.0至pH 5.5下稳定的耐酸性，而不会失去活性(图4)，并且在耐热性方面，当暴露于60℃2小时的情况下，噬菌体ΦCJ26没有失去活性(图5)。在耐干燥性方面，噬菌体ΦCJ26的效价(titer)在干燥后约减少1个对数(1log)(图6)。噬菌体ΦCJ26的部分DNA核苷酸序列展示于序列表的序列号1-3中。
噬菌体ΦCJ26是由本发明人分离出的一种新型的噬菌体，并且在2013年十月25日存放于韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)(361-221,Hongje 1-dong,Seodaemun-gu,Seoul,Korea))，保藏号为KCCM 11464P。
本发明的另一种实施方式提供用于预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物，其包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分。
由于噬菌体ΦCJ26展现出能够特异性杀伤沙门氏菌的抗菌活性，噬菌体ΦCJ26能够被用于预防或治疗由感染沙门氏菌而引起的疾病。由沙门氏菌引起的感染性疾病的例子包括但不限于沙门氏菌病。
本文中，术语“沙门氏菌病”指的是由于感染沙门氏菌而引起的急性或慢性的消化性传染病，并且其症状包括作为伴随性肺炎、脑炎、关节炎、流产、发热、腹泻、发绀等的主要症状的发热、胃肠炎或脓毒症。一些亚种在人和动物二者中均能够引起传染病，例如由于摄入感染了沙门氏菌的家畜的肉而引起的食物中毒。
本文中，术语“预防”指的是通过给受试者施用噬菌体ΦCJ26和/或包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的组合物抑制相应疾病或者延缓相应疾病发生的所有措施。
本文中，术语“治疗”指的是通过给受试者施用噬菌体ΦCJ26和/或包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的组合物改善或减轻感染性疾病的症状的所有措施。
根据该实施方式的用于预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物可以包含以5×102pfu/ml至5×1012pfu/ml、具体而言1×106pfu/ml至1×1010pfu/ml用量的噬菌体ΦCJ26。
根据该实施方式的用于预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物还可以包含药学上可接受的载体，并且可以与载体一起配制以提供食品、药物、饲料用添加剂或用于非人类动物的饮用水用添加剂等。
本文中，术语“药学上可接受的载体”指的是不刺激生物体并且不抑制所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。
适用于该实施方式的载体的类型不受特别限制，并且可以使用本领域中常用的且药学上可接受的任何载体。载体的例子可以包括，但不限于，盐水、蒸馏水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇等，但不限于此。这些可以单独使用或通过组合至少两种而使用。
此外，根据需要，可以向根据本发明的组合物中添加其他常见添加剂，例如抗氧化剂、缓冲溶液和/或细胞抑制剂，并且还可以向根据本发明的组合物中添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂，来配制诸如水溶液、悬浮液和乳液等可注射的制剂、丸剂、胶囊、颗粒或片剂等。
施用根据该实施方式的用于预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物的方法不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何方法。施用方法的一个例子可以包括组合物的口服施用或非肠道施用。
用于口服施用的剂型的例子可以包括锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、片剂、水溶性悬浮液、油性悬浮液、配制粉末、颗粒、乳液、硬胶囊、软胶囊、糖浆或酏剂，但不限于此。
为了将根据该实施方式的组合物配制成诸如片剂或胶囊的剂型，还可以包含粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素和明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉和甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠和聚乙二醇蜡；并且对于胶囊剂型来说，除了上述物质外，还可以进一步包含液体载体，例如脂肪油。
非肠道施用该实施方式的组合物的方法可以包括，例如静脉注射、腹膜内施用、肌肉施用、皮下施用和局部施用，以及涂敷或喷雾根据本发明的组合物到受感染区域的方法，但不限于此。
为了配制非肠道施用剂型，例如可以将该实施方式的组合物配制成用于注射的剂型，例如皮下注射、静脉注射和肌肉注射；栓剂；或者用于喷雾的剂型，例如气雾剂，从而允许通过吸入器吸入，但不限于此。为了配制用于注射的剂型，可以在水中将该实施方式的组合物与缓冲试剂或稳定剂混合，以制备溶液或悬浮液，其被配制成用于单位施用的剂型，例如安瓿或小瓶。当组合物被配制成用于喷雾的剂型(诸如气雾剂)时，组合物可以与推进剂等一起与添加剂配制，以使分散于水中的浓缩物或者润湿粉末分散于其中。
除了配制组合物的方法、施用方法、施用时间和/或施用途径外，根据不同的因素，例如施用对象动物的性别、年龄、体重、疾病症状的程度、所摄入的食物、排泄速率等，改变涂敷、喷雾或施用根据该实施方式的用于预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物的适当用量。而且，本领域普通技术人员能够容易地确定和指定对所预期的治疗有效的剂量。
本发明的又一实施方式提供包含噬菌体ΦCJ26A作为有效成分的抗生素。
本文中，术语“抗生素”指的是以药物形式施用于包括人在内的对象并展现出杀死细菌的效果的制剂，而且其被用作防腐剂、杀菌剂和抑菌剂的总称。
为了预防或治疗沙门氏菌，已经积极地进行了许多与疫苗和抗感染免疫相关的研究，然而目前所报道的超过2500种沙门氏菌血清型没有特定的宿主区域，因此至少一种动物会被这类血清型感染或侵染，实际上几乎不能够根除沙门氏菌。
此外，沙门氏菌能够在吞噬细菌的噬菌细胞中生产，因而无法用抗生素完全治疗，并且即使采用抗生素而防止感染使得不具有沙门氏菌，当抗生素施用停止时表现出增加的被沙门氏菌再感染的敏感性，并因此需要开发沙门氏菌特异性抗生素。
该实施方式的包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的抗生素所具有的效果是：该抗生素与以往的抗生素相比对沙门氏菌具有较高的特异性，因此杀死特定的致病细菌，但不杀死有益细菌；并且该抗生素不引发耐药性，这使得与以往的抗生素相比产品的有效期延长。
本发明的又一个实施方式提供饲料用或用于非人类动物的饮用水用添加剂，其包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分。
饲料用添加剂或用于非人类动物的饮用水用添加剂可以通过如下来使用：使用噬菌体ΦCJ26或包含其的组合物单独制备饲料用添加剂或用于非人类动物的饮用水用添加剂，并将饲料或用于非人类动物的饮用水与添加剂混合，或者在制备饲料或用于非人类动物的饮用水的过程中直接添加噬菌体ΦCJ26或包含其的组合物。
以根据该实施方式的饲料用或用于非人类动物的饮用水用的添加剂的形式使用的噬菌体ΦCJ26或包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的组合物可以是液体形式或干燥形式，例如干燥粉末形式，但不限于此。
基于饲料用添加剂的重量，根据本发明的噬菌体ΦCJ26以0.05重量％(wt％)至10wt％、具体地0.1wt％至2wt％的量混合于粉末形式中。
用于干燥根据该实施方式的饲料用添加剂或用于非人类动物的饮用水用添加剂以得到干燥粉末的方法不受特别限制，并且可以采用相关领域中常用的任何方法。干燥方法的例子可以包括通风干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥，但不限于此。这些方法可以单独使用或者以至少两种的组合使用。
根据该实施方式的饲料用添加剂或用于非人类动物的饮用水用添加剂还可以包含其他非致病性微生物。微生物可以选自由如下组成的组：芽孢杆菌，例如能够产生蛋白酶、脂肪酶和/或糖基转移酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；乳酸菌，例如乳杆菌属，其具有生理活性和在厌氧条件(例如牛的胃)下具有分解有机物质的能力；丝状菌，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)，其具有增加动物体重、增加牛奶产量以及增加饲料的消化吸收率的效果；以及酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。这些微生物可以单独使用或以至少两种的组合使用。
根据需要，包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的根据该实施方式的饲料用添加剂或用于非人类动物的饮用水用添加剂可以进一步包含其他添加剂。
可用的添加剂的例子可以包括用于防止饲料或用于非人类动物的饮用水质量恶化的粘合剂、乳化剂和防腐剂；为了增加饲料或用于非人类动物的饮用水的效用所添加的氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白含氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、萃取剂或寡糖；以及饲料混合剂，但不限于此。这些添加剂可以单独使用或以至少两种的组合使用。
基于100重量份的饲料，根据本发明的饲料用添加剂的含量可以为0.05重量份至10重量份，具体地0.1重量份至2重量份。基于100重量份的用于非人类动物的饮用水，根据本发明的用于非人类动物的饮用水用添加剂的含量可以为0.0001重量份至0.01重量份，具体为0.001重量份至0.005重量份。在这些范围内，添加剂允许噬菌体ΦCJ26对抗沙门氏菌的活性被充分显示出。
本发明的又一个实施方式提供通过向饲料或用于非人类动物的饮用水添加包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的饲料用添加剂或用于非人类动物的饮用水用添加剂或者向其中直接添加噬菌体ΦCJ26制备得到的饲料或用于非人类动物的饮用水。
在该实施方式中使用的饲料不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何饲料。饲料的例子可以包括植物饲料，如谷物、根类蔬菜、食品加工副产物、藻类、纤维、医药副产物、油脂、淀粉、谷物的副产物或残余物等；和动物饲料，如蛋白质、无机物质、油脂、矿物质、单细胞蛋白和动物浮游生物或食品，但不限于此。这些饲料可以单独或以至少两种的组合使用。
在该实施方式中使用的用于非人类动物的饮用水不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何用于非人类动物的饮用水。
此外，根据该实施方式的饲料可以通过混合添加到用于非人类动物的饮用水中，并且所得到的用于非人类动物的饮用水可以持续地降低肠道沙门氏菌的数目，这可以给出一种生产不含沙门氏菌的家畜的方案。
本发明的又一个实施方式提供包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的消毒剂或洗涤剂。消毒剂或洗涤剂的剂型不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何剂型。
为了去除沙门氏菌，可以将消毒剂喷洒于动物的住处、屠宰场，死亡区域、厨房和烹饪设备，但不限于此。
洗涤剂可以被用于洗涤暴露于或有可能暴露于沙门氏菌的家禽的身体部位或真皮的表面上，但不限于此。
本发明的又一个实施方式提供使用噬菌体ΦCJ26或包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的组合物预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的方法。
具体而言，该实施方式的预防方法或治疗方法包括向被沙门氏菌感染或容易被感染的家禽施用药学有效量的噬菌体ΦCJ26或包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的组合物。噬菌体ΦCJ26或包含其的组合物的每天的合适总用量可以由兽医在适当的医学判断范围内确定，这对于本领域技术人员来说是明显的。
给家禽的噬菌体ΦCJ26或包括噬菌体ΦCJ26作为有效成分的组合物的具体的药学有效量可以通过考虑如下内容来确定：要实现的反应的种类和程度，相应个体的饮食、性别、一般健康状况、体重、年龄、噬菌体ΦCJ26或包括其的组合物的施用途径和施用时间、以及组合物的分泌速率、治疗时期等，并且可以根据包括同时使用或者不同时使用的各药物成分在内的多种因素和药物领域中公知的相似因素，来改变上述具体的药学有效量。
噬菌体ΦCJ26或包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的组合物可以以药物制剂的形式通过鼻内喷雾施用给禽类或者直接添加到禽类饲料或用于非人类动物的饮用水以便被摄食，并且可以以饲料用添加剂或用于非人类动物的饮用水用添加剂的形式与饲料或用于非人类动物的饮用水混合，然后施用。
施用噬菌体ΦCJ26或包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的组合物的途径和方法不受特别限制，并且可以通过任何途径和方法实现施用，只要该施用允许噬菌体ΦCJ26或包含其的组合物到达所期望的组织即可。
即，噬菌体ΦCJ26或包含噬菌体ΦCJ26作为有效成分的组合物可以通过各种口服途径或非肠道途径来施用，并且施用的例子可以包括口服、直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、经皮、鼻内或吸入，但不局限于此。
下文中，将参考一些实例更详细地描述本发明。应当理解的是，这些实例不应以限制本发明的任何方式来解释。
[实施例1]–感染沙门氏菌的噬菌体的分离
<实施例1-1>
噬菌体筛选和单噬菌体分离
将50ml的从位于忠清道(Chungcheong)洪城郡(Hongsung-gun)广川(Gwangcheon)的家禽养殖场周围收集的鸡粪便获得的试样在4000rpm下进行离心分离10分钟，并且将所获得的上清液通过0.45μm过滤器过滤，以制备试样液，其被用于进行软琼脂覆盖法(softagar overlay method)。软琼脂覆盖法是指使用在顶层琼脂(使用0.7％琼脂粘在固体培养基上)上生长的宿主细胞观察噬菌体裂解的方法。
具体而言，将150μl的从建国大学(Konkuk University)兽医学院获得的山夫登堡沙门氏菌(SS)的振荡培养液(OD600＝2)和2ml的10×LB培养基(10g/l的色氨酸；5g/l的酵母提取物；10g/l的NaCl)与18ml的经过滤的试样液混合，然后在37℃下培养18小时，并将所获得的培养液在4000rpm下进行离心分离10分钟，并且将所获得的上清液通过0.45μm过滤器过滤。随后，使由3ml的0.7％(w/v)琼脂和150μl的SS的振荡培养液(OD600＝2)组成的混合溶液倒在在LB培养基板上并固化，向其逐滴添加10μl的试样液，然后在37℃下培养18小时，从而确认形成噬斑。
由于已知每个噬斑均存在一种噬菌体，发明人试图从所形成的噬斑分离单一的噬菌体。具体而言，将噬斑放入400μl的SM溶液(5.8g/l的NaCl；2g/l的MgSO47H2O；50ml的1MTris-HCl(pH 7.5))，并在室温下放置4小时，从而获得噬菌体溶液。
接下来，将100μl的噬菌体溶液与12ml的0.7％(w/v)琼脂和500μl的SS的振荡培养液(OD600＝2)混合，对其进行使用150mm直径的LB培养基板的软琼脂覆盖法，其中进行培养直至噬菌体完全裂解。培养完成后，向LB培养基板添加15ml的SM溶液，并在室温下放置4小时，从而获得噬菌体溶液。
向该溶液添加1％(v/v)氯仿，并混合10分钟，然后在4000rpm下进行离心分离10分钟，从而获得上清液，该上清液通过0.45μm过滤器过滤以获得最终试样。
<实施例1-2>
噬菌体的大规模培养和纯化
使用山夫登堡沙门氏菌(SS)大量培养在实施例1-1中获得的噬菌体，然后从中纯化噬菌体。
具体而言，振荡培养SS，并以1.5×1010cfu接种，然后在4000rpm下进行离心分离10分钟，并在4ml的SM溶液中重新悬浮。以1.5×108pfu向其中接种噬菌体，感染复数(MOI)为0.0001，然后在室温下放置20分钟。
接下来，接种在150ml的LB培养基中，并在37℃培养6小时。培养完成后，以最终体积的1％的体积(v/v)添加氯仿，接着搅拌20分钟，向其中以1μg/ml的最终浓度分别添加作为限制酶的DNase I的RNase A，并在30℃下放置30分钟。随后，分别以1M和10％(w/v)的最终浓度添加氯化钠和聚乙二醇，并在4℃下放置3小时，然后在4℃下以12000rpm进行离心分离20分钟，从而获得沉淀物。
将获得的沉淀物悬浮在5ml的SM溶液中，然后在室温下放置20分钟，向其中添加4ml的氯仿并搅拌，然后采用4000rpm在4℃下进行离心分离20分钟，从而获得上清液。将该上清液通过0.45μm过滤器过滤，然后使用甘油密度梯度法(密度：40％，5％甘油)进行超离心分离(35000rpm，1小时，4℃)，从而纯化噬菌体。
本发明人从养殖场的鸡粪收集得到的样品分离出对沙门氏菌具有特异性杀伤活性的噬菌体，其被命名为“噬菌体ΦCJ26”并于2013年10月25日存放于韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)(361-221,Hongje 1-dong,Seodaemun-gu,Seoul,Korea))，保藏号为KCCM 11464P。
<实施例2>
ΦCJ26的形态观察
将实施例1中所纯化的噬菌体ΦCJ26稀释于0.01％明胶溶液中，然后用2.5％戊二醛溶液固定。将所获得的噬菌体逐滴添加碳包覆的云母板(大约2.5mm×2.5mm)上，驯化10分钟，然后用蒸馏水洗涤。
随后，将碳膜安装到铜网上，用4％乙酸铀酰染色60秒并干燥后，在透射电子显微镜(JEM-1011，80kV，放大倍率为200000)下检查(图1)。
图1是噬菌体ΦCJ26的透射电子显微镜图像，其中噬菌体ΦCJ26具有二十面体衣壳并带有长的非收缩尾的的形态特征，这表明噬菌体属于形态型长尾噬菌体科。
<实施例3>
ΦCJ26的总基因组DNA尺寸分析
从实施例1中纯化的噬菌体ΦCJ26中提取基因组DNA。
具体而言，向经纯化的噬菌体ΦCJ26的培养液中，添加20mM乙二胺四乙酸(EDTA)、50μg/ml蛋白酶K和0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，并在50℃下放置一个小，并向其中添加等量的苯酚(pH 8.0)且搅拌，随后在室温和12000rpm下进行离心分离10分钟，从而获得上清液。
将上清液与等量的PC(苯酚:氯仿＝1:1)混合，随后在室温和12000rpm下进行离心分离10分钟，从而获得上清液。将上清液与等量氯仿混合，随后在室温和12000rpm下进行离心分离10分钟，从而获得上清液。将上清液与基于总体积的10％(v/v)的量的3M乙酸钠混合，随后添加2体积的95％冷乙醇并混合后，在-20℃下维持1小时。
随后，在0℃和12000rpm下将所获得的物质进行离心分离10分钟，从中去除上清液以获得沉淀物，将沉淀物溶解于50μl的TE缓冲溶液(Tris-EDTA,pH8.0)中。将提取的DNA稀释10倍，然后通过在OD260下测量吸光度来确定DNA的浓度。
接下来，将1μg的DNA加样到1％PFGE(脉冲场凝胶电泳)琼脂糖凝胶上，并在室温下使用BIORAD PFGE系统7号程序(尺寸范围从25kb到100kb；转换时间斜坡(switch timeramp)0.4秒至2.0秒，直线型；正向电压，180V；反向电压，120V)20个小时(图2)。
图2是噬菌体ΦCJ26的基因组DNA的电泳凝胶照片，并且可以看出，噬菌体ΦCJ26的基因组DNA尺寸为约90kbp。
<实施例4>
ΦCJ26的蛋白质图谱分析
将15μl的经纯化的噬菌体ΦCJ26溶液(1011pfu/ml效价)与3μl的5×SDS样品溶液混合，然后煮沸5分钟，以进行12％SDS-PAGE(图3)。
图3是在噬菌体ΦCJ26上进行的SDS-PAGE结果的电泳照片，并且可以看出主要蛋白质具有约12.1kDa、约16.4kDa、约44kDa和约54kDa的尺寸。
<实施例5>
ΦCJ26的遗传特性分析
为了确定实施例1中所纯化的噬菌体ΦCJ26的遗传特性，使用FLX TitaniumSequencer(Roche)作为基因分析仪来分析噬菌体ΦCJ26的DNA。使用Macrogen Inc.株式会社的GS和de novo汇编软件(Roche)重组基因。使用GeneMark.hmm,Glimmer v3.02和FGENESB确认了开放阅读框。使用BLASTP和InterProScan程序对开放阅读框进行命名。
噬菌体ΦCJ26的核苷酸序列显示出与之前报道的噬菌体(沙门氏菌属噬菌体SPT-1，埃希氏菌属噬菌体EC6，葡萄球菌属噬菌体SA1)的多种核苷酸序列相似性，但可以看出没发现其中所有片段100％一致的噬菌体。因此，可以看出，该噬菌体是新分离的噬菌体。
下表1示出了噬菌体ΦCJ26的核苷酸序列与现有技术中报道的3种噬菌体的解码的核苷酸序列之间的比较结果。
表1
使用DNA测序仪分析所制备的噬菌体ΦCJ26的DNA，并且所分析的核苷酸序列的部分结果展示于序列号1-3中。
<实施例6>
基于pH的ΦCJ26的稳定性
为了鉴定噬菌体ΦCJ26是否能够在低pH(如胃部条件)下保持稳定性，在多种pH(pH 3.0，4.0，5.0和5.5)下测定噬菌体ΦCJ26的稳定性。
以0.2M的浓度制备多种pH溶液(乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0，pH 4.5，pH 5.0，pH5.5)和柠檬酸钠缓冲溶液(pH 3.0))。
将180μl的每个pH溶液与20μl的具有108PFU/ml效价的噬菌体溶液混合，直到每个pH溶液具有0.2M的浓度，然后将所获得的溶液在室温下放置2小时。对于对照组，通过相同的方法将20μl的具有108PFU/ml效价的噬菌体溶液与180μl的SM溶液混合，然后将所获得的溶液在室温下放置2小时。此后，对溶液进行分步骤稀释，并且通过软琼脂覆盖方法，在37℃下培养在每个稀释步骤中的10μl的每种溶液18小时，从而基于噬菌体是否裂解来确定噬菌体效价(图4)。
图4示出了噬菌体ΦCJ26的耐酸性的实验结果。在图4中，可以看出噬菌体ΦCJ26与对照组相比没有失去其活性，并且在pH 4至pH 5.5下保持稳定。
<实施例7>
基于温度的噬菌体ΦCJ26的稳定性
如果在噬菌体的众多剂型中，噬菌体被配制成饲料用添加剂，在配制过程中会产生热量，因而为了确定噬菌体的热稳定性而进行如下实验。
具体而言，将200μl的具有108PFU/ml效价的噬菌体ΦCJ26溶液在60℃下分别放置10分钟、30分钟、60分钟和120分钟。此后，对获得的实验培养液进行分步骤的稀释，利用软琼脂覆盖方法，在37℃下培养在每个稀释步骤中的10μl的每种溶液18小时，从而基于噬菌体是否裂解来确定噬菌体效价(图5)。
图5示出了噬菌体ΦCJ26的耐热性的实验结果。如在图5中所示，可以看出噬菌体ΦCJ26暴露在60℃时没有表现出活性下降，直到120分钟。
<实施例8>
干燥稳定性
如果在噬菌体的众多剂型中，噬菌体被配制成饲料用添加剂，在配制过程中噬菌体会被干燥，因而为了确定噬菌体对干燥条件的稳定性进行如下实验。
基于耐热性实验的结果，使用真空浓缩机(SpeedVac浓缩机)进行干燥实验。在60℃的真空下将200μl的具有108PFU/ml的效价的噬菌体ΦCJ26溶液干燥2小时，并且将所获得的颗粒引入到200μl的SM溶液中，随后在4℃完全重新悬浮一天，从而测量效价(图6)。
如图6中所示，可以看出，在干燥后，比较相对于初始效价的稳定性，当噬菌体ΦCJ26在60℃下干燥2小时时，噬菌体ΦCJ26示出了约1个对数的活性下降。
<实施例9>
对沙门氏菌的野生型分离菌株的噬菌体ΦCJ26的感染范围检查
除了本实验中所使用的山夫登堡沙门氏菌(SS)之外，确认噬菌体ΦCJ26是否对从建国大学兽医学院经营的养殖场分离得到的9株野生型山夫登堡沙门氏菌、14株蒙得维的亚沙门氏菌、12株纽波特沙门氏菌、10株肯塔基沙门氏菌、13株姆班达卡沙门氏菌、11株婴儿沙门氏菌、4株海德沙门氏菌、5株德尔卑沙门氏菌、4株猪霍乱沙门氏菌和13株汤姆森沙门氏菌具有裂解活性。
具体而言，将150μl的每个菌株的振荡培养液(OD600＝2)混合，并利用软琼脂覆盖方法，向其滴加10μl的具有109pfu/ml效价的噬菌体ΦCJ26溶液后，在37℃下进行18小时的培养，然后观察噬斑形成与否(表2和3)。
结果示于表2和3中。
表2
表3
如表2和3中所示，噬菌体ΦCJ26可以感染山夫登堡沙门氏菌、蒙得维的亚沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、姆班达卡沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、海德沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、猪霍乱沙门氏、汤姆森沙门氏菌等，这些是在一般的家禽养殖场中由沙门氏菌引起的感染性疾病的主要病原性细菌。
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Claims (12)

1.一种保藏号为KCCM11464P的噬菌体ΦCJ26，所述保藏号为KCCM11464P的噬菌体ΦCJ26对沙门氏菌具有特异性杀伤活性。
2.一种用于预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物，其包含根据权利要求1所述的保藏号为KCCM11464P的噬菌体ΦCJ26作为有效成分。
3.根据权利要求2所述的用于预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物，其中所述感染性疾病是食物中毒。
4.一种抗生素，其包含根据权利要求1所述的保藏号为KCCM11464P的噬菌体ΦCJ26作为有效成分。
5.一种饲料用添加剂，其包含根据权利要求1所述的保藏号为KCCM11464P的噬菌体ΦCJ26作为有效成分。
6.一种饲料，其包含根据权利要求5所述的饲料用添加剂。
7.一种用于非人类动物的饮用水用添加剂，其包含根据权利要求1所述的保藏号为KCCM11464P的噬菌体ΦCJ26作为有效成分。
8.一种用于非人类动物的饮用水，其包含根据权利要求7所述的用于非人类动物的饮用水用添加剂。
9.一种消毒剂，其包含根据权利要求1所述的保藏号为KCCM11464P的噬菌体ΦCJ26作为有效成分。
10.一种洗涤剂，其包含根据权利要求1所述的保藏号为KCCM11464P的噬菌体ΦCJ26作为有效成分。
11.根据权利要求1所述的保藏号为KCCM11464P的噬菌体ΦCJ26或根据权利要求2所述的组合物在制备用于预防或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述噬菌体ΦCJ26或所述组合物施用于家禽。
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