CN115181731B - 一株坎贝氏弧菌噬菌体、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株坎贝氏弧菌噬菌体、制备方法及其应用，该噬菌体被命名为vB_CamP_PU01，于2020年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，其保藏编号为CGMCC No.20716。该噬菌体对坎贝氏弧菌具有高效的裂解活性，噬菌体培养物及其制剂能够作为生物抑菌剂控制坎贝氏弧菌的繁殖，极大地降低由于坎贝氏弧菌引起的弧菌病的发生概率，应用范围广，有益于水产养殖业的健康发展。

Description

一株坎贝氏弧菌噬菌体、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，尤其涉及一株坎贝氏弧菌噬菌体、制备方法及其应用。
背景技术
细菌性疾病在水产养殖过程中是十分常见的疾病类型，弧菌是海洋生物最为常见，流行范围最广，影响最大的一类细菌病。坎贝氏弧菌是海洋环境及水产品中常见菌，是水产养殖动物中致病菌之一，也是引起虾急性肝胰腺坏死病的病原菌之一。坎贝氏弧菌可引起鱼、虾和贝的大量死亡，对水产养殖业造成一定的经济损失。
由于细菌性疾病的传播速度快、病死率高，而且治疗方法匮乏，仅有抗生素能够抑制细菌病的爆发，所以造成了抗生素滥用的普遍现象，使细菌对大部分抗生素产生耐药性。并且抗生素大量使用会导致抗生素残留，影响食品健康，威胁生态平衡。
针对以上问题，噬菌体慢慢走进人类的认知。噬菌体是一类专门针对细菌的病毒，特别是烈性噬菌体，能够侵入宿主细菌，将其裂解。噬菌体依靠其专一性强、无毒副作用等特点，将逐渐代替抗生素药物，或可成为可持续发展的有效手段。
但是，目前还没有出现广谱的坎贝氏弧菌噬菌体，可用于防治由于弧菌感染导致的各类疾病，因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株宽裂解谱的坎贝氏弧菌噬菌体vB_CamP_PU01及其应用：该噬菌体对坎贝氏弧菌具有强裂解作用，该制剂可以单独或复配使用，能够有效抑制水产品在养殖或储运加工过程中坎贝氏弧菌的繁殖与代谢，该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性弧菌的问题。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供了一株坎贝氏弧菌噬菌体vB_CamP_PU01，该噬菌体自山东省烟台市某码头采的污水中分离得到的，已于2020年11月09日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20716。
电镜下观测到：该噬菌体头部长为74～76nm，头宽为70～72nm，尾长10～15nm根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于短尾噬菌体科，将其命名为vB_CamP_PU01。
第二方面，本申请还提供了上述坎贝氏弧菌噬菌体在制备用于预防或治疗因坎贝氏弧菌感染导致疾病的药物中的应用。
优选的，上述坎贝氏弧菌感染的疾病包括由坎贝氏弧菌感染引发的各种水产疾病。
优选地，所述坎贝氏弧菌选自多种海水水产，更优选地选自海水产的鱼类、虾类、蟹类、螺类或贝类的至少一种。
第三方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的坎贝氏弧菌噬菌体vB_CamP_PU01。用于制备防治水产品坎贝氏弧菌病的产品。
优选地，所述噬菌体组合物中坎贝氏弧菌噬菌体vB_CamP_PU01作为唯一活性成分，或与其他坎贝氏弧菌噬菌体进行复配。
优选地，上述坎贝氏弧菌噬菌体选自噬菌体vB_CamP_PU01的突变体中的一种或多种；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90％，且保持基本相同的抑菌活性。
由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地进行同源性的测定，vB_CamP_PU01的突变体与该噬菌体的天然序列同源性至少达到90％。
更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，vB_CamP_PU01的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。上述噬菌体的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第四方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分主要为上述的坎贝氏弧菌噬菌体或上述噬菌体组合物。
可选地，上述噬菌体药物制剂的剂型为口服给药剂型、浸浴给药剂型，优选地，采用口服给药剂型。上述药物制剂的剂型具体为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂、冻干剂。浸浴给药剂型是通过将噬菌体制剂直接投放于水产养殖水体中进行给药的方式，操作简单，效果好。
可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。
第五方面，本发明还提供一种水产饲料添加剂，其包括如上所述的坎贝氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物。通过与水产饲料进行混拌后，对水产(如对虾)进行饲喂，从而达到预防或治疗坎贝氏弧菌病的效果。优选地，种水产饲料添加剂中每种噬菌体的效价为1×109PFU/g以上。
第六方面，本发明还提供一种水体消毒剂，其有效成分主要为所述的坎贝氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物；优选地，噬菌体的效价为1×106PFU/mL以上。水体消毒剂还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分或其他助剂，如能延长噬菌体持效期的助剂。
上述水体消毒剂可用于水产养殖场所的环境消毒和饲料消毒防腐，可用于代替抗生素或传统消毒产品，且所述噬菌体及其环境消毒剂的代谢产物不会对人体或其他动物造成损害。所述消毒剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲料等进行全面的消毒。所述养殖环境包括池壁和水体等。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。
第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的坎贝氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物。
第八方面，本发明还提供上述检测试剂盒在用于坎贝氏弧菌噬菌体中的用途。
本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用上述坎贝氏弧菌噬菌体或其噬菌体组合物制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的坎贝氏弧菌，或用于防控由其宿主弧菌侵染导致的疾病。
第九方面，本发明还提供用于水产品消毒的生物抑菌剂，其有效成分主要为上述坎贝氏弧菌噬菌体或噬菌体组合物。生物抑菌剂的使用方法为：对水产品的生鲜产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中坎贝氏弧菌的增殖。
在本发明中，坎贝氏弧菌噬菌体被命名为vB_CamP_PU01，于2020年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCCNo.20716。
本发明具有以下有益效果：
1、该噬菌体对坎贝氏弧菌具有较强的裂解作用(裂解率高达80％)，可以有效防控水产养殖场弧菌病，极大地降低由于坎贝氏弧菌引起的疾病的病发概率；还可以用于对水产养殖场环境、饲料、水体等进行全面的弧菌的消毒，极大地降低了弧菌引起的水产品发病率和死亡率。
2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。可广泛用于水产养殖过程中的容易因致病性坎贝氏弧菌感染造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及水产生鲜食品的抑菌等方面，有益于水产养殖业的健康发展。
附图说明
图1为噬菌体vB_CamP_PU01的电镜照片；
图2为噬菌体vB_CamP_PU01的热稳定性结果；
图3为噬菌体vB_CamP_PU01的pH稳定性结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。
本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。
实施例1噬菌体的分离培养
(一)宿主菌悬液的制备：
宿主菌U001在TCBS平板上分区划线，挑单菌落接种于5mL 2216E液体培养基中，170rpm、37℃条件下增殖至对数生长期，得到新鲜菌液。
(二)噬菌体的分离和纯化
(1)噬菌体的分离
将取自山东省烟台市某码头采的污水进行11000r/min，5min离心，将离心得到的上清液使用0.22μm滤膜过滤后，加入2216E培养基与100μL的宿主菌悬液，在170rpm、37℃的条件下培养16h后，再于11000r/min的条件下离心5min，最后用0.22μm滤膜过滤后，得到噬菌体原液。
将噬菌体原液用1×PBS溶液进行10倍倍比稀释，得到10-2、10-4、10-6、10-8稀释液后，分别取上述不同浓度稀释液各100μL与制备好的坎贝氏弧菌悬液混合后在37℃孵育5min后，加入5mL的NB上层培养基中，混匀后迅速倒入2216E培养基平板中，待其凝固后倒置于37℃温箱中培养16h后观察，得到噬菌斑。
(2)噬菌体的纯化
用无菌镊子抠取单个噬菌斑，置于1mL PBS溶液中放置于170rpm，37℃摇床中浸出30min，将浸出液稀释至合适浓度，按照1:1的比例与坎贝氏弧菌混合，37℃孵育5min，混合液加入5mL NB上层培养基中，混匀后迅速倒入2216E培养基平板中，待其凝固后倒置37℃温箱中培养16h后得到纯化1代噬菌体。纯化3～5代，得到形态一致的噬菌斑。
(3)噬菌体悬液的制备
抠取纯化3代后的单个噬菌斑，置于1mL PBS溶液中，170rpm、37℃摇床中浸出30min。
将噬菌体浸出液与宿主菌悬液按照1:1的比例加入5mL 2216E液体培养基中，置于170rpm、37℃摇床中振荡增殖4h，对所得增殖液11000rpm离心5min，上清液用0.22μm细菌滤器过滤，得到噬菌体悬液。
(三)噬菌体效价的测定
将上述噬菌体悬液使用PBS缓冲液进行10倍稀释，使用双层平板法测定稀释至10-6与10-7的噬菌体效价，两个平行。培养后对噬菌斑计数并计算效价。测定得到，所述噬菌体悬液效价为5.9×1010PFU/mL。
实施例2噬菌体的生物学特性测定
(一)噬菌体的电镜检测
取20μl的效价为1010PFU/mL的噬菌体滴在铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸染色30min，干燥后电镜观察。
结果如图1所示，该噬菌体头部长为74～76nm，头宽为70～72nm，尾长10～15nm根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于短尾噬菌体科，将其命名为vB_CamP_PU01。
(二)噬菌体的裂解谱测定
实验方法：本实施例采用双层平板法测定噬菌体裂解谱，将噬菌体悬液分别与坎贝氏弧菌菌液各取100μL加入0.5mL离心管中混合，37℃孵育5min后加入5mL NB上层培养基中混匀，迅速倒入2216E培养基平板中，待其冷凝后倒置于37℃温箱中培养16h，培养完成后取出平板观察有无噬菌斑形成来鉴别能否裂解。
通过上述方法检测噬菌体vB_CamP_PU01对20株不同坎贝氏弧菌的裂解能力。其中，这20株坎贝氏弧菌分别来源于山东滨州、山东海阳、山东青岛、福建漳州、广东湛江病死鱼虾及水样；从表1的结果可知，噬菌体vB_CamP_PU01能够裂解20株坎贝氏弧菌中的16株，噬菌体的裂解率达到80％。
表1噬菌体vB_CamP_PU01对坎贝氏弧菌的裂解谱
(三)噬菌体的最佳感染复数的测定
采用平板涂布法测定宿主菌浓度，并进行两个平行，倒置于37℃温箱中培养16h，培养完成后进行菌落计数，计算宿主菌浓度。
取宿主菌液100μL于5mL 2216E液体培养基中，按照感染复数分别为1、0.1、0.01、0.001、0.0001的比例加入噬菌体悬液并混匀，170rpm，37℃振荡培养至液体变清，11000rpm离心5min，测定噬菌体效价。
结果如表2所示，感染复数为0.001时，噬菌体的效价最高，最高为6.98×1010PFU/mL。
表2噬菌体最佳感染复数
(四)噬菌体的热稳定性测定
取测定效价为1×1010PFU/mL的噬菌体悬液500μL于1.5mL离心管中，分别放置于50℃、60℃、70℃的恒温水浴锅中并在20min、40min、60min分别测定效价。
结果如图2所示，噬菌体vB_CamP_PU01在50℃、60℃时经过1h后，其效价并无明显变化；而该噬菌体在70℃下经40min作用后存活率显著降低，经过1h作用后便基本失活，说明vB_CamP_PU01噬菌体能够耐受一定程度的高温，60℃以下较稳定。
(五)噬菌体的pH稳定性测定
取无菌试管中加入4.5mL的不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的PBS，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μL 1010PFU/mL的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。处理结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
结果如图3所示，噬菌体vB_CamP_PU01在pH＝3～11之间能够保持自身稳定性，仍具有裂解能力；而该噬菌体对强酸强碱较为敏感，在pH低于3或高于11的强酸强碱条件下，噬菌体基本完全失活。因此，vB_CamP_PU01能够耐受一定的酸碱环境。
实施例3噬菌体拌料饲喂后虾体内代谢过程
实验方法：选择体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜。分别设置实验组和对照组，按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体vB_CamP_PU01与对虾饲料均匀混合，噬菌体拌料后效价为8.9×109PFU/g，将饲料阴干，再以对虾体重3％的剂量饲喂实验组的对虾，对照组按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。喂食后0.5、2、6、12、24、48、72、96、120、144h检测虾肠、肝胰腺以及空白对照组正常对虾体内噬菌体的含量。
实验结果说明：饲喂浸泡过噬菌体vB_CamP_PU01的虾料0.5h后，实验组的虾体肠道、肝胰腺内即检测到噬菌体的存在，效价可达7.35×108PFU/g，噬菌体可以通过喂食进入虾体内，且噬菌体可持续存在2d以上，这对噬菌体作为水产饲料添加剂具有指导作用，且可用于预防和治疗水生动物的弧菌病。实验结果还表明，实验组对虾生长状态良好，噬菌体具有无毒害的性质，安全性极佳。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一株坎贝氏弧菌噬菌体，其特征在于，被命名为vB_CamP_PU01，其保藏编号为CGMCCNo.20716。
2.如权利要求1所述的坎贝氏弧菌噬菌体在制备用于预防或治疗坎贝氏弧菌感染的疾病的药物中的应用。
3.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的坎贝氏弧菌噬菌体vB_CamP_PU01。
4.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，其有效成分包括如权利要求1所述的坎贝氏弧菌噬菌体或权利要求3所述的坎贝氏弧菌噬菌体组合物。
5.根据权利要求4所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
6.一种水产饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的坎贝氏弧菌噬菌体或权利要求3所述的坎贝氏弧菌噬菌体组合物。
7.权利要求6所述的水产饲料添加剂，其特征在于，水产饲料添加剂中坎贝氏弧菌噬菌体的浓度为1×109PFU/g以上。
8.一种水体消毒剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1所述的坎贝氏弧菌噬菌体或权利要求3所述的坎贝氏弧菌噬菌体组合物。
9.如权利要求8的消毒剂的应用，其特征在于，所述消毒剂用于杀灭环境中的坎贝氏弧菌。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述环境为水池、饲养环境、料台、饲养器具或循环水养殖系统。
11.一种用于水产品消毒的生物抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的坎贝氏弧菌噬菌体或权利要求3所述的坎贝氏弧菌噬菌体组合物。
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