CN104845940B - 沙门氏菌噬菌体制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种噬菌体制剂，尤其是一种沙门氏菌噬菌体制剂及其制备方法，属于生物工程领域。一种沙门氏菌噬菌体制剂，该制剂由保藏号为:CCTCC NO：M 2014145的噬菌体以沙门氏菌为宿主菌发酵制得。本发明通过探索沙门氏菌噬菌体STP4‑a的最适液体增殖条件如培养温度、时间、pH、离子浓度、转速、接种量等，确定最优培养条件，并通过逐级放大培养确定噬菌体的最佳制备条件。该制剂可以单独或复配使用，能够特异性地灭活多种沙门氏菌，为目前防控沙门氏菌污染提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品来源。
Description
技术领域
本发明涉及一种噬菌体制剂，尤其是一种沙门氏菌噬菌体制剂及其制备方法，属于生物工程领域。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)为革兰氏阴性直杆菌，是一种重要的人畜共患病原菌。国内外研究表明，由沙门氏菌引起的食源性疾病屡居前位。随着抗生素的大量和长期使用，在食品和环境中，日趋严重的耐药型沙门氏菌已影响人类感染沙门氏菌疾病的治疗，能否研究出新型的生物抑菌剂来替代化学抗生素是目前科研人员面临的一个挑战。噬菌体是一类细菌病毒，烈性噬菌体感染细菌后，能够快速裂解细菌导致宿主菌的死亡。沙门氏菌噬菌体可以特异性感染并裂解沙门氏菌，因而具有杀菌作用。在感染模型中，噬菌体能够特异性杀死沙门氏菌，而在食品中，噬菌体能够作用抗菌剂来控制细菌污染，具有潜在的开发价值。
随着噬菌体应用研究的日益成熟，噬菌体也逐渐走出实验室，迈向人们的生产生活中。现在，市场上已出现商品化的噬菌体产品，如允许作为食品添加剂的ListexTM P100、用于治疗鸡肠道疾病的S1产品等五种商品化产品。由此可见，成熟的噬菌体制备技术是噬菌体广泛使用的先决条件。
目前在实验室条件下，噬菌体常见的增殖方法为液体增殖法和固体增殖法。液体增殖的方法相较于固体增殖更快速、便捷、易于大量制备。EFSA(Hald T.EFSA Panel onBiological Hazards(BIOHAZ).Scientific opinion on the evaluation of the safetyand efficacy of ListexTM P100for the removal of Listeria monocytogenes surfacecontamination of raw fish[Z].European Food Safety Authority 2012:10,2615)在商品化的噬菌体ListexTM P100研究报告中指出，其生产是以非致病性李斯特菌为宿主菌通过发酵过程制备的，经过几步离心即可得到产品。然而，国内外并没有关于噬菌体成熟的发酵制备最优方法的报道。
发明内容
本发明提供一种沙门氏菌噬菌体制剂，其对沙门氏菌具有强裂解作用，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性地灭活多种沙门氏菌，为目前防控沙门氏菌污染提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品来源。
本发明还提供一种所述沙门氏菌噬菌体制剂的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种沙门氏菌噬菌体制剂，该制剂由保藏号为:CCTCC NO：M 2014145的噬菌体以沙门氏菌为宿主菌发酵制得。本发明通过探索沙门氏菌噬菌体STP4-a的最适液体增殖条件如培养温度、时间、pH、离子浓度、转速、接种量等，确定最优培养条件，并通过逐级放大培养确定噬菌体的最佳制备条件。制备的产品可以通过真空冷冻干燥处理，进行有效的保存。
一种所述的沙门氏菌噬菌体制剂的制备方法，保藏号为:CCTCC NO：M 2014145的噬菌体接入培养基中，培养基中沙门氏菌感染复数10～10-5，在培养温度30～40℃下搅拌通气培养4h以上，得到的发酵液经噬菌体与宿主菌的分离，得到噬菌体制剂。
所述的培养基中添加1-30mmol/L CaCl2。
所述的培养基为营养肉汤培养基。
噬菌体与宿主菌通过两种方式择一进行分离：
①将噬菌体与宿主菌的混合液经4000-6000r/min 5-10min离心后，去除菌体沉淀后将上清液经由真空抽气泵抽滤至无菌滤器内过滤，过滤孔径为0.22μm，所获得的滤液即为产品；
②将噬菌体与宿主菌的混合液通过超滤技术分离噬菌体，选择孔径为0.22μm的膜包，去除宿主菌后得到产品。
所述噬菌体的液体增殖条件为转速200r/min、感染复数10-5、营养肉汤培养基中添加10mmol/L CaCl2培养10-12h。
一种所述沙门氏菌噬菌体制剂在抑制和杀灭沙门氏菌方面的应用。该噬菌体用于防止沙门氏菌污染和沙门氏菌过度生长，其中所述的沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和乙型伤寒沙门氏菌。
一种沙门氏菌噬菌体制剂在防治食品污染沙门氏菌方面的应用。
该制剂中涉及的宽裂解谱沙门氏菌噬菌体，保藏号为:CCTCC NO：M 2014145，保藏日期为2014年4月24日，该噬菌体对沙门氏菌有强的裂解作用。在本发明中，该株噬菌体从电镜形态上分析，属于肌尾噬菌体科，将其命名为沙门氏菌噬菌体STP4-a；在40-60℃和pH为4-12的条件下都能够存活；-20℃保存1年后活性稳定；噬菌体保存的保护剂为含20％甘油的培养溶液。
本发明得到了一种噬菌体STP4-a的工厂规模化生产方法。首先，在实验室200mL摇瓶培养条件下优化培养时间、温度、pH值、感染复数、转速等基本增殖条件，并根据添加不同浓度离子对噬菌体吸附能力的影响进一步提高其增殖效价。最终确定最优液体增殖条件为培养温度37℃，转速200r/min、感染复数10-5、营养肉汤培养基中添加10mmol/L CaCl2培养10-12h，并经由5L发酵罐验证得出，STP4-a在最优发酵条件下发酵后效价较对照组多提高了5个数量级，阐明了通过发酵产噬菌体的可行性。也通过设计整个发酵流程使规模化发酵罐产噬菌体这一方法得以实现。
附图说明
图1为噬菌体STP4-a在培养不同时间的效价结果；
图2为噬菌体STP4-a在不同pH下培养不同时间的效价结果；
图3为噬菌体STP4-a在不同离子浓度下培养不同时间的效价结果，其中空白组未添加离子；A：10mmol/L CaCl2；B：20mmol/L CaCl2；C：30mmol/L CaCl2；D:10mmol/L CaCl2+10mmol/L MgCl2；E:20mmol/L CaCl2+20mmol/L MgCl2；F:30mmol/L CaCl2+30mmol/L MgCl2；
图4为噬菌体STP4-a在不同离子浓度下培养不同时间与空白组的效价比，其中：空白组未添加离子；A:10mmol/L CaCl2；B:20mmol/L CaCl2；C:30mmol/L CaCl2；D:10mmol/LCaCl2+10mmol/L MgCl2；E:20mmol/L CaCl2+20mmol/LMgCl2；F:30mmol/L CaCl2+30mmol/LMgCl2；
图5为噬菌体STP4-a在不同转速下培养不同时间的效价结果；
图6为噬菌体STP4-a在不同温度下培养不同时间的效价结果；
图7为噬菌体STP4-a在不同感染复数下培养不同时间的效价结果；
图8为发酵条件优化前后噬菌体STP4-a效价结果；
图9为噬菌体STP4-a发酵制备流程示意图；
图10为噬菌体STP4-a在模拟禽类胃液中生长状况；
图11为噬菌体STP4-a在模拟禽类肠液中生长状况。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
1、菌种
Salmonella typhimurium，购买于美国菌种保藏中心，编号为ATCC14028，以下简称为ST14028；
沙门氏菌噬菌体STP4-a，为本实验室分离菌种，以下简称为噬菌体STP4-a。本噬菌体STP4-a保存于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M 2014145，保藏日期为2014年4月24日，分类学命名：沙门氏菌噬菌体STP4-a(Salmonella bacteriophage STP4-a)。该噬菌体对沙门氏菌有强的裂解作用。
在本发明中，该株噬菌体从电镜形态上分析，属于肌尾噬菌体科，将其命名为沙门氏菌噬菌体STP4-a；在40-60℃和pH为4-12的条件下都能够存活；-20℃保存1年后活性稳定；噬菌体保存的保护剂为含20％甘油的培养溶液。
2、培养基：
营养肉汤培养基(Nutrient Broth，NB)，北京陆桥技术有限责任公司；
营养琼脂培养基(Nutrient Agar，NA)，北京陆桥技术有限责任公司；
3、主要仪器
MLS-3750全自动灭菌锅 日本三洋电子；
SW-CJ-2FD超净工作台苏州安泰空气技术有限公司；
WPG-350隔水式电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；
HZQ-F恒温振荡培养箱哈尔滨东联电子技术开发有限公司；
高速冷冻离心机 SIGMA；
无菌滤器Steritop-GV Millipore；
SHB-IIIA循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；
冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；
pHs-3C型pH计 上海精科实验设备有限公司；
4、主要试剂配制
SM缓冲液：准确称取5.8g NaCl，2g MgSO4·7H2O溶解于800mL双蒸水中，加50mL1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)，加蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min，室温保存。
1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)溶液：准确称取121.1g Tris加蒸馏水至800mL，调节pH至7.5，添加双蒸水至1000mL，121℃高压灭菌15min，室温保存。
5、数据分析方法
试验数据采用SPSS 13.0与Excel 2010进行分析，方差分析采用LSD与Duncan检验方法，P＜0.01为具有极显著差异，P＜0.05为具有显著性差异，P＞0.05为差异不显著。
实施例1：沙门氏菌噬菌体STP4-a最适液体增殖条件优化
(1)沙门氏菌噬菌体STP4-a液体增殖最佳培养时间测定
在200mL NB中分别加入2mL过夜培养的ST14028(菌数109cfu/mL)以及2mL噬菌体STP4-a(效价109pfu/mL)，设置三个平行组，于37℃150r/min振荡培养，每2h取一次样、离心去除菌体沉淀，用双层平板法测其效价，结果见图1。
由图1可见，噬菌体STP4-a培养4h时，其效价已达到109pfu/mL，尤其当培养时间到8h之后，效价已基本稳定于4×109pfu/mL，经方差分析得出，噬菌体STP4-a的效价在8h和12h时无显著性差异(P＞0.05)，并且显著高于0、2、4、6h(P＜0.05)。因此，噬菌体STP4-a的最佳培养时间为8-12h。随着噬菌体从4h开始达到其平稳期后，噬菌体的效价会有小幅变化，但不会发生数量级剧变。在随后的优化实验中，每个因素水平均设置4、8、12h三个时间点采样测定效价，检测不同培养条件下不同时间噬菌体的增殖效果。
(2)沙门氏菌噬菌体STP4-a液体增殖最适pH测定
最适pH测定实验所选取的梯度为4、5、6、7、8、9、10。将200mL NB调至pH值为4、5、6、7、8、9、10，接入2mL对数期的宿主菌ST14028和2mL噬菌体STP4-a(效价109pfu/mL)，于37℃培养箱中150r/min振荡培养4、8、12h，分别取样、离心去除菌体沉淀测其效价，结果见图2。
从图2中可以看出，当pH为4时噬菌体的生长明显受到抑制，pH为10时噬菌体生长有所抑制。通过方差分析得到，pH为8时噬菌体STP4-a的效价显著高于其他pH值培养下的噬菌体效价(P＜0.05)。因此，pH为8是STP4-a的最佳培养pH。同时，当pH为5-9时效价均较高，显著高于pH 4和10(P＜0.05)，能达到109pfu/mL以上。沙门氏菌噬菌体PSA-6(专利公开号：CN 102041247A)的pH耐受范围较广，在pH 5-10时效价皆在108pfu/mL左右，而噬菌体STP4-a在pH 5-10时效价仍都能保持108pfu/mL以上，且在pH 5-9时皆超过109pfu/mL，由此可见噬菌体STP4-a也是一株pH耐受范围较广的噬菌体，并且显示出较好的裂解能力。
(3)沙门氏菌噬菌体STP4-a液体增殖最佳离子浓度测定
(a)在200mLNB中分别加入10、20、30mmol/L不同浓度的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+四种离子并加入2mL过夜培养的ST14028(菌数109cfu/mL)以及2mL噬菌体STP4-a(效价109pfu/mL)，于37℃150r/min振荡培养8h，测定其效价，结果见表1。
(b)通过(a)的结果选定影响较大的一种或多种离子继续进行优化，可通过单种离子或复配离子设置分组，每组设三个平行；空白组为不添加离子的营养肉汤培养基。实验通过在200mL含不同离子浓度的NB中分别加入2mL过夜培养的ST14028(菌数109cfu/mL)以及2mL噬菌体STP4-a(效价109pfu/mL)，于37℃150r/min振荡培养4、8、12h，分别取样、离心去除菌体沉淀测其效价，结果见图3、图4。
表1 噬菌体STP4-a在不同离子种类、浓度下效价结果(pfu/mL)
注：“-”表示为噬菌体效价低于107pfu/mL，在稀释范围内未检测到。
表1为添加不同离子的NB培养的噬菌体STP4-a的效价结果。在添加了不同浓度Ca2+的液体培养基中培养的噬菌体效价明显高于对照组，其中浓度为20mmol/L时可能最佳。Mg2+浓度为10、20mmol/L时稍高于对照组。而Zn2+组、Fe2+组效价皆低于107pfu/mL，推测Zn2+、Fe2+可能对噬菌体的生长有抑制作用。因此，选用Ca2+为最佳添加离子并继续进行优化实验。实验室研究曾发现Mg2+、Ca2+对副溶血弧菌噬菌体的生长具有协同促进作用，因此通过设置Ca2 +、Ca2++Mg2+实验组以继续优化。分组如下：空白组为未添加离子；A：10mmol/L CaCl2；B：20mmol/L CaCl2；C：30mmol/L CaCl2；D:10mmol/L CaCl2+10mmol/L MgCl2；E:20mmol/LCaCl2+20mmol/L MgCl2；F:30mmol/L CaCl2+30mmol/L MgCl2。
图3为不同离子浓度不同时间所测得的效价结果，图中显示，培养基中添加了不同浓度离子后经过4、8、12h培养噬菌体效价均较高，皆高于109pfu/mL。图4为不同实验组与空白组的效价之比(比空白值＝实验组效价平均值/空白组效价平均值)。由图4可以较清晰地看到不同离子浓度对沙门氏菌噬菌体效价的影响。发现添加了Ca2+的实验组与空白组相比，具有明显的效价翻倍的现象，原因可能是Ca2+的存在会增加噬菌体对宿主菌的吸附率以及侵入宿主菌中进行装配的量。在实验中发现同时添加了Ca2+和Mg2+的实验组效价增长现象不明显，并且Mg2+的添加反而削弱了Ca2+的促进作用。图4中可发现8h后，添加了不同浓度的Ca2+的实验组效价都达到空白组的两倍多。添加了10mmol/L Ca2+的培养基中的沙门氏菌噬菌体生长情况良好，方差分析结果显示显著高于其他组(P＜0.05)，并且随着培养时间的延长促进效果更明显，到12h时效价达到空白组的3倍之多。因此，最佳离子浓度为于NB中添加10mmol/L Ca2+，培养8-12h时效果尤为显著。
(4)沙门氏菌噬菌体STP4-a液体增殖最佳培养转速测定
最佳培养转速测定实验所选取的转速梯度为100、150、200r/min，每个转速水平分别设置三个平行，将200mL NB中分别加入2mL对数期宿主菌ST14028(菌数109cfu/mL)以及2mL噬菌体STP4-a(效价109pfu/mL)，于37℃振荡培养箱分别设置100、150、200r/min转速振荡培养4、8、12h，分别取样、离心去除菌体沉淀测其效价，结果见图5。
通过图5可见，转速为100、150、200r/min培养4、8、12h后，噬菌体STP4-a的效价皆可达到109pfu/mL。方差分析显示，不同转速之间存在显著差异，其中转速为200r/min噬菌体效价最高，显著高于转速为100r/min和150r/min两组(P＜0.05)。因此，转速为200r/min为噬菌体STP4-a的最佳培养转速。推测这可能有两方面原因，一是由于高转速下能使噬菌体与宿主菌均匀分配而使噬菌体快速、均匀地吸附于宿主菌上，由此进行快速裂解、增殖，产生大量的子代噬菌体；二是高转速下增加了培养基内的溶氧量，有利于宿主沙门氏菌的生长，从而促进噬菌体的裂解增殖。因此，噬菌体STP4-a液体增殖时最佳转速为200r/min。
(5)沙门氏菌噬菌体STP4-a液体增殖最佳培养温度测定
最佳培养温度测定实验所选取的温度梯度为27、32、37、42℃，每个温度水平分别设置三个平行，将200mL NB中分别加入2mL对数期宿主菌ST14028(菌数109cfu/mL)以及2mL噬菌体STP4-a(效价109pfu/mL)，分别于27、32、37、42℃振荡培养箱中150r/min振荡4、8、12h，分别取样、离心去除菌体沉淀测其效价，结果见图6。
由图6可发现，噬菌体STP4-a在温度32℃、37℃下生长皆良好，方差分析结果显示效价结果显著高于其他培养温度下效价(P＜0.05)，8h之后效价都能达到109pfu/mL以上，27℃噬菌体生长较缓慢，12h后效价才能达到109pfu/mL。而噬菌体在42℃时生长受到抑制，效价很低，在105-106pfu/mL左右。由此可见，该噬菌体在32、37℃(32-37℃)时生长情况良好。因此，噬菌体STP4-a的最佳培养温度在32-37℃之间。
(6)沙门氏菌噬菌体STP4-a液体增殖最佳感染复数测定
感染复数(multiplicity of infection,MOI)是指在噬菌体裂解细菌时所加入噬菌体的数目与细菌数目的比值，即平均每个细菌感染噬菌体的数量。最佳MOI值测定实验所选取的MOI值梯度为10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5(具体噬菌体效价及细菌浓度如表2)，每个梯度水平分别设置三个平行。将200mL NB中分别加入2mL对应浓度的噬菌体STP4-a和宿主菌ST14028，于37℃振荡培养箱中150r/min振荡培养4、8、12h，分别取样、离心去除菌体沉淀测其效价，结果见图7。
表2 不同感染复数细菌浓度及噬菌体效价数值
由图7可看出，MOI值为10时，所测得的噬菌体的效价最低，一般低于109pfu/mL，而当MOI值为1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5时效价高达109pfu/mL以上。其中，MOI值在10-5时噬菌体STP4-a培养8-12h效价最高，方差分析结果显示效价显著高于其他组(P＜0.05)。值得指出的是MOI值为10-3、10-4以及10-5时，效价皆达到1010pfu/mL以上。从图中可看出，随着MOI值变小，噬菌体的效价反而提高。由此可见，在噬菌体增殖的过程中并非噬菌体的数量越多越好，在适宜的宿主菌和噬菌体的比例下更利于噬菌体的增殖。感染复数是研究病毒感染和产出之间量效关系的重要生物学指标，而最佳感染复数在经济有效地获取最大量的噬菌体产出中发挥关键性作用。本实验测得噬菌体STP4-a的最佳感染复数为10-5，低于宽噬菌谱噬菌体PSA-6a的最佳感染复数1，可见噬菌体STP4-a是一株裂解性强的噬菌体，并且可以实现噬菌体的少量投入大量制备的目标。
实施例2沙门氏菌噬菌体STP4-a发酵罐试验
(1)发酵准备工作：以5L发酵体系为例，将配制好的含有CaCl2的NB充分搅拌混匀后，倾入发酵罐的罐体内，装液量为3L(发酵罐的最大装液量)，之后加入适量消泡剂，以消除发酵过程产生的气泡。将装有培养基的发酵罐罐体置于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌15min，灭菌完成后冷却后使用。将培养至对数期的宿主菌ST14028(菌液浓度约为109cfu/mL)30mL(接种体积为发酵体积的1％)与噬菌体STP4-a 30mL(接种体积为发酵体积的1％)先后加入到发酵罐体内。接种时采用火焰接种法，在加料口周围的酒精凹槽内加入一定量酒精，点燃酒精使加料口周围形成火焰圈，保证加料口周围是相对无菌的环境，此时将上述的宿主菌与噬菌体先后快速加入发酵罐内，然后隔绝氧气熄灭火焰并拧紧加料口的旋塞。大型发酵罐相应扩大体积即可。
(2)发酵过程：以5L发酵罐为例，准备工作完毕后，发酵过程中通入无菌空气，其他参数按照200mL液体培养条件下的优化结果设置发酵条件，并同时设置未优化条件为对照组，对比发酵结果。发酵过程中实时记录发酵体系内溶氧、pH、温度等参数，发酵结束时，停止通气，夹上通气口处的止水夹，样品从取样管中流出，将样品通入无菌容器内，取样结束后立即松开止水夹。将发酵罐罐体再次进行121℃15min灭菌后，冷却、清洗，大型发酵罐相应扩大体积即可。
(3)噬菌体分离及活性测定：取样口所得到的样品即噬菌体STP4-a与宿主菌ST14028的混合液。大规模制备的噬菌体可通过两种方式进行分离：①将噬菌体与宿主菌的混合液经4000r/min 10min离心后，去除菌体沉淀后将上清液经由真空抽气泵抽滤至无菌滤器Steritop-GV(0.22μm)内，所获得的滤液即噬菌体液，该方法适用于处理噬菌体制剂体积相对较少的情况，如0.5-3L，发酵制备及分离流程图见图9；②将噬菌体与宿主菌的混合液通过超滤技术(选择孔径为0.22μm的膜包)分离噬菌体，去除宿主菌。该分离方式根据所使用超滤装置的处理量变更，处理量可在0.5L-100L范围内。将得到的噬菌体制剂利用双层平板法测定效价，记录效价结果并对比不同发酵条件下噬菌体的效价结果，并将噬菌体液置于4℃下保存。
表3 噬菌体STP4-a发酵条件
根据前述的单因素优化结果确定优化后组发酵条件，由此确定优化前、后两组发酵条件见表3。图8为根据表3中所列发酵条件进行发酵，发酵优化前后的效价结果，0h为发酵起始5L发酵体系内噬菌体含量，分别在发酵10h、12h时取样进行效价测定。由图8可见，优化前组噬菌体效价由发酵初始时107pfu/mL经10-12h发酵后效价上升为1010pfu/mL，效价扩增了103倍；优化后组噬菌体效价由发酵初始时102pfu/mL经10-12h发酵后效价也上升为1010pfu/mL，效价扩增了108倍，较对照组多提高了5个数量级，由此验证了单因素实验部分的优化结果。并且由发酵罐制备的噬菌体STP4-a的效价结果高于200mL摇瓶培养结果，这可能与发酵过程中通氧量更充分有关。由此可见，工厂利用发酵法进行大规模制备噬菌体是切实可行的。
实施例3噬菌体STP4-a的体外抑菌应用效果
分别将实验室保存的鼠伤寒沙门氏菌标准菌株ATCC 14028以及养鸡场病鸡所分离的沙门氏菌单菌落接种至营养肉汤培养基中，37℃过夜培养后，将菌液用无菌棉棒蘸取后均匀涂至营养琼脂平板上，分别在每个平板上滴加10μL噬菌体STP4-a，待液滴干后倒置于37℃培养箱中培养过夜，观察是否产生透明圈，由此判断噬菌体的裂解性，从而确定噬菌体STP4-a的裂解谱。
表4为噬菌体STP4-a对病鸡体内分离菌的抑菌效果，表中显示噬菌体STP4-a对所分离的10株沙门氏菌皆具有裂解性，而对大肠杆菌、肺炎杆菌、阪崎肠杆菌等5株非沙门氏菌皆无裂解性。另外本实验室同时也测定了该株噬菌体对标准菌株的裂解谱，发现该噬菌体对甲型副伤寒沙门氏菌CMCC(B)50001、肠炎沙门氏菌CMCC50041、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115/ATCC13311、伤寒沙门氏菌CMCC50071/ATCC19430以及乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094等6株沙门氏菌皆具有裂解性，而对大肠杆菌BL21、副溶血弧菌ATCC17802等9株非沙门氏菌皆无裂解性。由此可见，噬菌体STP4-a具有特异性、宽谱地裂解沙门氏菌的作用，而对其他科的细菌并无裂解作用。
表4 噬菌体STP4-a对病鸡体内分离菌的抑菌效果
备注：+代表产生透明圈，即具有裂解能力，-代表不产生透明圈，即不具有裂解能力。
实施例4噬菌体STP4-a在模拟禽类消化环境下的生长状况
(1)试剂配制
①模拟胃液(8mL)
NaCl 0.125M，KCl 0.007M，NaHCO30.045M，胃蛋白酶3g/L，用盐酸调pH至3；
②模拟肠液(12mL)
胰蛋白酶1mg/mL，用氢氧化钠溶液调pH至8。
(2)实验步骤
①将1mL噬菌体(效价为1.91×1010pfu/mL)至8mL模拟胃液中，分别在0、1、2h取1mL溶液测定效价。
②将1mL噬菌体(效价为1.91×1010pfu/mL)至12mL模拟肠液中，分别在0、3h取1mL溶液测效价；
(3)实验结果
①噬菌体STP4-a在模拟禽类胃液中生长状况
将1mL噬菌体加入到8mL模拟胃液中，0h时效价为2.11×109pfu/mL，1h时效价为1.20×109pfu/mL，2h时效价为1.09×109pfu/mL，1、2h时的效价与0h相比，效价皆显著下降(P<0.05),但仍在109pfu/mL以上。噬菌体STP4-a在模拟禽类胃液中生长状况数据见图10。因此，再次证明噬菌体在胃中停留1-2h后仍能保持较高效价进入肠道中发挥作用。
②噬菌体STP4-a在模拟禽类肠液中生长状况
将1mL噬菌体加入到12mL模拟肠液中，0h时效价为1.29×109pfu/mL，3h时效价为1.86×109pfu/mL，经t-检验分析，3h与0h相比，效价无显著性差异(P>0.05)。即噬菌体在模拟肠道环境中能稳定生存，不会发生显著的数量变化。噬菌体STP4-a在模拟禽类肠液中生长状况数据见图11。由此推测，若肠道内存在目标菌，噬菌体可以在肠道内发挥作用，清除细菌。
结论：该噬菌体制剂在禽类胃肠消化道内具有较高的效价，在pH和酶的共同作用下，仍能维持较高效价，可发挥良好的抑菌效果。因此，本发明制得的噬菌体制剂可以直接应用于禽类胃肠消化道的沙门氏菌抑制和杀灭。
实施例5沙门氏菌噬菌体STP4-a发酵罐试验
在5L发酵罐中，装入含有CaCl230mmol/L的NB培养基，装液量为3L(发酵罐的最大装液量)，加入消泡剂3‰(体积分数)。装有培养基的发酵罐罐体置于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌15min，灭菌完成后冷却后使用。
按照MOI值为10-5，将培养至对数期的宿主菌(菌液浓度约为109cfu/mL)30mL(接种体积为发酵体积的1％)与噬菌体STP4-a 30mL(接种体积为发酵体积的1％)先后加入到发酵罐体内。
发酵过程中通入无菌空气，在30℃温度、搅拌转速200r/min下进行发酵培养，培养8h后，取发酵液即噬菌体STP4-a与宿主菌ST14028的混合液。
噬菌体发酵液的分离：将噬菌体与宿主菌的混合液经4000r/min 10min离心后，去除菌体沉淀后将上清液经由真空抽气泵抽滤至无菌滤器Steritop-GV(0.22μm)内，所获得的滤液即噬菌体制剂。
噬菌体效价由发酵初始时102pfu/mL经8h发酵后效价上升为109pfu/mL。
实施例6沙门氏菌噬菌体STP4-a发酵罐试验
在5L发酵罐中，装入含有CaCl216mmol/L的NB培养基，装液量为3L(发酵罐的最大装液量)，加入消泡剂3‰(体积分数)。装有培养基的发酵罐罐体置于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌15min，灭菌完成后冷却后使用。
按照MOI值为10-5，将培养至对数期的宿主菌(菌液浓度约为109cfu/mL)30mL(接种体积为发酵体积的1％)与噬菌体STP4-a 30mL(接种体积为发酵体积的1％)先后加入到发酵罐体内。
发酵过程中通入无菌空气，在40℃温度、搅拌转速100r/min下进行发酵培养，培养5h后，取发酵液即噬菌体STP4-a与宿主菌ST14028的混合液。
噬菌体发酵液的分离：将噬菌体与宿主菌的混合液经4000r/min 10min离心后，去除菌体沉淀后将上清液经由真空抽气泵抽滤至无菌滤器Steritop-GV(0.22μm)内，所获得的滤液即噬菌体制剂。
噬菌体效价由发酵初始时102pfu/mL经5h发酵后效价上升为107pfu/mL。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (8)
1.一种沙门氏菌噬菌体制剂，其特征在于：该制剂由保藏号为: CCTCC NO：M 2014145的噬菌体以沙门氏菌为宿主菌发酵制得。
2.一种权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体制剂的制备方法，其特征在于：保藏号为:CCTCC NO：M 2014145的噬菌体接入培养基中，培养基中沙门氏菌感染复数10～10-5，在培养温度30～40℃下搅拌通气培养4 h以上，得到的发酵液经噬菌体与宿主菌的分离，得到噬菌体制剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的培养基中添加1-30 mmol/LCaCl2。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：噬菌体与宿主菌通过两种方式择一进行分离：
①将噬菌体与宿主菌的混合液经4000-6000 r/min 5-10 min离心后，去除菌体沉淀后将上清液经由真空抽气泵抽滤至无菌滤器内过滤，过滤孔径为0.22μm，所获得的滤液即为产品；
②将噬菌体与宿主菌的混合液通过超滤技术分离噬菌体，选择孔径为0.22μm的膜包，去除宿主菌后得到产品。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述噬菌体的液体增殖条件为转速200 r/min、感染复数10-5、营养肉汤培养基中添加10 mmol/L CaCl2培养10-12 h。
6.一种权利要求1 所述沙门氏菌噬菌体制剂在制备抑制和杀灭沙门氏菌方面的制剂的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：该噬菌体用于防止沙门氏菌污染和沙门氏菌过度生长，其中所述的沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和乙型伤寒沙门氏菌。
8.一种权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体制剂在防治食品污染沙门氏菌方面的应用。
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