CN114480302A - 一株海藻希瓦氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株海藻希瓦氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体被命名为vB_SheM_PV07，于2021年04月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，其保藏编号为CGMCC No.22378。该噬菌体不仅具有裂解效果强、裂解谱宽、特异性强、酸碱稳定性高的特点，可有效防控海藻希瓦氏菌病，极大地降低由于海藻希瓦氏菌引起的各种疾病的发病概率；还可广泛用于水产养殖过程中的容易因海藻希瓦氏菌感染造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及对潜在疾病的预防等方面，有益于水产养殖业的健康发展，预防海藻希瓦氏菌对人体的感染。

Description

一株海藻希瓦氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株海藻希瓦氏菌噬菌体及包含该噬菌体的组合物及其应用。

背景技术

海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)属于革兰氏阴性菌，活动性芽孢杆菌，兼性厌氧，具有单一极生鞭毛，产生硫化氢，表现出溶血现象；对多种养殖鱼类均有高致病性，也能经海水通过伤口感染人。海藻希瓦氏菌属于条件性致病菌，在世界各地海洋中均有发现，可通过受损皮肤感染多种海水养殖品种，引起吻肿病、腹水病或肾肿大症等疾病的发生与流行。

目前主要是采用传统的抗生素类药物来防治海产品的海藻希瓦氏菌感染导致的疾病，但是抗生素的过度使用不仅容易导致耐药病原菌的产生，并且也会对水体造成污染，因此，需要寻找更安全有效的抗生素替代物。

噬菌体(Bacteriophage或Phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物病毒的总称，其体积微小、结构简单，不具备细胞结构，分布十分广泛，凡是细菌存在之处几乎都有相应的噬菌体。由于噬菌体的裂解特异性强，只针对其特定的细菌病原菌作为宿主，不会破坏正常菌群，基于噬菌体具有宿主依赖性，它会随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内，且噬菌体的降解终产物为氨基酸和核苷酸对人和动物无影响，因此，噬菌体具有无残留、无毒害、使用安全的优点，可作为抗生素替代物用于防治海藻希瓦氏菌病。

但是，目前还未发现有效的海藻希瓦氏菌噬菌体，因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株海藻希瓦氏菌噬菌、其噬菌体组合物及其应用；该海藻希瓦氏菌噬菌被命名为vB_SheM_PV07，其不仅对海藻希瓦氏菌具有强裂解性和宽裂解谱，可用于作为活性成分用于制备防治海藻希瓦氏菌感染的疾病的药物、水产饲料添加剂、水体消毒剂，有效防治水产的海藻希瓦氏菌病，对水体、饲料、环境进行消毒。

本发明的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供了一株海藻希瓦氏菌噬菌体vB_SheM_PV07，该噬菌体分离自山东省青岛市某湾区污水，已于2021年04月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.22378。

电镜下观测到：该噬菌体的头部长度为110-115nm，头部宽度为84- 85nm，尾长为66-70nm，其具有伸缩性尾鞘，根据国际病毒分类委员会(The International Committeeon Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于肌尾噬菌体科，将其命名为vB_SheM_PV07。

本申请中，噬菌体vB_SheM_PV07包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％且保持基本相同的杀菌活性的突变株。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生上述突变，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。噬菌体vB_SheM_PV07可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状极度相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。

第二方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的海藻希瓦氏菌噬菌体vB_SheM_PV07。

优选地，在实际应用中，为进一步提高噬菌体制剂的裂解谱或充分发挥不同噬菌体的互补性能，可将海藻希瓦氏菌噬菌体vB_SheM_PV07与其他噬菌体进行组合使用，如与其他海藻希瓦氏菌噬菌体组合用于扩大对海藻希瓦氏菌的裂解谱；此外，也可将噬菌体vB_SheM_PV07与其他可抑制同类疾病的其他种类的噬菌体配合，提高对同一类疾病的防治效果。

优选地，上述噬菌体组合物还包括噬菌体vB_SheM_PV07的突变体中的一种或多种；所述突变体与该野生噬菌体的同源性高于98％且保持基本相同的抑菌活性。

第三方面，本申请还提供了上述海藻希瓦氏菌噬菌体在制备用于防治因海藻希瓦氏菌感染导致疾病的药物或水产饲料添加剂或水体消毒剂中的应用。

本文中术语“防治”是指“预防和治疗”。“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

所述疾病包括由海藻希瓦氏菌感染引起的人类疾病、各类动物(包括水产)疾病等。

优选地，海藻希瓦氏菌感染的疾病为由海藻希瓦氏菌感染引发的水产的疾病；更优选地，所述由海藻希瓦氏菌感染引发的水产的疾病选自溃疡病、黑斑病、吻肿病、细菌性肠炎、腹水病或肾肿大症。更优选地，所述水产选自海水水产，更优选为大菱鲆、南美白对虾、东风螺、半滑舌鳎或美国红鱼等养殖品种的至少一种。

第四方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分上述的海藻希瓦氏菌噬菌体vB_SheM_PV07或上述噬菌体组合物。优选地，所述噬菌体药物制剂还包括其他相配合的抑菌或杀菌活性成分。

可选地，上述噬菌体药物制剂还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)、丸剂、胶囊、粒剂或片剂。

所述噬菌体药物制剂的剂型为溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。

优选地，所述噬菌体药物制剂采用溶液剂。溶液剂是指通过浸浴给药将噬菌体药物制剂直接投放于水产养殖水体中进行给药的方式，其具有操作简单、效果好的优点。

第五方面，本发明还提供一种水产饲料添加剂，其有效成分包括如上所述的海藻希瓦氏菌噬菌体或噬菌体组合物。通过将所述水产饲料添加剂与水产饲料进行混拌后，对水产动物(如东风螺)进行饲喂，从而达到预防或治疗海藻希瓦氏菌病的效果。

优选地，饲料中每种噬菌体的效价为1×10⁸PFU/g以上。

第六方面，本发明还提供一种水体消毒剂，其有效成分主要为所述的海藻希瓦氏菌噬菌体或噬菌体组合物。优选地，水体消毒剂中噬菌体的效价为 1×10⁴PFU/mL以上。水体消毒剂还包含其他用于环境中抑制或消灭细菌的其他活性成分或助剂；更优选地，所述助剂包括能延长噬菌体有效期的成分。

第七方面，本发明还提供上述水体消毒剂在用于杀灭环境中的海藻希瓦氏菌中的应用。

具体地，上述水体消毒剂可用于水产养殖场所的环境消毒和饲料消毒防腐，可用于代替抗生素或传统消毒产品，且所述噬菌体及代谢产物不会对人体或其他动物造成损害。该消毒剂可通过喷雾、浸泡等方式对养殖环境、饲料、饲养器具等进行海藻希瓦氏菌消毒。所述养殖环境包括池壁、水体等。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂。

第八方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的海藻希瓦氏菌噬菌体或噬菌体组合物。基于噬菌体vB_SheM_PV07对宿主菌的裂解特异性，本发明的噬菌体vB_SheM_PV07可应用于样品中海藻希瓦氏菌的快速检测，其可以包括试纸或试纸盒等形式对临床样本中的病原菌进行检测，该检测方法简单、灵敏度高。

第九方面，本发明还提供上述检测试剂盒在用于检测海藻希瓦氏菌中的用途。

第十方面，本发明还提供用于水产品消毒、保鲜的生物抑菌剂，其有效成分主要为上述海藻希瓦氏菌噬菌体或噬菌体组合物。可通过将所述生物抑菌剂以浸泡或者喷雾的方式对水产品的生鲜产品进行消毒处理，从而达到抑制产品加工或保鲜过程中海藻希瓦氏菌的增殖。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一株自行分离的海藻希瓦氏菌噬菌体vB_SheM_PV07，该噬菌体对海藻希瓦氏菌具有强裂解性，对海藻希瓦氏菌的裂解率高达 87.21％，可有效防控水产养殖场因海藻希瓦氏菌导致的疾病，极大地降低引起因海藻希瓦氏菌导致的各种疾病的病发概率，如吻肿病、溃疡病、黑斑病、细菌性肠炎、腹水病或肾肿大症等；此外，该噬菌体还可以用于对水产养殖场环境、饲料、水体等进行全面的海藻希瓦氏菌的消毒，从而通过提高环境洁净度的方式进一步有效降低了水产品海藻希瓦氏菌病的发病率。

2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，具有酸碱稳定性高，具有较好的热稳定性，繁殖能力强，易于进行工业化生产；由该噬菌体制备的药物、消毒剂或保鲜剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。该噬菌体及其产品可广泛用于水产养殖过程中的容易因感染海藻希瓦氏菌造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及水产生鲜食品的保鲜抑菌等方面，有益于水产养殖业的健康发展。

3、该海藻希瓦氏菌噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，用以解决因海藻希瓦氏菌造成的感染、以及因上述病原菌大量增殖引起的水体问题，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性海藻希瓦氏菌的问题。

附图说明

图1为噬菌体vB_SheM_PV07的电镜照片；

图2为噬菌体vB_SheM_PV07的热稳定性结果；

图3为噬菌体vB_SheM_PV07的pH稳定性结果；

图4为噬菌体vB_SheM_PV07的一步生长曲线；

图5为噬菌体vB_SheM_PV07的体外裂解实验结果；

图6为噬菌体vB_SheM_PV07的环境消毒试验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1噬菌体的分离培养

(一)宿主菌悬液的制备

宿主菌海藻希氏菌V04在LB平板上分区划线，挑单菌落接种入5mL LB液体培养基中，于170rpm、25℃条件下增殖至对数生长期，得到新鲜宿主菌菌液。

(二)噬菌体的分离和纯化

1、噬菌体的分离：

将取自山东省青岛市某湾区采集的污水在11000r/min条件下离心 5min，将离心得到的上清液使用0.22μm滤膜过滤后，加入100mL的LB液体培养基与100μL的宿主菌悬液，在150rpm、25℃的条件下培养16h后，再于11000r/min的条件下离心5min，最后用0.22μm滤膜过滤后，得到噬菌体原液。

将噬菌体原液用1×PBS缓冲液进行10倍倍比稀释，得到10^-2、10^-4、10^-6、10^-8稀释液后，分别取上述不同浓度稀释液各100μL与前述制备好的海藻希瓦氏菌悬液混合后在室温孵育5min后，加入5mL的NB上层半固体培养基中，混匀后迅速倒入LB下层固体培养基平板中，待其凝固后倒置于25℃温箱中培养16h后观察，得到噬菌斑。

2、噬菌体的纯化：

用无菌镊子抠取单个噬菌斑，置于1mLPBS溶液后放置于170rpm、 37℃摇床中浸出30min，将浸出液稀释至10^-2，按照1:1的比例与海藻希瓦氏菌混合，室温下孵育5min，混合液加入5mL NB上层半固体培养基中，混匀后迅速倒入LB下层固体培养基平板中，待其凝固后倒置25℃温箱中培养 16h后得到纯化1代噬菌体。纯化3-5代，得到形态一致的噬菌斑。

3、噬菌体悬液的制备：

从按照上述方法纯化3代后的噬菌体平板上抠取单个噬菌体，置于 1mLPBS溶液中破碎，于4℃保存24h后使用。

取宿主菌悬液100μL加入5mLLB液体培养基中，将噬菌体浸出液与宿主菌悬液按照1:1的比例加入上述培养基中，置于170rpm、25℃摇床中振荡增殖4h，对所得增殖液11000rpm离心5min，上清液用0.22μm细菌滤器过滤，得到噬菌体悬液。

(三)噬菌体效价的测定

将上述噬菌体悬液使用PBS缓冲液进行10倍稀释，使用双层平板法测定稀释至10^-6与10^-7的噬菌体效价，每个梯度两个平行。培养后对噬菌斑进行计数并计算效价。测定得到，所述噬菌体vB_SheM_PV07的效价为 9.45×10⁹PFU/mL。

实施例2噬菌体的生物学特性测定

(一)噬菌体的电镜检测

1、实验方法：

取20μl的效价为10⁹PFU/mL的噬菌体滴在铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体，取出铜网在空气中自然干燥2-3分钟，用2％的磷钨酸染色30min，干燥后电镜观察。

2、检测结果：

电镜结果如图1所示，该噬菌体头部对称，直径约为55nm，尾长约为 160nm，具有伸缩性尾鞘，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy ofViruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于肌尾噬菌体科，将其命名为vB_SheM_PV07。

(二)噬菌体的裂解谱测定

1、实验方法：

本实施例采用双层平板法测定噬菌体裂解谱，将噬菌体悬液分别与海藻希瓦氏菌菌液各取100μL加入0.5mL离心管中混合，室温下孵育5min后加入5mL NB上层半固体培养基中混匀，迅速倒入LB下层固体培养基平板中，待其冷凝后倒置于25℃温箱中培养16h，培养完成后取出平板观察有无噬菌斑形成来鉴别能否裂解。

裂解对象为分别来源于江苏赣榆、山东莱州、河北秦皇岛、山东青岛、福建漳州、辽宁葫芦岛的病死虾、大菱鲆、半滑舌鳎及水样的86株海藻希瓦氏菌。对这86株菌进行PCR毒力基因检测，鉴定其是否携带霍乱弧菌溶血素基因(hlyA)、ATP依赖性Clp蛋白酶蛋白水解亚基基因(clpP)、溶血素基因D(hlyD)、溶血素基因Ⅲ(hlyⅢ)和AatA外膜蛋白基因 (tolC)这5种毒力基因，结果见下表1，通过对菌株毒力基因的检测，可判断出这些菌株的致病性，并通过测定裂解谱验证噬菌体vB_SheM_PV07对其的裂解性。其中，hlyA占比16.28％，clpP占比18.60％，hlyD占比 8.14％，hlyⅢ占比12.79％，tolC占比10.47％。

按照上述方法检测噬菌体vB_SheM_PV07对86株海藻希瓦氏菌(V01- V86)的裂解效果。

2、实验结果及分析

从表1的结果可知，噬菌体vB_SheM_PV07可裂解86株海藻希瓦氏菌中的75株，其裂解率达到87.21％，裂解谱宽，应用范围广，在实际应用中具有很好的应用价值。

表1噬菌体vB_SheM_PV07对海藻希瓦氏菌的裂解谱和菌株毒力基因

(三)噬菌体的最佳感染复数(MOI)的测定

1、实验方法：

采用平板涂布法测定宿主菌浓度，并进行两个平行，倒置于25℃温箱中培养16h，培养完成后进行菌落计数，计算宿主菌浓度；

取宿主菌液100μL于5mL LB液体培养基中，按照感染复数分别为1、 0.1、0.01、0.001、0.0001的比例加入噬菌体悬液并混匀，170rpm，25℃振荡培养至液体变清，11000rpm离心5min，测定噬菌体效价。

2、实验结果

如表2所示，感染复数为0.001时，噬菌体的效价最高，最高3.08× 1010PFU/mL，这说明噬菌体vB_SheM_PV07在初始投入量较少时，就能达到最高的繁殖产量，该噬菌体的该项生物学性能有利于规模化工业应用。

表2噬菌体最佳感染复数

(四)噬菌体的热稳定性测定

1、实验方法：

取测定效价为3.08×1010PFU/mL的噬菌体悬液500μL于1.5mL离心管中，分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒温水浴锅中并在 20min、40min、60min分别测定效价。

2、实验结果：

如图2所示，噬菌体vB_SheM_PV07在30℃、40℃、50℃、60℃时经过1h后，其效价并无明显变化；70℃时经过40min作用后基本失活。上述结果说明vB_SheM_PV07噬菌体能够耐受一定程度的高温，且在60℃条件下具的活性较为稳定。

(五)噬菌体的pH稳定性测定

1、实验方法：

取无菌试管中加入4.5mL的不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13)的PBS，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μL 1×10¹⁰PFU/mL的噬菌体增殖液，混匀25℃水浴作用1h、 2h、3h。处理结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的 pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。

2、实验结果：

如图3所示，噬菌体vB_SheM_PV07在pH＝3～12之间，其活性能够保持自身稳定性，仍具有裂解能力，说明该噬菌体对酸碱的耐受范围较大。因此，vB_SheM_PV07在酸碱环境下更加稳定。

(六)噬菌体一步生长曲线的测定

1、实验方法：

按照MOI＝0.001添加噬菌体vB_SheM_PV07增殖液和其宿主菌对数期菌液各1mL，充分混匀并开始计时，室温下温育5min，11000rpm离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用1mL LB液体培养基洗涤1次 (11000rpm，离心30s)，弃上清。用预热的LB液体培养基混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于25℃摇床中170rpm振荡培养，在0 min和每隔10min取出150μL，11000rpm离心1min，吸取100μl的上清用生理盐水10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体效价，做3个重复，结果取平均值。以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的效价的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体的潜伏期、爆发期。

噬菌体的裂解量＝裂解末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度

2、实验结果及分析：

从图4的一步生长曲线可知，噬菌体vB_SheM_PV07的裂解周期时长为 110min：噬菌体感染宿主菌后，40min内效价基本稳定，表明噬菌体潜伏期约为40min；噬菌体侵染宿主菌后的40-80min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体的爆发期约为40min；在随后的30min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。按照上述公式计算，噬菌体的裂解量约为1.61×10¹⁰ PFU/mL/1×10⁸CFU/mL＝161PFU/细胞。由此可见，噬菌体vB_SheM_PV07 潜伏期和裂解期时间较短，同时裂解量较高，在实际应用中用于宿主菌的裂解时，具有用量少、裂解周期短、成效快的优点，较为实用。

(七)噬菌体体外裂解实验

1、实验方法：

将噬菌体悬液与宿主菌按照MOI＝0.001的比例加入100mLLB液体培养基中，临床分离致病性海藻希瓦氏菌菌株V04的终浓度为5.00× 10⁶CFU/mL，噬菌体的终浓度为5.00×10³PFU/mL，对照组加入与噬菌体溶液相同量的无菌LB液体培养基，菌液和噬菌体混合后在25℃，170rpm的摇床内振荡培养，每隔一定的时间测定OD600nm值直至混合液变清亮。

2、实验结果及分析

如图5所示，噬菌体能够有效抑制宿主菌。2h时试验组OD600明显下降，说明菌浓度急剧下降；3.5h时试验组OD600已降至0.3，对照组宿主菌 OD600值在3h时已上升至1.0以上；5h时加入噬菌体悬液的试验组已经显著澄清，而对照组十分浑浊。

实施例3噬菌体vB_SheM_PV07拌料饲喂后对虾体内代谢过程的影响

1、实验方法：

选择体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜，分别设置一组试验组和一组对照组。按照体积与质量比(ml/g)为5％的添加量，将噬菌体vB_SheM_PV07浸泡对虾饲料，均匀混合，噬菌体拌料后效价为 4×10⁸PFU/g，将饲料阴干，再以对虾体重5％的剂量饲喂实验组的对虾，对照组按照同样剂量用PBS缓冲液浸泡饲料后饲喂。喂食后在0.5、6、24、 48、72、96、120、144h检测实验组和对照组的对虾肠道、肝胰腺以及对虾体内噬菌体的含量。

2、实验结果及分析：

饲喂浸泡过噬菌体vB_SheM_PV07的虾料0.5h后，实验组的虾体肠道、肝胰腺内即检测到噬菌体的存在，噬菌体效价可达3.17×10⁶PFU/g，这说明噬菌体可以通过喂食进入虾体内，且噬菌体可持续存在2d以上，这对噬菌体作为水产饲料添加剂具有指导作用，且可用于预防和治疗海藻希瓦氏菌病。实验结果也显示，对虾的运动状态、应激反应、摄食行为正常，与对照组无差别，说明噬菌体对南美白对虾的健康无影响，噬菌体安全性良好。

实施例4噬菌体vB_SheM_PV07预防海藻希瓦氏菌感染南美白对虾效果测定

1、实验方法：准备体重5g左右健康的南美白对虾，实验前禁食一天。每组50只，设置两组试验组、一组对照组以及一组空白对照组。对其进行以下处理：

空白对照组以对虾体重5％的剂量饲喂普通饲料；对照组按照用体积与质量比(ml/g)为5％的添加量，使用PBS缓冲液浸泡饲料后饲喂；试验组按照相同添加量，将噬菌体vB_SheM_PV07浸泡对虾饲料，均匀混合，噬菌体拌料后效价为1×10⁸PFU/mL，阴干后向试验组对虾饲喂上述混有噬菌体的对虾饲料。

首次饲喂1h后给试验组和对照组对虾浸浴浓度为1×10⁵CFU/mL海藻希瓦氏菌，空白对照组不做处理。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体结果见下表3。

表3噬菌体拌料对海藻希瓦氏菌的预防效果

2、实验结果及分析

上述表3的结果显示，试验组的保护率高于86％，这说明噬菌体 vB_SheM_PV07作为水产饲料添加剂添加入南美白对虾的饲料中，能有效预防对虾感染海藻希瓦氏菌而导致的疾病，大幅度地降低南美白对虾的死亡率，提高其成活率，降低养殖风险。

实施例5噬菌体vB_SheM_PV07治疗海藻希瓦氏菌感染南美白对虾效果的测定

1、实验方法：

体重5g左右健康的南美白对虾，实验前禁食一天。每组50只，试验组设置两组，设置一组对照组和一组空白对照组。给试验组和对照组对虾浸浴海藻希瓦氏菌，剂量为1×10⁵CFU/mL。攻毒1h后，饲喂混合有噬菌体的饲料。投喂的饲料按照体积与质量比(ml/g)为5％的添加量，将噬菌体与对虾饲料浸泡混合，混合后效价为1×10⁸PFU/mL，阴干后以对虾体重5％的剂量饲喂。对照组按照同样剂量用PBS缓冲液浸泡饲料后饲喂。同时空白对照组不做任何处理。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体测试结果见表4。

表4噬菌体拌料对海藻希瓦氏菌疾病的治疗效果

2、实验结果及分析：

对照组的对虾死亡率高达82％，而试验组中，对虾死亡率低至12- 16％，噬菌体拌料对对虾的保护率达到84-88％；由此可见，噬菌体 vB_SheM_PV07对南美白对虾的海藻希瓦氏菌病具有很好的治疗效果，可大幅度提高对虾的存活率。

实施例6噬菌体vB_SheM_PV07对非宿主性细菌的裂解试验

1、实验方法

选取20株溶藻弧菌、10株副溶血弧菌、10株哈维氏弧菌，共40株不同类型的非宿主性细菌，按照前述裂解谱的测定方法进行噬菌体 vB_SheM_PV07的裂解谱的测定实验。

2、实验结果及分析

结果显示，该噬菌体与40株非宿主性细菌的双层平板中都未发现透亮噬菌斑，这表明噬菌体vB_SheM_PV07均无法识别上述这些非宿主性细菌，这说明供试噬菌体具有极强的宿主特异性，且对微生物群落无损伤作用，可用于制备检测试剂盒。

实施例7噬菌体vB_SheM_PV07的环境消毒试验

1、实验方法

取20L对虾养殖水体，分为一组对照组，三组实验组，每组5L。实验组均加入终浓度为1×10¹⁰PFU/mL的噬菌体vB_SheM_PV07，对照组加入等体积的PBS缓冲液。在试验前以及噬菌体加入后4h、8h、12h、16h、20h、 24h进行取样，采用TCBS平板测定水体中菌浓度。

2、实验结果及分析

由图6可知，对照组菌浓度试验前与试验后基本保持一致，未发生明显变化，而三组实验组在噬菌体加入8h时水体菌浓度出现明显降低，并在24h 内未出现升高现象，这表明噬菌体vB_SheM_PV07对对虾养殖环境有明显杀菌消毒效果，可用做水体环境改良剂。

从上述实施例的结果可知，本发明的海藻希瓦氏菌噬菌体对虾的海藻希瓦氏菌病具有很好的预防和治疗效果，可利用该噬菌体制备抗海藻希瓦氏菌的药物，为治疗海藻希瓦氏菌感染引起的疾病提供新的理论依据和实践经验。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一株海藻希瓦氏菌噬菌体，其特征在于，该噬菌体被命名为vB_SheM_PV07，其保藏编号为CGMCC No.22378。

2.一种噬菌体组合物，其特征在于，其包括如权利要求1所述的海藻希瓦氏菌噬菌体。

3.如权利要求1所述的海藻希瓦氏菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物在制备用于防治海藻希瓦氏菌感染的疾病的药物或水产饲料添加剂的应用；优选地，海藻希瓦氏菌感染的疾病包括由海藻希瓦氏菌感染引发的水产的疾病；优选地，所述疾病选自溃疡病、黑斑病、吻肿病、细菌性肠炎、腹水病或肾肿大症。

4.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，其有效成分包括如权利要求1所述的海藻希瓦氏菌噬菌体或如权利要求3所述所述的噬菌体组合物；优选地，所述药物制剂还包括其他抑菌或杀菌活性成分；优选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。

5.一种水产饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的海藻希瓦氏菌噬菌体或如权利要求3所述噬菌体组合物；优选地，水产饲料添加剂中海藻希瓦氏菌噬菌体的浓度为1×10⁸PFU/g以上。

6.一种水体消毒剂，其特征在于，有效成分包括如权利要求1所述的海藻希瓦氏菌噬菌体或如权利要求3所述噬菌体组合物；优选地，所述水体消毒剂还包含其他用于抑制或消灭环境中细菌的活性成分。

7.如权利要求6的水体消毒剂在用于杀灭环境中的海藻希瓦氏菌中的应用。

8.一种检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的海藻希瓦氏菌噬菌体或如权利要求3所述噬菌体组合物。

9.权利要求8所述的检测试剂盒在用于检测海藻希瓦氏菌中的用途。

10.一种用于水产品保鲜、消毒的生物抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的海藻希瓦氏菌噬菌体或如权利要求3所述噬菌体组合物。

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