CN116042541A - 一种溶藻弧菌噬菌体grnrz-p25及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种溶藻弧菌噬菌体GRNRZ‑P25及其应用，包括溶藻弧菌噬菌体GRNRZ‑P25，申请人在广西北海某水产养殖水塘，分离出一株溶藻弧菌噬菌体GRNRZ‑P25，所述噬菌体在2022年12月保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCCNO：CCTCCM20222040，分类命名：溶藻弧菌噬菌体GRNRZ‑P25，该溶藻弧菌噬菌体GRNRZ‑P25应用于溶藻弧菌的生物控制过程中，具有裂解谱广、杀菌效率高的优势，对水产中占比大的弧菌均有效果；对水产养殖中溶藻弧菌的预防和杀灭具有巨大应用潜力，同时具有优秀的杀菌效率和抑菌表现，抑菌作用时间长。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖业微生物技术应用领域，具体为一种溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25及其应用。
背景技术
溶藻弧菌是海洋鱼类、甲壳类动物和软体动物重要的致病菌之一，已成为水产养殖业的严重威胁。在水产养殖过程中，细菌群落的动态平衡对鱼类或甲壳类幼体的生存、发育和性能方面发挥着至关重要的作用。许多消毒剂和抗生素被用于抑制病原菌和治疗水产养殖疾病，但在应用传统措施后很快就出现了抗生素耐药性和药物残留，抗生素耐药性是当今人类健康、粮食安全和经济发展面临的最大威胁之一。控制病原体和维持菌群动态平衡的另一种方法是使用噬菌体。噬菌体疗法在水产养殖设施中预防和控制病原体感染方面备受关注
噬菌体是地球上数量最多的生物，它们与细菌有着特异性的相互作用，并在细菌裂解后释放后代。噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，烈性噬菌体可以感染和裂解宿主细菌，具有特异性强、自我增殖快的特点。然而，大量溶藻弧菌噬菌体仍然缺乏详细的基因组信息。因此，需要进一步详细了解溶藻弧菌噬菌体的生物学和基因组特征，以更好地了解和评估它们对细菌病原体的功能，为此，本发明提出一种溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25，为溶藻弧菌的生物控制提供新的方法。
发明内容
为应对溶藻弧菌的耐药性及对养殖产业的经济损失问题，本发明目的是提供一种溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25及其应用，创造了一种优势、高效、绿色、安全和可工业应用的溶藻弧菌生物控制新方法。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：申请人在广西北海某水产养殖水塘，分离出一株溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25，所述噬菌体在2022年12月保藏至中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCCNO：CCTCCM20222040，分类命名：溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25。
进一步的，所述噬菌体GRNRZ-P25具有高发酵率，在最佳感染复数MOI＝0.001时，发酵6h，效价可达8.0×1010PFU/mL，对工业发酵提供了理论基础。
进一步的，所述噬菌体GRNRZ-P25裂解谱广，对429株溶藻弧菌中410株具有裂解效果，裂解率达95.6％，对138株副溶血弧菌中63株具有裂解效果，裂解率达45.7％，对59株哈维氏弧菌中36株具有裂解效果，裂解率达61.0％，对水产中占比大的弧菌均有效果。
本发明的有益效果：。
1.该溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25应用于溶藻弧菌的生物控制过程中，具有裂解谱广、杀菌效率高的优势，对水产中占比大的弧菌均有效果。
2.该溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25在水产养殖中溶藻弧菌的预防和杀灭具有巨大应用潜力，具有优秀的杀菌效率和抑菌表现，抑菌作用长达24小时。
附图说明
图1为本发明一种溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的噬菌斑图；
图2为本发明反应溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的pH值稳定性；
图3为本发明一种溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25于不同温度的稳定性图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1：溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的分离纯化
在广西北海某水产养殖水塘采集水样6份，每份50mL，6000rpm/min离心10min，取上清，并用0.22μm滤器除菌，取5mL处理后上清液与0.5mL溶藻弧菌(浓度为5×108CFU/mL左右)混合均匀，静止吸附15min后，放置于28℃培养箱中150rpm/min振荡发酵培养过夜；取发酵后液体6000rpm/min离心10min，取上清，并用0.22μm滤器除菌，得种子滤液，取滤液100μL与300μL溶藻弧菌(浓度为5×108CFU/mL左右)混合均匀，静止吸附15min后，将混合物与2％氯化钠TSB半固体(含0.65％琼脂)混合均匀，浇筑在2％氯化钠TSA底板上，待凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中培养过夜。记录培养皿噬菌体的效价，在培养皿上挑取噬菌斑透而亮的斑点，于1mLSM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL2％氯化钠TSB液体培养基中，加入100uL相应的宿主溶藻弧菌菌液并混匀，静止吸附15min，37℃下150rpm/min过夜培养，5000rpm/min离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。所分得溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25与宿主菌形成的噬菌斑透亮、圆形、直径为1mm。该噬菌体GRNRZ-P25已于2022年12月送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：溶藻弧菌噬菌体(Vibrioalginolyticusphage)GRNRZ-P25，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCM20222040.
实施例2：溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25对溶藻弧菌裂解范围实验
采用双层点滴法来测定噬菌体的裂解谱。准备好足量的盛有3mL的2％氯化钠TSB的EP管，429株溶藻弧菌、138株副溶血弧菌和59株哈维氏弧菌接种于该培养基中，37℃恒温200rpm/min振荡7h，得到弧菌菌液；准备好足量的TSA底板，将0.9ml弧菌菌液与50℃左右6ml的2％氯化钠TSB半固体培养基(含0.65％琼脂)混合均匀，缓慢平铺于TSA底板之上；平板培养基凝固至常温后，取溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25溶液(效价1×109PFU/ml)7μL滴于双层板中心，等溶液自然风干后，放置于37℃恒温生化培养箱中培养7h左右，观察结果。每组实验重复3次。
结果如表所示，溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25具有高裂解率，对429株溶藻弧菌中410株具有裂解效果，裂解率达95.6％，对138株副溶血弧菌中63株具有裂解效果，裂解率达45.7％，对59株哈维氏弧菌中36株具有裂解效果，裂解率达61.0％，说明溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25裂解谱较宽，在水产养殖中溶藻弧菌的预防和杀灭具有巨大应用潜力。
表1溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的裂解谱实验结果
注：++：表示完全裂解，噬菌斑透亮；+：表示完全裂解，噬菌斑较透亮；-：表示未裂解.
实施例3：不同感染复数及不同感染时间下溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的效价测定
准备溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的宿主菌溶藻弧菌VADK04，准备好装有3mL2％氯化钠TSB的EP管，挑取溶藻弧菌VADK04单菌落接种于培养基中，在37℃条件下振荡培养8h，得到宿主菌菌液。按接种量1％接种菌液至100mLTSB培养基中，待溶藻弧菌生长至对数初始期时(浓度1×108CFU/mL)，随后将溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25接种于该培养基中，按照不同的感染复数(multiplicityofinfection，MOI；MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，每组实验3个平行。在28℃摇床中150rpm振荡培养12h。每2h取出部分培养液进行8000rpm/min离心l0min并收集上清，测定噬菌体效价，12h后结束培养。
实验结果如下表2所示，在MOI＝0.001时，发酵6h，效价可达8.0×1010PFU/mL，对工业发酵提供了理论基础。
表2 噬菌体GRNRZ-P25最佳感染复数
| 噬菌体浓度 | 宿主菌浓度 | 感染复数 | 效价 |
| 1.0×109 | 1.0×108 | 10 | 3.1×109 |
| 1.0×108 | 1.0×108 | 1 | 7.1×109 |
| 1.0×107 | 1.0×108 | 0.1 | 3.8×109 |
| 1.0×106 | 1.0×108 | 0.01 | 5.7×109 |
| 1.0×105 | 1.0×108 | 0.001 | 8.0×1010 |
| 1.0×104 | 1.0×108 | 0.0001 | 3.4×109 |
实施例4：溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的pH稳定性试验
取无菌细菌瓶分别加入不同pH3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的2％氯化钠TSB培养基9mL后将上述细菌瓶置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lmL噬菌体纯培养液(起始效价：5×109PFU/mL)，于25℃环境中静置15min。于第2h取样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
结果如附图2所示，溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25在pH为5-9范围内处理2h其效价无明显变化，在pH为4、10范围内处理2h其效价略有变化。
实施例5：溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的温度稳定性试验
取若干支无菌50mL离心管，各加入45mLTSB后置于相应温度的恒温水浴中，待温度平衡后分别加入5mL噬菌体纯培养液(起始效价：5×109PFU/mL)，于40℃、50℃、60℃、70℃的温度中作用20min、40min、60min。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
结果所示，实验组中溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25在温度为60℃以下较易存活，在40℃以下可长期保存。
实施例6：溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25毒力基因或不良基因缺失检测
基因缺失检测试验选取65种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的独立基因，通过测定溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果表示，供试噬菌体不含以下毒力基因。
表3病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因
实施例7：溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的发酵制备
从宿主菌溶藻弧菌VADK04平板上挑取单菌落，接种于3mL的2％氯化钠TSB培养基中，在37℃下150rpm/min培养8h，得到宿主菌液。将菌悬液以1％接种量接种于100mL的2％氯化钠TSB培养基中，在37℃下150rpm/min培养至对数期前期。发酵体系为6L，发酵培养基为普通TSB培养基，初始PH值为7.0；采用火焰法按1％接种量接种溶藻弧菌，以最佳感染复数MOI＝0.001向发酵体系加入噬菌体，接入噬菌体后需静止吸附15min，发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml发酵液于无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。
溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25在发酵6h时，效价达到最高，为7.89×1010PFU/ml，在6h至12h时间段，效价稳定在1010PFU/ml；因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (2)
1.一种溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25，其特征在于：包括溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25，申请人在广西北海某水产养殖水塘，分离出一株溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25，所述噬菌体在2022年12月保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCCNO：CCTCCM20222040，分类命名：溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25。
2.根据权利要求1所述溶藻弧菌噬菌体GRNRZ-P25的应用，其特征在于：应用于水产养殖业中溶藻弧菌的生物控制。
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| CN114703149A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-07-05 | 武汉格瑞农生物科技有限公司 | 一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体gva-p21及其应用 |
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