CN116144605A - 一种沙门氏菌噬菌体s16p及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌噬菌体S16P及其应用。该噬菌体的分类命名为沙门氏菌噬菌体(Salmonellaentericaserovarphage)S16P，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021861。本发明的噬菌体对沙门氏菌具有特异性的杀伤活性，能够选择性的杀死特定的致病菌，而不会杀死有益细菌，不会引起药物的抗性。本发明所述噬菌体S16P对沙门氏菌具有强烈的裂解作用，可以有效防控家禽养殖场沙门氏菌病，减少沙门氏菌引起的鸡群腹泻等，还可以对饲养环境、饲料、饮水等进行沙门氏菌的消毒。此外，所述噬菌体易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备而的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。

Description

一种沙门氏菌噬菌体S16P及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种沙门氏菌噬菌体S16P及其应用。

背景技术

近几十年来,大量抗生素作为生长促进剂和治疗药物等被投入动物饲料及疾病防治中, 使沙门菌的耐药性逐渐增强,增大了沙门菌对人类和动物健康的威胁：从上世纪末起，在人 类和动物身上都发现了沙门菌的耐药性，多重耐药沙门菌的流行在英国、美国和加拿大急剧 增加，许多其他国家和地区也记录了家禽、肉类及奶制品等畜产品中与耐药沙门菌有关的暴 发，自此细菌耐药性成为了一个潜在的严重公共卫生问题，越来越受到人们的重视。

现代畜牧业生产中，抗生素仍旧处于治疗细菌性感染治疗方法的首要地位。但由于抗生 素杀灭细菌的广谱性，常会引起不必要的微生物损伤，从而使微生态失衡；抗生素的大量使 用，使细菌与抗生素的交互增多，导致耐药性，因此，为了减缓细菌的耐药性、防止细菌耐 药谱继续扩宽，需要制定理智的抗生素使用策略。

根据《兽药管理条例》《饲料和饲料添加剂管理条例》有关规定，按照《遏制细菌耐药国 家行动计划(2016－2020年)》和《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017－2020年)》部 署，农业农村部已发布公告第194号，停止生产、进口、经营、使用药物饲料添加剂。农业 农村部公告第246号又补充了相关兽药产品质量标准修订和批准文号变更等有关事项，相关 兽药产品彻底由“兽药添字”转为“兽药字”批准文号。

噬菌体是一种感染细菌、真菌、藻类、放线菌和螺旋体等微生物的病毒，噬菌体在发现 伊始即被用于治疗，噬菌体的发现者之一费利克斯·德赫雷尔即是在探究痢疾杆菌的感染时 发现了噬菌斑，并开始将噬菌体应用于细菌性痢疾，此后也出现了利用噬菌体进行细菌性疾 病的试验，结果证实噬菌体确实可以有效治疗细菌性疾病。

噬菌体在治疗细菌性疾病中有许多优势。首先，噬菌体作为生物链中的一环，广泛存 在于自然界中，只要有细菌的地方都会有噬菌体的存在。其次，噬菌体对宿主菌存在特异 性选择，通常噬菌体只会对特定种属病原菌起到杀伤作用，而对机体内其他的正常菌群不 产生影响，不会破坏微生态的平衡。第三，噬菌体增殖速度快，在短时间内子代噬菌体可呈指数增长，理论上一次给药就可产生显著的抑菌效果。其次，噬菌体不受细菌耐药性的影响，且不易使细菌产生抗性。最后，噬菌体还具有无副作用、无残留的优势，其只在细 菌感染的部位发挥作用，不会扩散，且当靶细菌被清除后，噬菌体则不展现生物活性，并 很快被机体清除，不存在残留现象。因此，噬菌体作为新型抗菌剂，具有潜在的开发价值。 寻求一种能有效杀灭沙门氏致病菌的噬菌体十分必要。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中的问题，提供一种对沙门氏菌具有特异性的杀灭活性，能 够有效防治家禽沙门氏菌病的新型噬菌体。

本发明的第一方面，提供一种新型沙门氏菌噬菌体，所述噬菌体的分类命名为沙门氏 菌噬菌体(Salmonella enterica serovarphage)S16P，已于2021年7月12日保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021861，地址：中国武汉，武汉大学。

所述沙门氏菌噬菌体S16P具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约 76nm，尾部可见可收缩的肌鞘，长约184nm，应属于肌尾病毒科；噬菌体株在固体培养基 上可以形成较大空斑，周围有晕环，边缘清晰规则，直径为2～3mm。

所述沙门氏菌噬菌体S16P在30～60℃中放置60min，其活性稳定；在pH为3.0～12.0 时，可稳定维持其效价。

本发明第二方面，提供了所述的一种沙门氏菌噬菌体S16P在制备沙门氏菌抑菌剂中的 用途，具体为将沙门氏菌噬菌体纯化后，用于抑制和杀灭沙门氏菌，防止沙门氏菌污染和 沙门氏菌过度生长。

优选地，所述沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。

本发明第三方面，提供了所述的一种沙门氏菌噬菌体S16P在制备预防和/或治疗由沙 门氏菌引起的感染性疾病的药物中的用途。

本发明第四方面，提供了所述的一种沙门氏菌噬菌体S16P在制备预防和/或治疗由沙 门氏菌引起的感染性疾病的饲料添加剂中的用途。

优选地，所述饲料添加剂为饮用水添加剂，通过与鸡饮用水混合，对鸡群进行饲喂。

本文中术语“预防”是指包括通过给予以所述噬菌体为主要成分的组合物来抑制或延 迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予以所述噬菌体为主要成分 的组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

本发明第五方面，提供了一种以所述的沙门氏菌噬菌体S16P为有效成分的消毒剂或清 洁剂。具体地，所述消毒剂或清洁剂可通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具进行 沙门氏菌的消毒。优选地，所述养殖环境包括畜禽体表、畜禽饲料、养殖空间环境；优选养殖空间环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限 于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。

此外，本发明还提供了一种沙门氏菌噬菌体S16P的制剂，所述制剂中含有沙门氏菌噬 菌体S16P和SM缓冲液，所述SM缓冲液的组成为：NaCl 5.8g、MgSO4·7H2O 2g、1mol/LpH为7.5的Tris-HCl 50mL、2％的明胶5mL，去离子水补充至1L。

所述沙门氏菌噬菌体S16P的制剂可作为消毒剂、清洁剂、可饮水使用的饲料添加剂使 用。

有益效果：

1.本发明提供一种新型沙门氏菌噬菌体S16P，对沙门氏菌，尤其是鸡源沙门氏菌具有 特异性的杀灭活性，能够选择性的杀死特定的致病菌，而不会杀死有益细菌，不会产生耐 药菌株。

2.本发明沙门氏菌噬菌体S16P在30～60℃中放置60min，其活性稳定；在pH为3.0～ 12.0时，可稳定维持其效价。

3.本发明沙门氏菌噬菌体S16P能够有效防治家禽沙门氏菌病，具有降低鸡群死亡率、 降低鸡病后体重增长减少以及良好的清除鸡肠道内沙门氏菌的作用。

4.本发明的噬菌体具有优异的耐酸性和耐热性，可被制成饲料添加剂供家禽饮水使用、 还可作为清洁剂或消毒剂中的有效成分，能够在较广的温度范围和pH条件下对沙门氏菌进 行杀灭，对饲料、环境等也具有良好的沙门氏菌消毒作用。

5.本发明所述的沙门氏噬菌体S16P从自然界中获得，易于进行工业化生产，由该噬菌 体制备而的组合物或消毒剂不仅可降低养殖成本，还具有绿色环保的优点。

6.本发明所述沙门氏菌噬菌体S16P增殖所需时间较短，生产效率高，可降低生产成本。

附图说明

图1为沙门氏菌噬菌体S16P的噬菌斑图片；

图2为噬菌体S16P的电镜图片；

图3为噬菌体S16P的最佳MOI；

图4为噬菌体S16P的一步生长曲线；

图5为噬菌体S16P的热稳定性测试结果；

图6为噬菌体S16P的pH值稳定性测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施案例对本发明作更进一步的说明，但本发明的实施方式不限 于此，下述实施例中所使用的试验方法、试剂如无特殊说明，均为本领域的常规方法、常 规试剂；在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用 的。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1沙门氏菌噬菌体S16P的分离、纯化、保藏

(1)宿主菌的准备：用酚红煌绿琼脂平皿和DHL琼脂平皿进行划线，37℃培养20h-24 h后，挑取5个可疑菌落在营养琼脂平皿上划线培养，用纯培养进行后续鉴定，针对已纯化 的沙门氏菌进行基因组DNA提取，通过16s rRNA进行序列分鉴定种属；筛选结果：经分离鉴定共获得22株沙门氏菌，将分离株作为宿主菌进行噬菌体的筛选。

(2)噬菌体的分离：将污水样经5000rpm，4℃，离心10min，取上清液5mL加入 灭菌的试管中，同时加入5mL双倍浓缩的TSB液体培养基与100μL对数期的菌液，在37℃ 条件下，160rpm震荡过夜培养。次日，将过夜培养后的悬液经5000rpm，10min离心后， 取上清液过0.22μm的微孔滤膜，得到噬菌体原液。取0.1mL噬菌体原液和0.2mL宿主 菌液混合后，于37℃的条件下，静置10min，然后加入40℃的TSB营养琼脂中混匀后立 即倒入已凝固的TSB培养琼脂平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后37℃倒置培养4-6 h，观察有无噬菌斑。

(3)噬菌体的纯化：待噬菌斑长出后，选取直径较大，透明度较高的噬菌斑，扣取噬菌斑放于1mL生理盐水中，于37℃的条件下，浸泡30min，然后于10000rpm离心5min， 再按照步骤(2)所述方法铺双层平板，培养后挑取单噬菌斑，反复纯化5次，直到噬菌斑 大小一致，即得到生物学纯的噬菌体株系，所得到的噬菌斑呈圆形，形态单一、边缘光滑 有晕环、清晰透明，直径大小为2-3mm(如图1所示)。

(4)噬菌体的保藏：申请人将该纯化的沙门氏菌噬菌体S16P保藏于中国典型培养物 保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC NO：M2021861，保藏日期为：2021年7月12 日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072。

实施例2沙门氏菌噬菌体S16P的效价检测和形态学特性

(1)噬菌体效价测定：用无菌的SM缓冲液对噬菌体增殖液进行倍比稀释，然后取适当稀释度(10^-6、10^-7、10^-8)的噬菌体稀释液100μL与对数期的菌液100μL加入到5mL 50℃ 的TSB半固体培养基中，充分混匀后，倒入底层平板之上，待培养基充分凝固之后，将其 倒置于37℃的恒温培养箱中培养6-8h，待噬菌斑长出后计数。每个稀释度设置三组平行， 取平均值，经测定噬菌体的效价≥10⁹pfu/mL。

噬菌体效价计算公式如下：

噬菌体效价(pfu/mL)＝噬菌斑数×稀释倍数×10

注：所述SM缓冲液具体组方如下：NaCl:5.8g，MgSO₄·7H₂O:2g，Tris-HCl(1mol/L，pH＝7.5):50mL， 明胶(2％):5mL，用去离子水补齐至1L即可。以下未做特殊说明，SM缓冲液均与此方一致。

(2)噬菌体的形态学特性

噬菌体的电镜观察试验：取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15 min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，通过透射电镜观察，噬菌体的形态为蝌蚪状，噬菌体具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约76nm，尾部可见可收缩的肌鞘，长约184nm(如图2所示)。

实施例3沙门氏菌噬菌体S16P的最佳感染复数测定试验

将宿主菌培养至对数期，按照感染复数为0.001、0.01、0.1、1、10，分别将宿主菌与噬菌体加至液体TSB中，在37℃的条件下，160rpm振荡培养4h，8000rpm离心5min， 取离心后的上清液铺双平板测定噬菌体的滴度，以产生最高滴度的感染复数为最佳感染复 数。结果如图3所示。

由图3可知，当感染复数为0.01时，所产生的子代噬菌体的效价最高，为8.7×10¹⁰PFU/mL，说明噬菌体S16P的最佳感染复数为0.01。

实施例4沙门氏菌噬菌体S16P的一步生长曲线测定

取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种沙门氏菌和噬菌体，37℃ 孵育15min，然后常温下10000rpm离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬 菌体，再将沉淀重悬于预热至37℃的液体TSB培养基中，迅速置于37℃160rpm的摇 床中振荡培养并计时，每隔10min取样，8000rpm离心5min，用SM缓冲液做10倍倍比 稀释后采用双层平板法测噬菌体效价，做3个平行，结果取平均值，以时间为横坐标，噬 菌体效价对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体S16P的潜伏期、爆发期，并计 算出爆发量。

爆发量＝噬菌体爆发末期噬菌体滴度/初期宿主菌浓度

结果如图4所示，噬菌体S16P感染宿主菌后，在10min内效价基本不变，效价稳定在10⁷pfu/mL左右，表明噬菌体S16P潜伏期约为10min，噬菌体侵染宿主菌后的20～80min内，噬菌体数量逐渐增加，在100min时效价增长开始趋于平稳，此时效价可达9.7×10⁸pfu/mL，可见噬菌体S16P的爆发期约为90min，爆发量为97。说明噬菌体S16P增殖所需 时间较短，生产效率高，可降低生产成本。

实施例5沙门氏菌噬菌体S16P的温度耐受性试验

将含有900μLSM缓冲液的无菌EP管放于不同温度值(30℃、40℃、50℃、60℃、 70℃、80℃)的水浴中预热60min，待温度稳定后，加入100μL 10⁹PFU/mL的噬菌体原 液，每一温度两个平行样，各保温20min、40min和60min，待作用结束后取样，并立即 将样品置于冰浴中冷却，进行10倍比稀释，取样适当稀释梯度铺双层平板测定噬菌体效价， 37℃倒置培养4-6h后计数。

结果如图5所示，噬菌体S16P在30℃条件下水浴1h可稳定维持其效价；在40℃条件下作用40min后基本可保持原活性；在60℃条件下作用1h后，效价仍可保持在1×10⁶ PFU/mL以上；但经过70℃作用30min后，噬菌体的效价降低到1×10⁵PFU/mL以上；在 80℃条件下，仅10min处理后，噬菌体的存活数就低于10pfu/mL，完全丧失活性。说明 噬菌体S16P具有很好的热稳定性。

实施例6沙门氏菌噬菌体S16P的酸碱耐受性试验

取无菌EP管加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的SM缓 冲液各900μL，然后将上述EP管置于37℃的水浴中，待温度平衡后加入100μL 10⁹ PFU/mL的噬菌体液混匀，37℃作用1h。每管各取样稀释后铺双层平板测定噬菌体的效价， 37℃倒置培养4-6h后计数。

结果见图6，噬菌体S16P在pH为3-12的范围内作用后均有活性，其中在5-8的范围内效价对数值在8以上，在pH为7时作用后效价基本保持原活性，稳定性最好，在pH值 为2和13时完全失活，说明噬菌体S16P对pH值的耐受范围明显较宽。

实施例7沙门氏菌噬菌体S16P的宽宿主谱检测

试验选择19株本试验室此前分离的沙门菌对噬菌体S16P的宿主谱进行分析。具体操 作如下：将TSA平板平均划分为9个区域，分别取19株细菌的过夜培养物10μL，滴加每 个区域上，在无菌环境下，待稍干后，立即滴加6μL噬菌体，待液滴干燥后倒置于37℃培 养4～8h，观察结果。

结果见表1，试验选择的细菌菌液在平板上均生长良好。滴加噬菌体S16P的区域在部 分沙门菌生长的区域内出现不同程度的噬菌空斑区域，并且对所收集的19株细菌中的18 株有裂解作用，裂解率为94.73％。说明分离到的噬菌体S16P是一种宽裂解谱的噬菌体。

表1噬菌体S16P噬菌谱检测

注：“+”代表噬菌体S16P对该沙门菌可产生噬菌空斑，即对该菌有裂菌作用；“-”代表代表噬菌体 S16P对该沙门菌不可产生噬菌空斑，即对该菌没有裂菌作用。

实施例8沙门氏菌噬菌体S16P临床有效性试验

(1)试验设计：选取健康雏鸡，90只，随机分为三组，空白对照组、阳性对照组、治疗组。空白对照组只扎入无菌注射针头模拟腹腔注射，并口服生理盐水；感染组腹腔注射0.5mL菌液/只雏鸡，并口服生理盐水1.0mL；治疗组腹腔注射0.5mL菌液的同时口服给 予1×10⁹CFU/mL的噬菌体制剂1.0mL/只，分组与剂量如下表2所示。

注：所述“菌液”为鸡肠炎沙门氏菌菌液；所述的噬菌体制剂指噬菌体与SM缓冲液的组合物，具 体比例为噬菌体原液：SM缓冲液＝1:1，其噬菌体效价≥10⁹PFU/mL。

表2噬菌体S16P对鸡感染肠炎沙门氏菌治疗效果试验-剂量及分组

(2)观察指标：动物体重：观察结束对动物进行称重。

日常观察：给菌前、给菌后观察，其后连续观察14日。主要观察动物外观、粪便形态、 死亡率等。记录鸡的死亡情况，观察14天后剖检部分活鸡观察内脏病死灶，出血点，肠道 出血等病变。

(3)试验结果：给药前，各组动物被毛光泽，采食饮水正常，精神状态良好，活动正常；给菌/噬菌体后，空白对照组未发现异常症状，阳性对照组动物出现双翅下垂，活动减少，闭眼，精神沉郁等症状，治疗组动物零星出现精神沉郁等症状。

动物给菌/噬菌体时日龄为7日龄，动物死亡情况如表2所示，观察14天后，空白对照 组无动物死亡，阳性对照组动物死亡17只，死亡率为56.67％，治疗组动物死亡5只，死亡率为16.67％，显著低于阳性对照组动物。

表3噬菌体对鸡感染肠炎沙门氏菌治疗效果试验-动物死亡统计情况

给菌/噬菌体后观察14天，对动物进行称重。称重结果如表4所示阳性对照组动物体重 显著低于空白对照组和治疗组，治疗组与空白对照组组相比无统计学差异，空白对照组平 均体重比治疗组仅重约15.6g。

表4噬菌体对鸡感染肠炎沙门氏菌治疗效果试验-体重(g)

注：与空白对照组相比，*表示差异显著，P<0.05；与阳性对照组相比，#表示差异显著，P<0.05。

观察结束后，对每组动物进行剖检，观察动物内脏及肠道，结果空白对照组动物心脏、 肝脏、脾脏等无眼观异常，肠道未发现出血点；阳性对照组部分动物肝脏发现出血点，肠 道粘连等现象；治疗组零星动物出现肠道粘连，其他器官未观察到明显异常。

综合以上试验结果，口服给药噬菌体S16P对鸡感染肠炎沙门菌病有显著的治疗效果， 且可解决鸡病后体重增长减少的问题，可较快恢复体重。

Claims (10)

1.一种沙门氏菌噬菌体S16P，其特征在于，所述噬菌体的保藏编号为：CCTCCM2021861。

2.如权利要求1所述的一种沙门氏菌噬菌体S16P在制备沙门氏菌抑菌剂中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述沙门氏菌为鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。

4.如权利要求1所述的一种沙门氏菌噬菌体S16P在制备预防和/或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的药物中的用途。

5.如权利要求1所述的一种沙门氏菌噬菌体S16P在制备预防和/或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病的饲料添加剂中的用途。

6.一种消毒剂或清洁剂，其有效成分包括权利要求1中所述的沙门氏菌噬菌体S16P。

7.根据权利要求6所述的消毒剂或清洁剂，其特征在于，所述消毒剂或清洁剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲养器具进行沙门氏菌的杀灭。

8.根据权利要求7所述的消毒剂或清洁剂，其特征在于，所述养殖环境包括畜禽体表、畜禽饲料、养殖空间环境。

9.根据权利要求8所述的消毒剂或清洁剂，其特征在于，所述养殖空间环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。

10.一种如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体S16P的制剂，其特征在于，所述制剂中含有沙门氏菌噬菌体S16P和SM缓冲液，所述SM缓冲液的组成为：NaCl 5.8g、MgSO4·7H2O2g、1mol/LpH为7.5的Tris-HCl 50mL、2％的明胶5mL，去离子水补充至1L。

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