CN117070472A - 一株针对高致病性弧菌及耐药弧菌的副溶血弧菌噬菌体及应用 - Google Patents

一株针对高致病性弧菌及耐药弧菌的副溶血弧菌噬菌体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一株针对高致病性弧菌及耐药弧菌的副溶血弧菌噬菌体及应用，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M20231413。本发明中噬菌体VPP07具有发酵效价高、裂解弧菌种类多、可裂解高致病性弧菌、安全高效的特点。噬菌体VPP07对多种引起凡纳滨对虾细菌病的弧菌具有良好的防治作用。本发明能为水产品弧菌病的噬菌体疗法提供优良的菌株资源和大规模发酵生产的生物预防措施。

Description

一株针对高致病性弧菌及耐药弧菌的副溶血弧菌噬菌体及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株针对高致病性弧菌及耐药弧菌的副溶血弧菌噬菌体及应用，本申请筛选得到的噬菌体对各种高致病性弧菌具有杀灭作用，可用于控制水产动物弧菌病，包括但不限于对凡纳滨对虾弧菌疾病的防治。
背景技术
弧菌病是由弧菌属引起的一类疾病，为海水养殖最常发生的细菌性疾病。弧菌广泛存在于河口、海湾、近岸海域的海水中，是养殖水体中的条件致病菌之一。它可以直接引起水产动物患病，同时也会导致体质下降，从而被其它种类的病原体感染，最终造成大量死亡，感染弧菌的水产动物，临床表现为红腿、黄鳃、烂尾、烂眼、甲壳溃疡、肌肉白浊、肝萎缩或发红、肌肉不透明、活力差、空肠空胃、偷死等。此外弧菌引起的对虾急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND)、偷死病(Early MortalitySyndrome，EMS)和高致病性弧菌引发的高致病性弧菌病(Highly Virulent Vibrio Disease，HLVD)给水产养殖业带来巨大的灾难和损失。
弧菌属中已明确有12个种具有致病性，其中包括副溶血性弧菌(V.Parahaemolyticu s)、溶藻弧菌(V.algimolyticus)和哈维氏弧菌(V.harveyia)等。尤其近两年来“玻璃苗”问题更是成为对虾养殖的头号杀手(http://epaper.nfncb.cn/nfnc/content/20210403/Articel11002MT.htm)，从南到北大规模暴发，重创整个虾苗行业。该病是由高致病性弧菌导致的，高致病性弧菌分泌的毒素毒力极强，是AHPND/EMS的50-100倍。与普通弧菌相比，高致病性弧菌传染率、发病率、死亡率更高。这是因为其携带的TcA毒素基因的毒性相比引起急性肝胰腺坏死的弧菌的pirA和pirB更强，所产生的Tc毒素致病性高、致死性高，破坏力极强。而现有的抗生素防控方法由于细菌的耐药性和药物残留等问题，使其慢慢不适用于水产养殖。
申请CN202210373646.9公开了一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法。噬菌体Vp-PV1效价高达8.9×109PFU/mL，防治副溶血弧菌JGB080708-1效果显著，对于治疗副溶血弧菌引起的病害和开发噬菌体微生态制剂具有重大意义。
申请CN202110894035.4公开了一株裂解性、高效价副溶血弧菌噬菌体RDP-VP-21010及其应用，该对水体中副溶血弧菌具有强裂解作用，具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，可以高效治疗该病原菌在水产养殖中所引起的副溶血弧菌疾病，以及可以作为消毒剂，为工业化、规模化、程序化生产噬菌体及治疗副溶血弧菌引起的水产养殖细菌病提供了噬菌体来源。
而现有报道中尚未有针对高致病性弧菌的噬菌体及其生物制剂，基于此，本发明通过筛选得到的副溶血弧菌噬菌体VPP07，通过研究其生物学特性，为水产养殖弧菌病，特别是高致病性弧菌病的生物控制提供新的方法。
发明内容
为应对日益加重的弧菌耐药性问题以及高致病性弧菌对水产养殖带来的经济损失，本发明提供一株针对高致病性弧菌及耐药弧菌的副溶血弧菌噬菌体(Vibrioparahaemolyticus phage)VPP07，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M20231413。
本发明的另一个目的在于提供了副溶血弧菌噬菌体VPP07的应用，该噬菌体可用于制备防治水产弧菌感染导致的疾病，特别是高致病性弧菌，耐药弧菌等。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
副溶血弧菌噬菌体(Vibrio parahaemolyticus phage)VPP07的筛选：申请人自福建市东山县某凡纳滨对虾工厂化养殖水体中，分离出一株副溶血弧菌噬菌体VPP07，噬菌体形态如图1所示，其与宿主菌形成的噬菌斑透亮、圆形、直径为1mm。该噬菌体已于2023年08月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：副溶血弧菌噬菌体(Vibrioparahaemolyticus phage)VPP07，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M20231413。
本发明的保护范围还包括：
副溶血弧菌噬菌体(Vibrio parahaemolyticus phage)VPP07在制备防治水产弧菌病的药物中的应用；
以上所述的应用，包括但不限于：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio algimolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyia)。
以上所述的应用，优选的，所述的水产弧菌包括：耐药水产弧菌或高致病性弧菌。
所述的耐药水产弧菌包括耐药副溶血弧菌、耐药溶藻弧菌和/或耐药哈维氏弧菌。
以上所述的应用，优选的，所述的高致病性弧菌为高致病性副溶血弧菌、高致病性溶藻弧菌或高致病性哈维氏弧菌。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)噬菌体VPP07具有高发酵率，在最佳感染复数MOI＝0.01时，发酵6h，效价可达2.5×1011PFU/mL，对工业发酵提供了理论基础；
2)噬菌体VPP07可裂解多种耐药性弧菌，即具备多价性和抗耐药性。其对56株耐药的副溶血弧菌中的49株具有裂解效果，裂解率达到87.5％；对44株耐药的溶藻弧菌中的32株具有裂解效果，裂解率达到72.7％；对32株耐药的哈维氏弧菌中的21株具有裂解效果，裂解率达到65.6％，对水产养殖中主要几种弧菌均产生裂解效果。
3)噬菌体VPP07对高致病性弧菌具有高裂解率，可裂解28株高致病性弧菌中的25株，裂解率为89.3％，在凡纳滨对虾多种高致病性弧菌混合感染的防控方面有很好地效果。
4)噬菌体VPP07具有良好的环境耐受性，在pH为5-10范围内处理4h其效价无明显变化，pH为4-11处理1h后仍具有较高效价；在温度为65℃以下较易存活，在4-37℃具有良好的稳定性，可长期保存。
附图说明
图1为菌噬菌体VPP07的噬菌斑。
图2为不同感染复数和时间下的副溶血弧菌噬菌体VPP07的效价。
图3为副溶血弧菌噬菌体VPP07在不同pH值下稳定性的测试。
图4为副溶血弧菌噬菌体VPP07在不同温度保存时间。
图5为噬菌体VPP07对三种耐药性弧菌的裂解效果示意图。
图6为副溶血弧菌噬菌体VPP07的发酵动态示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
副溶血弧菌噬菌体VPP07的分离纯化
在福建市东山县某凡纳滨对虾工厂化养殖水体采集水样10份，每份30mL，6000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤器除菌，取5mL滤液与0.5mL副溶血弧菌(浓度约为5×108CFU/mL)混合均匀，于37℃摇床中200rpm振荡培养过夜发酵。发酵液6000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤器除菌，取滤液100μL与300μL副溶血弧菌(浓度约为5×108CF U/mL)混合均匀，加入2％氯化钠TSB半固体(含0.65％琼脂)，轻轻颠倒均匀后浇筑于2％氯化钠TSA底板上，待凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中培养过夜。挑取透而亮的噬菌斑斑点，于1mL SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL 2％氯化钠TSB液体培养基中，加入500μL相应的宿主副溶血弧菌菌液并混匀，37℃条件下200rpm震荡培养过夜，6000rpm离心10min取上清过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
自水样中分离出一株副溶血弧菌噬菌体VPP07，如图1所示，其与宿主菌形成的噬菌斑透亮、圆形、直径为1mm。该噬菌体已于2023年08月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：副溶血弧菌噬菌体(Vibrio parahaemolyticus phage)VPP07，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M20231413。
实施例2：
不同感染复数及不同感染时间副溶血弧菌噬菌体VPP07的效价测定
准备副溶血弧菌噬菌体VPP07的宿主菌副溶血弧菌VPFJ33，准备好装有3mL 2％氯化钠TSB的EP管，挑取副溶血弧菌VPFJ33单菌落接种于培养基中，在37℃条件下振荡培养8h，得到宿主菌菌液。按1％接种量接种菌液至100mL TSB培养基中，待副溶血弧菌生长至对数初始期，接种副溶血弧菌噬菌体VPP07，按照不同的感染复数(multiplicity ofinfection，MOI；MOI＝噬菌体数量/细菌数量，具体可见图2)，每组实验3个平行。在37℃摇床中200rpm振荡培养12h。每2h取出部分培养液进行6000rpm离心l0min并收集上清，测定噬菌体效价，12h后结束培养。
结果见图2，当MOI＝0.01时，发酵6h效价最高达2.5×1011PFU/mL。
副溶血弧菌噬菌体VPP07可裂解的任何一株副溶血弧菌都可以作为VPP07的增殖菌株。
实施例3：
副溶血弧菌噬菌体VPP07的pH稳定性试验
取无菌细菌瓶分别加入不同pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的2％氯化钠TSB培养基9mL，将上述细菌瓶置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lmL噬菌体纯培养液(起始效价：5×109PFU/mL)，于25℃环境中静置4h。分别于第1h、2h和4h取样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
结果如图3所示，副溶血弧菌噬菌体VPP07在pH为5-10范围内处理4h其效价无明显变化，pH为4-11处理1h后仍具有较高效价。
实施例4：
副溶血弧菌噬菌体VPP07的温度稳定性试验
取若干支无菌50mL离心管，各加入45mL TSB后置于相应温度的恒温培养箱中，待温度平衡后分别加入5mL噬菌体纯培养液(起始效价：5.0x107PFU/mL)，于4℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃的温度中作用1h、24h、48h、1W、4W、8W、12W、24W和48W。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
结果如图4所示，副溶血弧菌噬菌体VPP07在温度为65℃以下较易存活，在4-37℃具有良好的稳定性，可长期保存。
实施例5：
噬菌体VPP07的宿主范围
采用双层点滴法来测定噬菌体的裂解谱。挑取56株耐药副溶血弧菌、44株耐药溶藻弧菌和33株耐药哈维氏弧菌及28株高致病性弧菌分别接种于3mL的2％氯化钠TSB的EP管中，37℃恒温200rpm振荡8h，得到弧菌菌液；准备好足量的TSA底板，将0.5ml副溶血弧菌菌液与50℃左右的6mL TSB半固体培养基(含0.65％琼脂)混合均匀，缓慢平铺于TSA底板之上；待平板培养基凝固至常温后，分别取效价为1×108PFU/ml的噬菌体VPP07和GVP-P20(申请号202210108456.4)5μL滴于上，超净台里自然风干后，放置于37℃恒温生化培养箱中培养8h左右，观察结果。每组实验重复3次。
如图5所示，副溶血弧菌噬菌体VPP07具有多价性，对水产养殖常见的三种耐药性弧菌均有不同程度的裂解效果，对56株副溶血弧菌的裂解率为87.5％；对44株溶藻弧菌的裂解率达到72.7％；对32株哈维氏弧菌的裂解率达到65.6％。说明副溶血弧菌噬菌体VPP07在水产养殖耐药性弧菌的防控中具有巨大应用潜力，为养殖中单一弧菌或多种弧菌混合感染的治疗提供参考方法。
如表1所示，副溶血弧菌噬菌体VPP07对近年来多发且引起损失惨重的高致病性弧菌具有裂解效果，可裂解28株高致病性弧菌中的25株，裂解率高达89.3％；而噬菌体GVP-P20对高致病性弧菌的裂解率为。
表1噬菌体VPP07对28株高致病性弧菌的裂解效果
注：“-”表示不裂解，“+”表示裂解。
实施例6：
副溶血弧菌噬菌体VPP07的发酵制备
从副溶血弧菌VPLN1(申请号为2022101084564)平板上挑取单菌落，接种于3mL的2％氯化钠TSB培养基中，在37℃下200rpm培养8h，得到宿主菌液。将菌悬液以1％接种量接种于100mL的2％氯化钠TSB培养基中，在37℃下200rpm培养至对数期前期。
发酵体系为6L，发酵培养基为普通TSB培养基，初始PH值为7.0；采用火焰法按1％接种量接种副溶血弧菌，以最佳感染条件MOI＝0.01向发酵体系加入噬菌体VPP07，发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml发酵液于无菌容器中，6000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。
待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心10min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。
由图6可知，副溶血弧菌噬菌体VPP07在发酵制备6h时，效价达到最高5.8×1011PFU/mL，在6h至12h时间段，效价稳定在1011PFU/mL；因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。
实施例7：
噬菌体VPP07对凡纳滨对虾中高致病性弧菌混合感染的保护实验
实验凡纳滨对虾由广东珠海某凡纳滨对虾养殖场提供，所选凡纳滨对虾外观正常健康，大小5公分，280头/500g。实验前将凡纳滨对虾统一放置于150L水族箱中适应饲养7d，水体pH值为7.3±0.1，温度为25℃，溶解氧为6.6±0.1mg/L，待虾死亡率稳定在0％～5％以内时，进行实验。
本实施例所用到的高致病性弧菌均分离自临床“玻璃苗”发病池塘，对所分离的弧菌进行菌种鉴定，再对不同的菌种进行TcA毒力基因鉴定，含TcA毒力基因的弧菌即为高致病性弧菌，通过上述方式，鉴定出高致病性副溶血弧菌和高致病性溶藻弧菌，作为以下实验的攻毒菌株。
将对虾平均分为4个组：
1)对照组水体加入生理盐水；
2)攻毒组水体加入终浓度为1×103CFU/mL高致病性副溶血弧菌和1×103CFU/mL高致病性溶藻弧菌；
3)治疗组水体加入终浓度为1×103CFU/mL高致病性副溶血弧菌和1×103CFU/mL高致病性溶藻弧菌；待12h后，加入噬菌体浓度1×107PFU/mL进行治疗；
4)预防组在实验开始前1天，加入噬菌体浓度1×107PFU/mL，后水体加入终浓度为1×103CFU/mL高致病性副溶血弧菌和1×103CFU/mL高致病性溶藻弧菌；
5)抗生素组水体加入终浓度为1×103CFU/mL高致病性副溶血弧菌和1×103CFU/mL高致病性溶藻弧菌，待12h后，按说明用量加入恩诺沙星进行治疗。
实验持续5天，记录对虾的症状及死亡情况，待观察日期结束后，对样品的水样弧菌数量进行检测。
实验结果如表2所示，空白组存活率为97％，攻毒组凡纳滨对虾存活率为0％；治疗组存活率为88％，预防组存活率为95％，抗生素组存活率为86％。噬菌体VPP07对高致病性副溶血弧菌和溶藻弧菌有非常明显的杀灭作用，可降低水体高致病性弧菌含量，对水产动物弧菌病具有一很好的的防治作用，可以作为一种生物抗菌剂应用于凡纳滨对虾高致病性弧菌病的预防和治疗。
表2副溶血弧菌噬菌体VPP07对凡纳滨对虾中高致病性弧菌的防控效果

Claims (6)

1. 一株分离的副溶血弧菌噬菌体（Vibrio parahaemolyticus phage）VPP07，所述的噬菌体的保藏编号为：CCTCC NO：M20231413。
2.权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体在制备防治水产弧菌病的药物中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，所述的水产弧菌为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio algimolyticus）和/或哈维氏弧菌（Vibrio harveyia）。
4.根据权利要求2所述的应用，所述的水产弧菌为耐药水产弧菌或高致病性弧菌。
5.根据权利要求2所述的应用，所述的耐药水产弧菌为耐药副溶血弧菌、耐药溶藻弧菌和/或耐药哈维氏弧菌。
6.根据权利要求4所述的应用，所述的高致病性弧菌为高致病性副溶血弧菌、高致病性溶藻弧菌和/或高致病性哈维氏弧菌。
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