CN114763539B - 一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用，该弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，被命名为PRF01，其已于2022年01月07日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.45075。本发明还提供一种噬菌体组合物，包括上述弗氏柠檬酸杆菌噬菌体。该弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、噬菌体组合物可应用于制备用于防治因弗氏柠檬酸杆菌感染导致疾病的药物、水产饲料添加剂或环境消毒剂。该噬菌体对弗氏柠檬酸杆菌具有优异的裂解性能，裂解谱宽，应用范围广，无副作用，可有效防治因弗氏柠檬酸杆菌造成的感染以及与水体中因上述病原菌大量增殖引起的各种水体问题。

Description

一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用。
背景技术
弗氏柠檬酸杆菌是肠杆菌科柠檬酸杆菌属(Citrobacter Werkman and Gillen)的革兰氏阴性短杆菌，该菌周身有鞭毛、无荚膜、生长能力强，是一种典型的人、畜、鱼共患病的条件性致病菌。在水产动物中，弗氏柠檬酸杆菌最早是从翻车鱼(Mola mola)中分离得到的，被感染的翻车鱼均出现出血性皮疹和肾脏多发性肉芽肿瘤的症状。
近年来，由于弗氏柠檬酸杆菌具有强大的增殖感染能力，已经影响了许多水生动物的健康。研究证明弗氏柠檬酸杆菌易感染克氏原螯虾，造成败血症。同时多个研究均证实了弗氏柠檬酸杆菌能引起鱼发病，先后有弗氏柠檬酸杆菌导致大西洋鲑鱼、虹鳟、鲑鱼、锦鲤、斑马鱼、鲟鱼等发病的报道，病鱼主要表现竖鳞、皮肤腐烂、腹腔积液和肛门红肿等症状。弗氏柠檬酸杆菌对大鲵等两栖动物也存在致病性，染病后会导致出现腹水和皮下出血症状。甚至弗氏柠檬酸杆菌作为哺乳动物肠道正常菌群，在一定条件下会成为条件性致病菌，引起动物的腹泻。
目前，现有方法主要是采用传统的抗生素类药物来防治海产品中由弗氏柠檬酸杆菌感染引发的疾病，但是抗生素的过度使用不仅容易导致耐药病原菌的产生，并且也会对水体造成污染，因此，需要寻找更安全有效的抗生素替代物。
噬菌体(Bacteriophage或Phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物病毒的总称，其体积微小、结构简单，不具备细胞结构，分布十分广泛，凡是细菌存在之处几乎都有相应的噬菌体。噬菌体是病毒的一种，其特别之处是噬菌体只针对其特定的细菌病原菌作为宿主，不会破坏正常菌群，专一性强；并且噬菌体无残留、无毒害、具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内，其降解终产物为氨基酸和核苷酸对人和动物无影响。因此，噬菌体具有无残留、无毒害、使用安全的优点，可作为抗生素替代物用于防治弗氏柠檬酸杆菌病。
但是，目前还未发现可用于防治弗氏柠檬酸杆菌病的噬菌体资源。因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体PRF01、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体不仅可用于制备用于防治因弗氏柠檬酸杆菌感染导致的疾病的药物，还可作为活性成分，用于制备环境消毒剂、水产饲料添加剂以及水产品生物抑菌剂等。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，可有效解决因弗氏柠檬酸杆菌造成的感染、以及与水体中因上述病原菌大量增殖引起的水体问题。
为解决上述问题，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体PRF01，该噬菌体分离自海南省海口市某湾区污泥，已于2022年01月07日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.45075。
电镜下观测到：该噬菌体的头部长为73nm，直径约为68nm，尾长约为63nm，具有伸缩性尾鞘，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy ofViruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于肌尾噬菌体科，将其命名为PRF01。
该噬菌体对弗氏柠檬酸杆菌具有优异的裂解性能，经过实验证明，其对弗氏柠檬酸杆菌的裂解率达到86.76％，裂解谱宽，应用范围广，这说明其在杀灭环境中弗氏柠檬酸杆菌以及防治弗氏柠檬酸杆菌病方面具有很好的应用前景。
该噬菌体在30℃～60℃温度范围内1h处理能保证效价不变，具有较好的温度稳定性。该噬菌体在pH＝3～11条件下处理3h后仍能够保持自身稳定性，耐酸碱性能好，能适应较为苛刻的酸碱环境，基于其上述优异的生物学特性，其适应范围广。
本申请中，噬菌体PRF01包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％且保持基本相同的杀菌活性的突变株。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。噬菌体PRF01的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第二方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体PRF01。
优选地，在实际应用中，为进一步拓宽噬菌体制剂的裂解谱，充分发挥不同噬菌体的裂解谱差异，进行优势互补，可将上述弗氏柠檬酸杆菌噬菌体PRF01与其他噬菌体进行组合使用，如与其他弗氏柠檬酸杆菌噬菌体组合用于扩大对弗氏柠檬酸杆菌的裂解谱；此外，也可将噬菌体PRF01与其他不同种类的噬菌体(抑制引发同类疾病的不同病原菌)配合，提高对同一类疾病的防治效果。
第三方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分上述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体PRF01或上述噬菌体组合物。优选地，所述噬菌体药物制剂还包括其他相配合的抑菌或杀菌活性成分。
可选地，上述噬菌体药物制剂还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)、丸剂、胶囊、粒剂或片剂。
所述噬菌体药物制剂的剂型为溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。优选地，所述噬菌体药物制剂采用溶液剂。溶液剂是通过浸浴给药将噬菌体药物制剂直接投放于水产养殖水体中进行给药的方式，这种使用方式具有操作简单、效果好的优点。
第四方面，本申请还提供了上述弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、上述噬菌体组合物以及上述噬菌体药物制剂在制备用于防治因弗氏柠檬酸杆菌感染导致疾病的药物、水产饲料添加剂或环境消毒剂中的应用。
本文中术语“防治”是指“预防和治疗”。“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
所述疾病包括由弗氏柠檬酸杆菌感染引起的人类疾病、各类动物(包括水产)疾病等。
优选地，弗氏柠檬酸杆菌感染导致的疾病为由弗氏柠檬酸杆菌感染引发的水产的疾病；更优选地，所述由弗氏柠檬酸杆菌感染引发的水产的疾病选自败血病、血性皮疹、肾脏多发性肉芽肿瘤、细菌性肠炎、腹水病。更优选地，所述水产选自海水水产；更优选地，所述海水水产包括克氏原螯虾、大西洋鲑鱼、虹鳟、鲑鱼、大菱鲆、锦鲤等养殖品种。后续具体实施方式中仅以克氏原螯虾作为示例进行说明，并不将应用范围仅限于克氏原螯虾的弗氏柠檬酸杆菌病的防治。
由于上述疾病是由于感染弗氏柠檬酸杆菌所导致，因此，对弗氏柠檬酸杆菌具有高效特异的裂解效果的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，对这些疾病具有预防和治疗效果是可以预期的，并且实验结果也证明该结论。
第五方面，本发明还提供一种水产饲料添加剂，其包括如上所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体或上述噬菌体组合物。通过将所述水产饲料添加剂与水产饲料进行混拌后，对水产动物进行饲喂，从而达到预防或治疗弗氏柠檬酸杆菌病的效果。
优选地，饲料中每种噬菌体的效价为1×108PFU/g以上。该条件下，饲料添加剂的效果更好。
第六方面，本发明还提供一种环境消毒剂，其有效成分主要为所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体或前述噬菌体组合物；优选地，噬菌体的效价为1×104PFU/mL以上。水体消毒剂还包含其他用于环境中细菌抑制或消灭的活性成分或其他佐剂；更优选地，所述佐剂包括能延长噬菌体有效期的佐剂。所述需进行消毒处理的环境包括池壁、水体、饲养环境、料台、饲养器具、循环水养殖系统等。
第七方面，本发明还提供上述环境消毒剂在用于杀灭环境中的弗氏柠檬酸杆菌中的应用。
具体地，上述环境消毒剂可用于水产养殖场所的环境消毒、水体消毒和饲料消毒防腐，防止环境中弗氏柠檬酸杆菌的污染，可用于代替抗生素或传统消毒产品，且所述噬菌体及代谢产物不会对人体或其他动物造成损害。该环境消毒剂可通过喷雾、浸泡等方式对养殖环境、饲料、饲养器具等进行弗氏柠檬酸杆菌消毒。所述环境包括池壁、水体、饲养环境、料台、饲养器具、循环水养殖系统等。
第八方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体或前述噬菌体组合物。实验证明，噬菌体PRF01对宿主菌具有很高的裂解特异性，本发明的噬菌体PRF01可应用于样品中弗氏柠檬酸杆菌的快速检测，其包括但不限于以试纸或试纸盒等不同形式对临床样本中的病原菌进行检测，该检测方法简单、灵敏度高。
第九方面，本发明还提供上述检测试剂盒在用于检测弗氏柠檬酸杆菌中的用途。
第十方面，本发明还提供用于一种水产品生物抑菌剂，其有效成分主要为上述弗氏柠檬酸杆菌噬菌体或噬菌体组合物。该水产品生物抑菌剂的使用对水产品具有消毒和保鲜作用。使用时，可将所述生物抑菌剂以浸泡或者喷雾的方式对生鲜水产品进行处理，从而达到抑制产品加工、运输或保鲜过程中弗氏柠檬酸杆菌的增殖，达到消毒保鲜效果。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的噬菌体PRF01是首次分离的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，其对弗氏柠檬酸杆菌具有较强的裂解作用，裂解率高达86.76％，可有效防控水产养殖场中因弗氏柠檬酸杆菌导致的人类疾病、各类动物(尤其是水产)疾病，极大地降低引起的弗氏柠檬酸杆菌病的病发概率，如皮肤腐烂、皮下出血、败血病等。此外，该噬菌体还可用于对水产养殖场环境、饲料、水体等进行全面的弗氏柠檬酸杆菌的消毒，极大地降低了由该病原菌引起的水产品发病率和死亡率，还可用于生鲜水产品的保鲜，应用方式多样化。
2、所述噬菌体PRF01具有酸碱稳定性和热稳定性高的优点，其在30℃～60℃温度范围内1h处理能保证效价不变，具有较好的温度稳定性；该噬菌体在pH＝3～11条件下处理3h后仍能够保持自身稳定性，耐酸碱性能好，能适应较为苛刻的酸碱环境；同时，该噬菌体的繁殖能力强，易于进行工业化生产的优点；该噬菌体可广泛用于水产养殖过程中的容易因感染弗氏柠檬酸杆菌造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及水产生鲜食品的抑菌等方面，有益于水产养殖业的健康发展。
3、该弗氏柠檬酸杆菌噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，用以解决因弗氏柠檬酸杆菌造成的感染、以及因上述病原菌大量增殖引起的水体问题，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性弗氏柠檬酸杆菌的问题。而由该噬菌体制备的药物、消毒剂或保鲜剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。
附图说明
图1为噬菌体PRF01的电镜照片；
图2为噬菌体PRF01的热稳定性结果；
图3为噬菌体PRF01的pH稳定性结果；
图4为噬菌体PRF01的一步生长曲线；
图5为噬菌体PRF01的体外裂解实验结果；
图6为噬菌体PRF01的环境消毒实验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1噬菌体的分离培养
(一)宿主菌悬液的制备
将弗氏柠檬酸杆菌RF03在TSA平板上进行三区划线，37℃下倒置培养16h，获得均匀的单菌落，挑单菌落并将其接种入5mL的TSB液体培养基中，于170rpm、37℃条件下增殖至对数生长期，得到新鲜宿主菌菌液。
(二)噬菌体的分离和纯化
1、噬菌体的分离
将取自海南省海口市某湾区采集的污泥加入泡样瓶中，并加入约150mL双蒸水混匀，加入200μL菌液与50mL TSB溶液混匀，37℃富集24h；富集结束后，11000r/min离心10min，将上清经0.22um过滤器过滤，获得噬菌体原液。
将该噬菌体原液用1×PBS溶液分别先后进行10倍比的稀释，分别得到稀释度为10-2、10-4、10-6、10-8的稀释液后，分别取上述不同浓度稀释液各100μL与制备好的弗氏柠檬酸杆菌悬液混合后在37℃孵育10min后，加入到5mL的NB上层培养基中，混匀后迅速倒入TSA培养基平板中，待其凝固后倒置于37℃温箱中培养16h后观察，得到噬菌斑。
2、噬菌体的纯化
用无菌镊子抠取单个噬菌斑，置于1mL PBS溶液后放置于170rpm、37℃摇床中浸出30min，将浸出液稀释100倍，按照1:1的体积比例与弗氏柠檬酸杆菌混合，37℃孵育10min，混合液加入5mL NB上层培养基中，混匀后迅速倒入TSA培养基平板中，待其凝固后倒置37℃温箱中培养16h后得到纯化1代噬菌体。按照上述方法纯化3-5代，得到形态一致的噬菌斑。
3、噬菌体悬液的制备
取按照上述方法纯化3代后的噬菌体平板，抠取单个噬菌体，置于1mL PBS溶液中捏碎，于170rpm、37℃摇床中浸出30min，得到噬菌体浸出液。
取宿主菌悬液100μL加入5mL TSB液体培养基中，将所述噬菌体浸出液与宿主菌悬液以体积比1:1的比例加入到上述培养基中，置于170rpm、37℃摇床中振荡增殖4-5h，对所得增殖液11000rpm离心5min，上清液用0.22μm细菌滤器过滤，得到噬菌体悬液。
(三)噬菌体效价的测定
将上一步制备得到的噬菌体悬液使用PBS缓冲液进行10倍稀释，使用双层平板法测定稀释度为10-6与10-7的噬菌体效价，设置两个平行。培养后对噬菌斑进行计数并计算效价。
测定得到，所述分离的噬菌体悬液的效价为4.25×109PFU/mL。
实施例2噬菌体的生物学特性测定
(一)噬菌体的电镜检测
1、实验方法：
取20μL的效价为109PFU/mL的待测噬菌体滴在铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸染色30min，干燥后电镜观察。
2、实验结果及分析
如图1所示，该噬菌体的头部长为73nm，直径约为68nm，尾长约为63nm，具有伸缩性尾鞘，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy ofViruses，ICTV)第九次报告的分类标准鉴定，可确定该噬菌体属于肌尾噬菌体科，将其命名为PRF01。
(二)噬菌体的裂解谱测定
1、宿主菌：
本实施例中的宿主菌为分别来源于江苏盱眙、湖北潜江、江西鄱阳、山东烟台、山东青岛的病死克氏原螯虾、大菱鲆及水样的68株弗氏柠檬酸杆菌，菌株命名分别为RF01～RF68。这些宿主菌中的致病菌存在于水体中可引发水产动物因感染弗氏柠檬酸杆菌导致的疾病。
2、实验方法
(1)毒力基因的检测
对这68株菌进行PCR毒力基因检测，鉴定其是否携带定居因子抗原基因(cfa)、耐热肠毒素基因(ST)、志贺毒素(SLT)基因、β-内酰胺酶基因(blaCTX-M-1、blaSHV-12)这5种毒力基因，检测结果见下表1。通过对上述68株弗氏柠檬酸杆菌的毒力基因的检测，可判断出这些菌株的致病性。
(2)裂解谱的测定
本实施例采用双层平板法测定噬菌体裂解谱，将噬菌体悬液分别与各宿主菌弗氏柠檬酸杆菌菌液各取100μL加入0.5mL离心管中混合，37℃孵育5min后加入5mL NB上层培养基中混匀，迅速倒入TSA下层固体培养基平板中，待其冷凝后倒置于37℃温箱中培养16h，培养完成后，取出平板，通过观察平板有无噬菌斑形成来鉴别该噬菌体PRF01能否裂解各宿主菌。
3、实验结果及分析
(1)68株弗氏柠檬酸杆菌的毒力基因检测结果显示，携带定居因子抗原基因(cfa)的菌株数占总数的7.35％，携带耐热肠毒素基因(ST)的菌株占比10.29％，携带志贺毒素(SLT)的菌株占比13.24％，携带β-内酰胺酶基因blaCTX-M-1的菌株占比8.82％，携带β-内酰胺酶基因blaSHV-12的菌株占比8.82％，具体见表1。
(2)从表1的结果可知，噬菌体PRF01可裂解这68株弗氏柠檬酸杆菌中的59株，其裂解率达到86.76％，裂解谱宽，应用范围广，在实际应用中具有很好的应用价值。
表1噬菌体PRF01对弗氏柠檬酸杆菌的裂解谱
Figure BDA0003654426010000101
Figure BDA0003654426010000111
Figure BDA0003654426010000121
Figure BDA0003654426010000131
Figure BDA0003654426010000141
(三)噬菌体的最佳感染复数的测定
1、实验方法
采用平板涂布法测定宿主菌浓度，并进行两个平行，倒置于37℃温箱中培养16h，培养完成后进行菌落计数，计算宿主菌浓度。
取宿主菌液100μL于5mL TSA液体培养基中，按照感染复数分别为1、0.1、0.01、0.001、0.0001的比例加入噬菌体悬液并混匀，170rpm，37℃振荡培养至液体变清，11000rpm离心5min，测定噬菌体效价。
2、实验结果及分析
如表2所示，感染复数为0.001时，噬菌体的效价最高，最高2.34×1010PFU/mL，这说明噬菌体PRF01在初始投入量较少时，就能达到最高的繁殖产量，该噬菌体的该项生物学性能说明其在规模化工业生产时具有竞争优势，有利于降低工业化生产成本。
表2噬菌体最佳感染复数
Figure BDA0003654426010000151
(四)噬菌体的热稳定性测定
1、实验方法
分别取测定效价为4.62×109PFU/mL的噬菌体悬液500μL于6支1.5mL离心管中，将各离心管分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴锅中，并在第20min、40min、60min分别测定各管中的噬菌体的效价。
2、实验结果及分析
如图2所示，噬菌体PRF01在30℃、40℃、50℃、60℃时经过1h后，其效价并无明显变化，效价保持稳定；70℃和80℃的条件下分别经过20min、40min作用后基本失活，说明PRF01噬菌体能够耐受较宽的温度范围，在环境温度60℃及以下的条件下活性较稳定。
(五)噬菌体的pH稳定性测定
1、实验方法
取各无菌试管中分别加入4.5mL的不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的PBS，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，向各试管中分别加入500μL 3.65×109PFU/mL的噬菌体增殖液，混匀后置于37℃水浴作用1h、2h、3h。处理结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，最后通过双层平板法测定不同处理的噬菌体的效价。
2、实验结果及分析
如图3所示，噬菌体PRF01在pH 3～11范围内的酸碱条件下能够保持自身活性的稳定性，仍具有裂解能力；而该噬菌体在pH为2或PH为12、13的强酸强碱条件下，其在1～2h后基本失活。因此，PRF01能够耐受较宽范围的酸碱环境。
(六)噬菌体一步生长曲线的测定
1、实验方法
按照MOI＝0.001的条件将噬菌体PRF01增殖液和其宿主菌对数期菌液各1mL进行混合，充分混匀并开始计时，37℃温育5min，13000g离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用1mL PBS缓冲液洗涤1次(13000g离心30s)，弃上清。用预热的PBS缓冲液混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0min和每隔10min取出150μL，11000rpm离心1min，吸取100μL的上清用PBS缓冲液10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体效价，做3个重复，结果取平均值。以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的效价的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体的潜伏期、爆发期。
噬菌体的裂解量＝裂解末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度
2、实验结果及分析
如图4的一步生长曲线所示，噬菌体PRF01的裂解周期时长为100min：噬菌体感染宿主菌后，30min内效价基本稳定，表明噬菌体潜伏期约为30min；噬菌体侵染宿主菌后的30-70min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体的爆发期约为40min；在随后的30min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。噬菌体的裂解量约为3.62×1010PFU/mL/1×108CFU/mL＝362PFU/细胞。由此可见，噬菌体PRF01的潜伏期和裂解期时间较短，同时其裂解量较高，适合用于噬菌体治疗。
(七)噬菌体体外裂解实验
1、实验方法
将噬菌体悬液与宿主菌按照MOI＝0.001的比例加入100mL TSB液体培养基中，临床分离致病性弗氏柠檬酸杆菌菌株RF03的终浓度为5.00×106CFU/mL，噬菌体的终浓度为5.00×103PFU/mL。试验组加入噬菌体与宿主菌混合液；对照组加入与噬菌体溶液相同量的无菌TSB液体培养基与宿主菌混合；混合均匀后在37℃，170rpm的摇床内振荡培养，每隔30min测定OD600值直至混合液变清亮。
2、实验结果及分析
如图5所示，150min时试验组的OD600明显下降，说明菌浓度急剧下降；180min时试验组OD600已降至0.2以下，对照组宿主菌OD600值在180min时已上升至1.0以上；300min时加入噬菌体悬液的试验组已经显著澄清，而对照组十分浑浊。由此可见，噬菌体PRF01能够有效抑制宿主菌。
实施例3噬菌体PRF01注射后对克氏原螯虾体内代谢过程的影响
1、实验方法
选择体重20g左右健康的克氏原螯虾，空腹过夜，设置一组对照组和三组试验组，每组40只。对其进行以下处理：
对照组受试虾注射TSB培养基0.1mL，注射采取体腔注射方法，由克氏原螯虾第二附肢基部注射；试验组1、2、3采取相同注射方式向虾体内注射噬菌体PRF01 0.1mL，噬菌体含量为1×108PFU/mL。注射后分别于0.5h、5h、10h、24h、48h、72h、96h、120h、144h检测各组受试虾的虾肠、肝胰腺以及空白对照组正常对虾体内噬菌体的含量。
2、实验结果及分析
注射噬菌体PRF01的30min后，试验组的虾体肠道、肝胰腺内即检测到噬菌体的存在，效价可达4.62×106PFU/g，噬菌体可以通过注射进入虾体内，且噬菌体可持续存在2天以上，这对噬菌体作为水产药物添加剂具有指导作用，且可用于预防和治疗弗氏柠檬酸杆菌病。实验结果还表明，噬菌体对克氏原螯虾的健康没有影响，不影响对虾正常活动，说明噬菌体安全性很好。
实施例4噬菌体PRF01预防弗氏柠檬酸杆菌感染克氏原螯虾效果测定
1、实验方法
准备体重20g左右健康的克氏原螯虾，暂养一周后。设置两组空白对照组、两组对照组以及六组试验组，每组40只。对其进行以下处理：
注射法：空白对照组与对照组受试虾注射TSB培养基0.1mL，注射采取体腔注射方法，由克氏原螯虾第二附肢基部注射；试验组1、2、3采取相同注射方式向虾体内注射噬菌体PRF01 0.1mL，噬菌体含量为1×108PFU/mL。
1h后，对照组与试验组1、2、3所有受试虾注射弗氏柠檬酸杆菌RF120.1mL，剂量为2.50×106CFU/只；空白对照组依旧注射TSB培养基0.1mL。
拌料饲喂法：向另一空白对照组受试虾以对虾体重5％的剂量饲喂普通饲料；对照组按照用体积与质量比(ml/g)为5％的添加量，使用PBS缓冲液浸泡饲料后饲喂；试验组4、5、6按照相同添加量，将噬菌体PRF01浸泡对虾饲料，均匀混合，噬菌体拌料后效价为1×108PFU/mL，阴干后饲喂上述混有噬菌体的对虾饲料。
1h后，对照组与试验组4、5、6浸浴浓度为2.50×105CFU/mL弗氏柠檬酸杆菌RF12，空白对照组不做处理。
记录各组72h内死亡虾数目，并计算噬菌体的保护率。
2、实验结果及分析
如表3、表4所示，试验组的保护率均高于80％，这说明注射与拌料饲喂噬菌体PRF01均能有效预防对虾感染弗氏柠檬酸杆菌而导致的疾病，降低克氏原螯虾的死亡率，提高成活率，降低养殖风险。
表3噬菌体注射对弗氏柠檬酸杆菌的预防效果
Figure BDA0003654426010000191
表4噬菌体拌料对弗氏柠檬酸杆菌的预防效果
Figure BDA0003654426010000192
实施例4噬菌体PRF01治疗弗氏柠檬酸杆菌感染克氏原螯虾的效果测定
1、实验方法
准备体重20g左右健康的克氏原螯虾，暂养一周后。设置一组空白对照组、一组对照组以及三组组试验组，每组40只。对其进行以下处理：
空白对照组受试虾注射TSB培养基0.1mL，注射采取体腔注射方法，由克氏原螯虾第二附肢基部注射；对照组与试验组所有虾注射弗氏柠檬酸杆菌RF12 0.1mL，剂量为2.50×106CFU/只。
1h后，试验组1、2、3采取相同注射方式向虾体内注射噬菌体PRF010.1mL，噬菌体含量为1×108PFU/mL；空白对照组与对照组受试虾依旧注射TSB培养基0.1mL。记录各组72h内死亡数目，并计算噬菌体的保护率。
2、实验结果及分析
如表5所示，对照组的对虾死亡率高达95％；而试验组中，对虾死亡率低至10-15％，噬菌体注射处理对对虾的保护率达到85-90％。由此可见，噬菌体PRF01对克氏原螯虾的弗氏柠檬酸杆菌病具有很好的治疗效果，可大幅度提高其存活率。
表5噬菌体注射对弗氏柠檬酸杆菌疾病的治疗效果
Figure BDA0003654426010000201
实施例6噬菌体PRF01对非宿主性细菌的裂解试验
1、实验方法
选取10株溶藻弧菌、20株副溶血弧菌、10株哈维氏弧菌，共40株不同类型的非宿主性细菌，按照前述裂解谱的测定方法进行噬菌体PRF01的裂解谱的测定实验。
2、实验结果及分析
结果显示，该噬菌体与40株上述非宿主性细菌的双层平板中都未发现透亮噬菌斑，这表明噬菌体PRF01均无法识别上述这些非宿主性细菌，这说明供试噬菌体具有极强的宿主特异性，且对微生物群落无损伤作用，适用于制备检测试剂盒，用于对样品中弗氏柠檬酸杆菌进行快速检测。
实施例7噬菌体PRF01的环境消毒试验
1、实验方法
取20L克氏原螯虾养殖水体，设为一组对照组，三组试验组，每组体积统一为5L。试验组均加入终浓度为1×108PFU/mL的噬菌体PRF01，对照组加入等体积的PBS缓冲液。在试验前以及噬菌体加入后4h、8h、12h、16h、20h、24h进行取样，采用TCBS平板测定水体中菌浓度。
2、实验结果及分析
由图6可知，对照组中的菌浓度试验前与试验后基本保持一致，未发生明显变化；而三组试验组在加入噬菌体后其水体菌浓度在持续下降，而在加入8h时水体菌浓度出现降低迅速，并在24h内未出现升高现象，呈现出净化水体的作用，这表明噬菌体PRF01对克氏原螯虾养殖环境有明显杀菌消毒效果，可用做水体环境改良剂。
从上述的多个实施例的结果可知，本发明的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体对克氏原螯虾的弗氏柠檬酸杆菌病具有很好的预防和治疗效果，可利用该噬菌体制备抗海产弗氏柠檬酸杆菌病的药物，为治疗弗氏柠檬酸杆菌感染引起的疾病提供新的理论依据和实践经验。此外，还可将该噬菌体用于制备环境消毒剂和饲料添加剂等，应用于水产养殖的各个环节，有益于水产养殖业的健康发展。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，在不脱离本发明构思的前提下，所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，其特征在于，被命名为PRF01，其保藏编号为CGMCC No.45075。
2.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体PRF01。
3.一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括如权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
4.如权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物在制备用于预防或治疗弗氏柠檬酸杆菌感染的疾病的药物、水产饲料添加剂或环境消毒剂中的应用。
5.一种水产饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
6.一种环境消毒剂，其特征在于，有效成分包括如权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、如权利要求2所述的噬菌体组合物或如权利要求3所述的噬菌体药物制剂。
7.如权利要求6所述的环境消毒剂在灭杀环境中弗氏柠檬酸杆菌中的应用，其特征在于，所述环境包括池壁、饲养环境、料台、饲养器具、循环水养殖系统。
8.一种水产品生物抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
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