CN114703151B - 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents
一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07、其噬菌体组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体于2020年11月9日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，其保藏编号为CGMCC No.20717。该噬菌体对禽源巴氏杆菌具有较强的裂解作用，可以有效防控家禽养殖场的巴氏杆菌病，减少多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱，且使用安全、无副作用，在解决因巴氏杆菌造成的感染的同时，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性巴氏杆菌的问题，且该噬菌体还可用于制备禽饲料添加剂、环境消毒剂、禽肉产品消毒的生物抑菌剂以及检测试剂盒等，应用广泛。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07、其噬菌体组合物及其应用。
背景技术
多杀性巴氏杆菌是一类能引起多种畜禽巴氏杆菌病的病原体，也是引起畜禽疾病中的致病菌，常见的禽巴氏杆菌病主要包括是禽类的出血性败血症，即禽霍乱。
禽多杀性巴氏杆菌病一般分为最急性、急性和慢性三种病型，该病发病率和死亡率很高，不及时采取有效措施会引起禽类的大批量死亡，给养殖户造成严重的损失。传统的预防与治疗方式多以抗生素为主，但由于抗生素的滥用，使禽霍乱的耐药菌株大量出现，给此病的临床防治带来了困难，同时国家开始提倡减抗替抗，所以研发一种疗效显著、使用安全的新型噬菌体制剂用于防治禽霍乱迫在眉睫。
噬菌体是感染细菌的一种病毒，是一种普遍存在的生物体，只要有细菌的地方就会有噬菌体的存在。由于噬菌体具有存在广泛、研发时间短、特异性强、增殖速度快、安全有效，无残留的优点，故噬菌体是抗生素的一个很好的代替品。
目前国内外已经有很多公司正在研究噬菌体并将其应用在生活生产之中，我国在1958年利用噬菌体来治疗炼钢工人邱财康因被钢水烧伤而产生的细菌感染，美国在2006年就允许将噬菌体作为食品添加剂，用于杀灭肉制品中的李氏杆菌；韩国一家饲料公司在2010年将沙门氏菌噬菌体加入到饲料中，用于杀灭饲料中的鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。由此看来，噬菌体作为安全无毒有效的天然杀菌剂有着很大的应用价值以及广阔的市场前景。
但是，目前还没有出现能有效用于防治禽巴氏杆菌病的巴氏杆菌噬菌体，因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株广谱强裂解性的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07，以及由该噬菌体复配形成的噬菌体组合物；该噬菌体不仅可用于制备预防和治疗禽霍乱的药物，还可用于制备禽饲料添加剂、以及环境、饲料消毒剂等。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，有效避免了因传统使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性巴氏杆菌的问题。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供了一株广谱强裂解性的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07，该噬菌体从山东青岛某养殖场的鸡粪中分离得到的，已于2020年11月09日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.20717。
巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07在双层琼脂培养基上可形成直径约0.5～1.5 mm的透亮的圆形噬菌斑，边界清楚。电镜下观测到：该噬菌体的头部呈直径55nm左右的多面体，非伸缩性尾部长20～25nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee onTaxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为短尾噬菌体科，命名为vB_PmuP_PS07。
第二方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07和其他噬菌体。这种噬菌体组合物可通过巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07与其他巴氏杆菌噬菌体进行复配（即鸡尾酒法），进一步地拓宽了其对各类动物源巴氏杆菌宿主菌的裂解谱，提高其裂解性能，用于制备防治巴氏杆菌病的各类产品，如药物、消毒剂、防腐剂等。
优选地实施方式之一为，将巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07与巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01、巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07与巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS02或者噬菌体vB_PmuP_PS07同时与噬菌体vB_PmuP_PS02、噬菌体vB_PmuP_PS01的复配，都形成具有更宽裂解谱的噬菌体组合物，扩展其应用范围，提高其综合应用效果。
其中，巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01是自山东青岛某养殖场的兔粪中分离得到的，已于2020年05月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 19971。噬菌体vB_PmuP_PS01的头部呈直径55nm左右的多面体，非伸缩性尾部长20nm，为短尾噬菌体科，也是一株高裂解性能的巴氏杆菌噬菌体。
所述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS02是自山东青岛某养殖场的猪粪中分离得到的，已于2020年05月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 19972。该噬菌体的头部长呈直径63nm，宽55 nm的多面体，非伸缩性尾部长27nm，也是短尾噬菌体科。
优选地，上述噬菌体组合物还包括噬菌体vB_PmuP_PS07的突变体中的一种或多种；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90%，且保持基本相同的抑菌活性。
由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地进行同源性的测定，vB_PmuP_PS07的突变体与该噬菌体的天然序列同源性至少达到90％；更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，vB_PmuP_PS07的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。上述噬菌体的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6 个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第三方面，本申请还提供了上述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07或噬菌体组合物在制备预防和治疗因巴氏杆菌感染导致疾病的药物中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
优选的，上述巴氏杆菌感染的疾病包括由巴氏杆菌感染引发的家禽及家畜的巴氏杆菌病。优选地，所述巴氏杆菌选自家禽及家畜源巴氏杆菌。优选地，巴氏杆菌感染的疾病包括禽霍乱。通过本申请的大量实验，发现：所述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07可有效用于防治禽霍乱，可用于制备防治禽霍乱的药物。
第四方面，本发明还提供一种噬菌体生物制剂，其有效成分主要为前述的巴氏杆菌噬菌体或前述的噬菌体组合物。优选地，所述噬菌体生物制剂还可以包括相配合的其他特定病原菌的噬菌体。
可选地，上述噬菌体生物制剂的剂型为口服给药剂型、注射给药剂型。上述生物制剂的剂型具体为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
可选地，所述噬菌体生物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂和口服剂型 (例如，水性溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、粒剂)和其他中间剂型，如冻干剂。
第五方面，本申请还提供一种禽饲料添加剂，其包括如上所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07或前述的噬菌体组合物，通过与禽饲料进行混拌后，对禽群进行饲喂，从而达到预防或治疗禽源巴氏杆菌病的效果。优选地，饲料中每种噬菌体的效价至少为1×109PFU/g。
第六方面，本申请还提供一种消毒剂，其有效成分主要为所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07或前述的噬菌体组合物。优选地，噬菌体的效价为1×108PFU/ml以上。
上述消毒剂可用于家禽及家畜养殖场所的环境消毒防腐，可用于代替抗生素或传统消毒产品，且所述噬菌体及其环境消毒剂的代谢产物不会对人体或其他动物造成损害。所述环境消毒剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲养器具等进行全面的巴氏杆菌消毒。所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便、垫料。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。优选的，所述养殖场为禽舍。
第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07或噬菌体组合物。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用上述巴氏杆菌噬菌体或其噬菌体组合物制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的巴氏杆菌、或用于防控由其宿主巴氏杆菌侵染导致的疾病。
第八方面，本发明还提供用于禽肉产品消毒的生物抑菌剂，其有效成分主要为上述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07或噬菌体组合物。生物抑菌剂的使用方法为：对禽类的生鲜产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中巴氏杆菌的增殖。
本发明具有以下有益效果：
1、该噬菌体vB_PmuP_PS07对巴氏杆菌具有较强的裂解作用，其制剂可以有效杀灭具有抗生素多重耐药的多杀性巴氏杆菌，在应用于制备防治多杀性巴氏杆菌感染的药物中可以实现广谱杀菌的效果，可以有效防控养殖场的巴氏杆菌病，极大地降低由于多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱的病发概率，还可以用于对饲养环境，饲料、饮水等进行巴氏杆菌的消毒。而将巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07和其他噬菌体复配形成的噬菌体组合物，通过不同优质噬菌体的互补配合，进一步地拓宽了其对各种动物源巴氏杆菌的裂解谱，具有更广泛的应用前景。
2、本发明的巴氏杆菌噬菌体及其噬菌体组合物应用广泛，不仅可用于制备防治巴氏杆菌病的生物制剂，并且通过与饲料混合及随水饮用，以及作为消毒剂使用，用于家禽养殖过程中的容易因巴氏杆菌感染造成损失的各个环节、养殖环境的日常消毒、以及生鲜产品抑菌等方面；此外，由于噬菌体或噬菌体组合物的治疗无需考虑药物残留问题，作为一种具有安全、高效生物消毒剂和药物进行广泛应用，更有益于禽养殖业的健康发展。
附图说明
图1为噬菌体vB_PmuP_PS07的噬菌斑照片；
图2为噬菌体vB_PmuP_PS07的热稳定性检测结果；
图3为噬菌体vB_PmuP_PS07的pH稳定性检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1 噬菌体的分离培养和生物学特性
（一）菌种的复苏及菌液的制备
挑取巴氏杆菌的冻存菌液在TSA平板（加5%新生牛血清）上三区划线，分离单菌落，37℃恒温箱中培养16~24h。挑取单菌落，接种5ml马丁氏肉汤中，37℃空气振荡器中，220pm振荡培养18h，得到单一的菌悬液。
（二）噬菌体的分离与纯化
取山东青岛某养殖场的鸡粪、垫料、污水以及皮毛等样品放入锥形瓶中，加入适量的TSB肉汤，37℃，170rpm摇床中振荡30min，离心过滤，加入培养基和血清养过夜，离心过滤后与宿主菌混合，双层平板分离噬菌体纯化3~5次得到大小形态一致，直径约0.5～1.5 mm、透亮的圆形噬菌斑。
（三）噬菌体的增殖和效价测定
用马丁氏肉汤增殖噬菌体，37℃，170rpm摇床中培养3~4h，待混合液变澄清，得到噬菌体增殖液。10倍倍比稀释后双层平板法测噬菌体效价。测定噬菌体的效价为2.40×109PFU/ml 。
（四）透射电镜观察噬菌体的形态
取高于1×109PFU/ml噬菌体样品20μl滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μl的2%的磷钨酸（PTA），染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照。
电镜观察发现：该噬菌体的头部呈直径55nm左右的多面体，非伸缩性尾部长20nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为短尾噬菌体，命名为vB_PmuP_PS07。
（五）噬菌体的热稳定性检测
将2.40×109PFU/ml的噬菌体vB_PmuP_PS07的增殖液分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下，水浴中作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组。采用双层平板法测定不同条件处理后的噬菌体的效价。
结果如图2所示，噬菌体vB_PmuP_PS07在40℃和50℃作用1h后基本保持原活性；60℃作用20min效价下降2个数量级，1h后效价降低4个数量级；70℃及80℃的高温作用下，20min噬菌体基本失活。试验结果说明噬菌vB_PmuP_PS07能够耐受一定的高温。
（六）噬菌体的pH稳定性检测
取无菌试管中加入不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13）的NB肉汤4.5ml，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，向各个试管中分别加入500µl 2.40×109PFU/ml的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
结果如图3所示，在pH5~11范围内噬菌体vB_PmuP_PS07效价几乎没变或略有降低，仍然在108PFU/ml以上；而在pH为4的条件下处理3h，其效价仅下降1个数量级，可见该噬菌体对pH的适应范围较广，能适应一定的酸性和碱性环境，对碱性环境耐受度更高。
（七）噬菌体的最佳感染复数（MOI）测定
按照常规方法分别对巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07和宿主菌巴氏杆菌QS13进行增殖，测定噬菌体初始效价及宿主菌浓度，并将噬菌体vB_PmuP_PS07和宿主菌进行适当的稀释。分别按照感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001的比例各取100μl的vB_PmuP_PS07和宿主菌加入到马丁氏肉汤中。37℃170rpm摇床培养至液体变澄清，记录液体变澄清时间。11000rpm离心5min，双层平板法测定噬菌体的效价，结果如表1。
表1噬菌体的最佳感染复数（MOI）测定结果
从表1的测定结果可知：该噬菌体的最佳感染复数是0.0001，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为3.46×109PFU/ml，在6个感染复数中噬菌体滴度最高。
实施例2噬菌体的基因组分析
提取巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07的基因组，进行全基因组测序，测序得到的基因组序列在NCBI的GenBank号为MZ995503.1，对其序列进行分析得到：
（1）噬菌体vB_PmuP_PS07的基因组分析
噬菌体vB_PmuP_PS07的基因组大小为38038bp，基因组序列A、G、C、T 4种碱基所占的比例分别为26.77%、18.54%、32.46%、22.24%，G+C%含量为40.77%。
经RAST预测分析，噬菌体vB_PmuP_PS07基因组含有49个开放阅读框（ORFs）；使用在线工具BLASTp和保守域数据库（CDD）分别对噬菌体vB_PmuP_PS07的49个ORFs进行比对，其中，噬菌体vB_PmuP_PS07含已知编码功能蛋白19个，其余ORFs为假想蛋白。
噬菌体vB_PmuP_PS07的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部（tail protein）蛋白基因序列见序列表中序列1，高度保守的末端酶大亚基（terminase large subunit）基因序列见序列表中序列2，DNA聚合酶（DNA polymerase）基因的序列见序列表中序列3。上述基因的具体信息见下表2。
使用BLAST在线工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对噬菌体基因组进行序列相似性比对分析。与其同源性最高的噬菌体为Pasteurella phage vB_PmuP_Pa7 ，其同源性仅达到94.91%。上述结果说明噬菌体vB_PmuP_PS07是一株新的巴氏杆菌噬菌体，与现有的近缘噬菌体的亲缘关系较远。
表2噬菌体vB_PmuP_PS07的基因序列信息表
实施例3 噬菌体裂解谱的测定和体外裂解试验
（一）噬菌体vB_PmuP_PS07的裂解谱测定
（1）该噬菌体对禽源巴氏杆菌的裂解实验
本实施例选用56株分别来源于山东、江苏、四川、云南等省的各地区的病死鸡和鸭的巴氏杆菌作为宿主菌用于检测噬菌体的裂解谱。
1、噬菌体裂解谱的测试：采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：按照实施例1中的方法制备宿主菌的菌悬液。采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱，统计结果见表2。
2、宿主菌的耐药性能的检测：通过药敏纸片法检测56株禽巴氏杆菌的耐药情况，药敏片包括强力霉素、四环素、氯霉素、庆大霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、卡那霉素和氧氟沙星，结果见表3。
3、实验结果及分析：
（1）从表3的结果可知，56株禽源巴氏杆菌表现出不同程度的耐药特性，且具有多重耐药性的巴氏杆菌的比率达到89.3%。
（2）以这56株耐药的巴氏杆菌作为宿主菌进行裂解谱的测定后，发现：56株不同来源的巴氏杆菌宿主菌中，噬菌体vB_PmuP_PS07能裂解其中的49株，裂解率达87.5%，结果显示该噬菌体对禽源巴氏杆菌具有很好的裂解能力。
表3 巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07针对禽源56株巴氏杆菌的裂解谱
（2）噬菌体vB_PmuP_PS07对其他动物源巴氏杆菌的裂解实验
A、实验方法：按照前述的实验方法测定巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07对以下不同动物源巴氏杆菌进行裂解谱测定，结果具体见下表4。
表4 巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07针对兔源巴氏杆菌的裂解谱
表5 巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07针对猪源巴氏杆菌的裂解谱
B、实验结果及分析：
由表3、表4和表5可见，噬菌体vB_PmuP_PS07对禽源、猪源、兔源均具有裂解性能，其中，该噬菌体对兔源巴氏杆菌的裂解率达到74.5%，其对猪源巴氏杆菌的裂解率达到64%。由此可见，噬菌体vB_PmuP_PS07对禽源巴氏杆菌的裂解率最高，效果最为突出。
（二）vB_PmuP_PS07对巴氏杆菌菌株体外裂解试验（OD值法）
1、实验方法：设置4个实验组和1个对照组进行裂解实验。各个实验组中，按照一定的比例向容器先后加入巴氏杆菌菌液和噬菌体vB_PmuP_PS07，巴氏杆菌的终浓度统一为1.00×108CFU/ml，4个实验组中噬菌体的终浓度分别为1.00×109PFU/ml、1.00×108PFU/ml、1.00×107PFU/ml和1.00×106PFU/ml，对照组中加入与实验组中噬菌体相同量的无菌肉汤，以及与实验组相同量和浓度的巴氏杆菌。菌液和噬菌体混合后（加5%新生牛血清）在37℃，180rpm的摇床内振荡培养。每隔一定的时间测定混合液的OD值直至混合液变清亮，并同时通过涂布平板法测定作用不同时间时各组菌的残留量。
2、实验结果：vB_PmuP_PS07对巴氏杆菌菌株的裂解效果很好，4个不同浓度的该噬菌体对巴氏杆菌菌株的裂解效率都可以达到99.98%以上，只是时间长短不同，但是5.5h以内都能够达到较好的杀灭效果，具体数据见下表6和表7。
表6 体外裂解试验结果
表7 OD值测定结束后菌残留量的测定
实施例4 噬菌体的安全性试验
1、实验方法：选择20只10日龄的健康雏鸡，分成实验组和对照组，实验组灌服纯化的200μl的噬菌体增殖液（效价为109PFU/ml），对照组灌服生理盐水（200μl），连续灌服7d，观察雏鸡的行为表现，并剖检观察小鸡脏器的变化。
2、实验结果及分析：
实验组和对照组的雏鸡行为均无异常，剖检肝脏、肺脏、心脏、脾脏、肾脏后，显示脏器正常，实验组与对照组的检测结果无明显差别，这说明本发明提供的噬菌体对实验动物无毒副作用，使用安全。
实施例5 噬菌体对禽源巴氏杆菌攻毒后的治疗作用试验
1、实验方法：选择40只10日龄的健康雏鸡，等分为实验组和对照组。所有雏鸡按照3×107CFU/只的量腹腔注射巴氏杆菌QS06，攻毒2h后，实验组雏鸡每天进行口服1ml的109PFU/ml的vB_PmuP_PS07的噬菌体治疗，对照组的各小鸡口服相同体积的生理盐水，1次/d，连续用药3d后观察1周，记录各组小鸡的死亡情况。
2、实验结果：对照组雏鸡死亡15只，死亡率为75%，实验组雏鸡死亡5只，死亡率为25%，噬菌体vB_PmuP_PS07保护率为75%。表明，噬菌体vB_PmuP_PS07的口服给药对禽源巴氏杆菌引起鸡的巴氏杆菌病治疗有明显效果。
实施例6 噬菌体在体内对巴氏杆菌的预防试验
1、实验方法：选择40只10日龄的健康雏鸡，等分为实验组和对照组。实验组雏鸡每天口服1ml的109PFU/ml的vB_PmuP_PS07噬菌体，连续口服3d，对照组雏鸡每天口服等量的生理盐水，所有雏鸡按照3×107CFU/只的量腹腔注射巴氏杆菌QS06，观察1周，记录各组小鸡的死亡情况。
2、实验结果：观察7d后，对照组的雏鸡死亡16只，死亡率为80%，实验组的雏鸡死亡4只，死亡率为20%，噬菌体vB_PmuP_PS07保护率为80%。表明，噬菌体vB_PmuP_PS07的口服给药对禽源巴氏杆菌引起鸡的巴氏杆菌病预防有明显效果。
实施例7 噬菌体vB_PmuP_PS07对饲料的消毒试验
1、实验方法：取20g的六合鸡饲料，将其均匀分成2份，每份10g，平铺于灭菌后的平皿上，分别作为实验组和对照组的实验对象。分别取1ml 109CFU/ml的巴氏杆菌QS06菌液均匀喷洒在实验组和对照组的饲料表面，待干燥后将1ml 用PBS溶液稀释至109PFU/ml的vB_PmuP_PS07噬菌体均匀喷洒于实验组的饲料表面，对照组的饲料表面对应喷洒相同量的PBS溶液，分别在0h、1h、2h、4h、6h、8h后利用涂布平板法测定饲料携带的菌浓度。
表7 实验组与对照组菌的噬菌体含量
2、实验结果：根据表7的测试结果可知，噬菌体vB_PmuP_PS07喷洒在饲料表面4～6h后，巴氏杆菌的含量大幅度地下降，最多下降达到6个滴度，这说明噬菌体vB_PmuP_PS07对鸡饲料上携带的巴氏杆菌具有显著的杀菌效果，噬菌体vB_PmuP_PS07可广泛应用于养殖环境中饲料、器具以及地面的消毒。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 青岛诺安百特生物技术有限公司
<120> 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07、其噬菌体组合物及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1635
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_PmuP_PS07的尾部纤维基因(Phage tail fibers of Phage vB_PmuP_PS07)
<400> 1
atgtcatcaa gagatatcag tacggttgcg acttacagaa ttgatggttc taccgtagag 60
tttctgattc ccttcgagta tcttagccgt aaattcgtta gggtcactct gattggtaga 120
gaccgaaagg aacttgttgt aaatagggat taccgttatg tatcagctac ccaaatcaga 180
acaactaaaa cttggcaagt cagtgaaggt tatgagttca ttgaattacg tagacacaca 240
agtgcaaccg agcgtattgt tgattttaaa gatggttcaa ttcttcgtgc gcaagaccta 300
aacattagta caatccaagc gttacacatt gctgaggaag ctcgaggtct agcagccgat 360
accttagggg tcaatgatga tgggcattta gatgctagag gtcgaaagat tgtaaatgtg 420
gctaacccag attctgaccg agacgctgtt aactttaggt tcctcgatga ggccgagaag 480
tcagtcactc agaccttagt ggaagtcaga cgcttaaagc aagatattga cgctaaacat 540
acacaggttg gtaaagatac gaacgaggta agacaagcgg ttgttactac tagtcaacat 600
aaagtcgctt ctggggaagc aagagatcgt gcggaaactg ctgcctcaca ggcgagacag 660
tcagctagtg ttgcaactac taaagctaat caagcgagtc aatcagaaca aaacgcttct 720
accagcgcgt cacaagccag taaatcagca accaaagcgg aacaagaagc aaccaaagcg 780
gaacaagctg caaacaaagc tatcggtggt gccatcccaa ttacaagtct tgtacaagaa 840
acaggacaat ctacaacact tgtgatgagc cagaagtcag tcacggaggg tcttaaaggt 900
aaattaggtc gaactggtac acagattatt gaaggtgatt tagagttaaa agatgcgcat 960
agaaatagtg ctttgaaact cttcaatgaa agcgatcaac acgctagttt tgaggtacag 1020
tccccatcaa aaaatgattc ctttatccaa cttatattga aagacaatga ccaacaaact 1080
gtggtaaacc gtcttaaatt tccgagagta aatggaacga tggtaacatc agctaacata 1140
ctttctagtt gggactctaa gccagcggat tattcccttt acaatgcttc ttatattaac 1200
tacctcttca atagagcggt tccaaaaggt aacattgtgc aaactactgg acagtctgat 1260
aatctcatta tgagtcagaa agctgttaca gatgccttag gtaataaacc agtgtgggaa 1320
aacatttaca ctggtgttgg tgtggctgaa tataggtggg tcccagcgaa gatgccaact 1380
ggagattttg aatttcttgt acaactttcg gaggatacca gccaaggcac tagatttaac 1440
aaaaccccga ataagggctt catcttttat gacccaaata aaggtaggtt ctgtgaaaca 1500
tttatttgtt atggggacgg cggagactgg ggtaggtacg gtattcaagt gtttcctagt 1560
agtacgaacg ctttcctgtt taaagctggt catttacgga tgacagcaat ctggattcga 1620
agattggagg attaa 1635
<210> 2
<211> 1770
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_PmuP_PS07的末端大亚基基因( terminase large subunitof PhagevB_PmuP_PS07)
<400> 2
atgactaaaa agaaccaagc acagatgaat aaggagaaca tcgggctact gaaagggaac 60
ttcgtagcct ttatgtttgt tgtctgggca gcgctaggtc tccctaagcc tactaaatgt 120
caaattgaca tggctaaaac gcttgcagac acctccagaa ctcgttttat cttacaagcc 180
ttccgtggta tcggtaaatc ttttatcacc tgtgcgttcg ttgtgtggct cctatggaac 240
aatcctcaac ttaaaatctt gattgtctcc gcttccaagc aacgtgcaga tgataactct 300
acctttatta agaatatcat caacctatta cccttcttac acgagctgaa accacaagct 360
ggtcaacgtg attcagttat tgccttcgac gtaggtggag cgaccccaga ccactcacct 420
tctgttaaat cagttggtat cactggacag ttaacaggtt cccgtgcaga catcattatt 480
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gagttcggtg tgattaacta tttgaactga 1770
<210> 3
<211> 2151
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_PmuP_PS07的DNA聚合酶基因(DNA-directed DNA polymerase of PhagevB_PmuP_PS07)
<400> 3
atgattattt cagatatcga agcgaacggt ttactagaca ctgtaagtag gttccattgt 60
gcagtgactt atgatacagc aacaggagag accaagaagt atcgacctac tgatttcgaa 120
gtgtacctaa gagaccttga gaaagtggta acagctgacg gcttagtgac tttccataat 180
ggttataagt acgatattca agcattaaat atcctagcga agcagtatgg aattaaatgg 240
tctggtattc cacaacgtaa ttctatcgac acacttgttt tgtctcgcct tatttattca 300
gacatcaaag acagagacat gggtctgcta cggtcaggta agattcaagg cacacacttt 360
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tatgacttca aggagcgtat tgagtctgag ggtgaagaat acattgcagg tatggaatgg 480
gaacacttct cagaggaaat gttagaatat aacgttcaag acgtagtggt cacaacgaaa 540
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aagacttgca atgctgatga tttttggtcg tcacatggtc attcatttac ccttgaacat 660
gaagcagcat ggttgttaag taaacaagaa cgtaacggtt tcccttttga ccgtaaaggt 720
attgagacac tttacattga gttgtcatcg aaacgggcag agctaaccca gaagttagta 780
gaaatgttcg gttcatggta tcgaccaaaa ggtggtaaag agttctttaa acaccctaaa 840
actggtgtgg aattagttaa atatcctaaa gtcatctacc cgaaaactgg tagtatgttc 900
ctcaaaccaa agaacaaagc acagcgagag ggtagagaac ctttagaaaa atcaaagacg 960
ccttacatta aaggttgtcc ttatacacca gtagaacacg tcacgtttaa tccaagtagt 1020
cgtgagcata tcgcattgaa acttcaagaa gctggatgga caccaactga gttcacagac 1080
aaggggtcac ccgtagtcaa cgatgagaca ctagattcgg ttatcgtgga cgaccctaaa 1140
aagcaggcag ctattgattt gattaaggaa tacttaatga ttcagaagcg aataggacag 1200
gtagctgaag gtgacaaagc atggctcaag tacgaccaaa atgggtacat tcatggtagt 1260
gtaaatccaa atggtgctgt aactggtcga gcaacacata gcttccctaa cctcgcacag 1320
attcctagtg cacctcacga taagcaagga aacccaatca tgggtcttac tggtaagtat 1380
ggtgtggaat gtcgcatggc ttttggcgct gaacatcaca aagggtctga tggtaaagcc 1440
tggattcaag ttggaacaga cgctagtggt ttagaactta gatgtttggg tcactacatg 1500
tatcctttcg ataacggaga gtatattgat gttatccttg aaggcgatat ccataccaaa 1560
aaccaaatag ctgctggact acccaccaga gacaatgcta agacatttat ttatggtttc 1620
ctttatggag caggggacgc taagattggt gagattgtac aaggtacagc agctgatggt 1680
aaacgtctca aagctaagtt cttggagaat acgccagcaa tcaagatgtt acgtgatagt 1740
atcaccaatg cgcttgtagc tgaatctaaa tgggtgggta accagaacat tattaaatgg 1800
aaacgtaggt atattaaggg tctagacggt cgcatggttc acatccgaag tcctcactca 1860
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atggcttggg tacacgatga aatccaagtg gcttgtagga cacaagaagt agccaaaaag 2040
gtcgcagagt tatctcaaca agctatgcgt aacgtacagg aattttataa atttagatgt 2100
caactagaca ctgagtctaa gattggcgga aactgggcag agtgccacta a 2151
Claims (10)
1.一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 20717。
2.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07和其他噬菌体。
3.如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07或如权利要求2所述的噬菌体组合物在制备预防和治疗巴氏杆菌感染的疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述巴氏杆菌感染的疾病包括禽霍乱。
5.一种噬菌体生物制剂，其有效成分包括如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
6.一种禽饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
7.根据权利要求6所述的禽饲料添加剂，其特征在于，饲料中每种噬菌体的浓度至少为1×109PFU/g。
8.一种消毒剂，其特征在于，有效成分包括如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
9.如权利要求8的消毒剂的应用，其特征在于，所述消毒剂可通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具进行巴氏杆菌的消毒，所述养殖环境包括棚舍、料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
10.一种用于禽肉产品消毒的生物抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物；生物抑菌剂的使用方法为：对禽肉产品产品表面进行浸泡或者喷雾施加生物抑菌剂进行消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中巴氏杆菌的增殖。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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