CN114480307B - 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、其噬菌体组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体为保藏编号为CGMCC NO.22376的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30，且对毛皮动物源的巴氏杆菌具有宽谱的高裂解性能，能够有效防治毛皮动物源的巴氏杆菌病，如水貂出血性肺炎，降低水貂死亡率。该噬菌体及其噬菌体组合物可用作消毒剂活性成分、饲料和水添加剂和检测试剂盒等，在解决水貂源巴氏杆菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。

Description

一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、其噬菌体组合物及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株巴氏杆菌噬菌体 vB_PmuP_PS30、其噬菌体组合物及其应用。
背景技术
巴氏杆菌病(pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌引起的一种急性、热性传染疾病。动物巴氏杆菌病的急性型常以败血症和出血性炎症为主要特征，所以过去又叫“出血性败血症”；慢性型常表现为皮下结缔组织，关节及各脏器的化脓性病灶，并多与其他疾病混合感染或继发。
巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)是引起巴氏杆菌病的病原菌，而该病菌是导致水貂出血性肺炎的重要病原菌，严重危害水貂的健康，发病率和死亡率高，严重威胁水貂养殖业的健康发展。但是目前，传统抗生素的防治方法容易导致耐药菌株的大量出现，严重防治效果减弱，并且抗生素的使用会在动物体内容易出现抗生素残留。因此，目前，需要寻找更环保有效的绿色抗菌产品。
噬菌体是一种普遍存在的能够感染细菌的一种病毒。噬菌体具有宿主特异性的特点，只感染特定的细菌，对动物、植物以及人类细菌无毒副作用。噬菌体因为存在广泛，研发时间短，特异性强，增殖速度快，而且安全有效，无残留，噬菌体作为抗生素的一个替代品，其发展具有很大的前景。目前，噬菌体已经被逐步开发，作为杀菌剂或药物已经应用于部分领域，例如，申请人于申请的公开号为CN111909904A的专利中公开了一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01，其主要应用于兔源巴氏杆菌病的防治，对兔源巴氏杆菌具有较高的裂解率高达85％。而申请人申请的公开号为CN111705042A的专利公开了一株猪源巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS02，其对猪源巴氏杆菌具有特异的高裂解性，对猪巴氏杆菌病导致的猪肺疫和猪进行性萎缩性鼻炎效果显著。
但是，目前还没有出现专门针对水貂源巴氏杆菌具有宽谱、高裂解性能的噬菌体，现有噬菌体类产品，如前述提及的噬菌体难以高效用于水貂巴氏杆菌病(如出血性肺炎)的防治。
因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株新巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30及其应用，上述噬菌体可被用于制备治疗或预防水貂源巴氏杆菌感染的疾病(如水貂出血性肺炎)的药物、消毒剂、饲料添加和水添加剂、检测试剂盒等，在解决水貂源巴氏杆菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供一种从山东省诸城某水貂养殖场粪便中筛选出的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30，该噬菌体已于2021年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22376，保藏地址：中国北京；该噬菌体为短尾噬菌体，噬菌体在固体培养基上可以形成透亮噬菌斑，形态大小一致，边缘清晰规则，直径为1mm。
在电子显微镜下观察到巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30形态为：其头部长 55～60nm，头宽35～40nm，尾长20～30nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，其形态符合长尾噬菌体科的特征，该噬菌体属于短尾噬菌体科。
本申请中，所述的噬菌体vB_PmuP_PS30还包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％且保持基本相同的杀菌活性的突变株。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。噬菌体vB_PmuP_PS30的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体自然筛选出与其性状极度相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第二方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，所述噬菌体组合物包括上述噬菌体vB_PmuP_PS30。在实际应用中，为了进一步拓宽噬菌体制剂的裂解谱，充分发挥不同噬菌体的裂解谱的差异，进行优势互补，可将上述噬菌体 vB_PmuP_PS30和其他噬菌体进行组合使用，如与同为巴氏杆菌噬菌体的其他噬菌体的一种或多种进行组合使用，扩大对巴氏杆菌的杀菌谱，尽可能杀灭环境中的所有巴氏杆菌，用于巴氏杆菌病的防治。此外，也可将上述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30与其他抑制引发同一疾病的不同种类病原菌的噬菌体(抑制引发同类疾病的不同病原菌)配合，用于同一类疾病的防治，如与其他铜绿假单胞菌噬菌体和肺炎克雷伯氏菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体等进行组合使用。
优选地，本申请还提供一种噬菌体组合物，其包括巴氏杆菌噬菌体 vB_PmuP_PS30、巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01和巴氏杆菌噬菌体 vB_PmuP_PS02。基于这三株不同噬菌体对巴氏杆菌的裂解特异性差异，极大扩大其组合物对巴氏杆菌病原菌的裂解谱宽度。
所述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01的各种生物学特性、保藏信息的具体内容见公开号为CN111909904A的专利，噬菌体vB_PmuP_PS02的各种生物学特性、保藏信息的具体内容见公开号为CN111705042A的专利，这两件专利中公开的关于上述两株噬菌体的内容被纳入本申请中。
除巴氏杆菌外，铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌也是危害水貂健康的重要细菌，主要发生在夏、秋两季，危害青年水貂，大部分呈急性死亡，发病率为 5％～60％，死亡率高达80％，严重威胁水貂养殖业的健康发展。铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌和巴氏杆菌乃至其他菌引发的混合感染的致死率更高，防治难度更大，此种混合感染给水貂疾病的防治带来了很大困难。目前，临床上针对以上3种细菌病的预防产品很少。目前只有针对单种细菌的疫苗，尚无针对 3种细菌的联苗研究报道。目前市面尚无有效防治的产品，更没有出现有效防治由巴氏杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌的混合感染引起的水貂出血性肺炎的噬菌体产品。
为解决上述问题，本发明还提供一种噬菌体组合物，其包括上述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_PH35和铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_PA69。该噬菌体组合物充分发挥三种不同噬菌体的优势互补作用，对三种致病菌混合感染导致的疾病具有高效的防治效果。
上述克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_PH35是从山东省潍坊某水貂养殖场污水中筛选出，已于2019年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.18858；该噬菌体为肌尾噬菌体，噬菌体在固体培养基上可以形成透亮噬菌斑，形态大小一致，边缘清晰规则，直径为 0.5mm。
铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_PA69是从从山东省青岛某水貂养殖场污水中筛选出的铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_PA69，该噬菌体已于2019年11月 04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为 CGMCC NO.18855；vB_PaeS_PA69为长尾噬菌体。噬菌体在固体培养基上可以形成透亮噬菌斑，形态大小一致，边缘清晰规则，37℃培养形成直径为0.5mm 的噬菌斑。
上述克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_PH35和铜绿假单胞菌噬菌体 vB_PaeS_PA69已经在公开号为CN111363724A的专利中进行了公开，这两株噬菌体的相关特征详见该专利文件，CN111363724A的专利关于这两株噬菌体的内容被纳入到本申请的内容中。根据电子显微镜观察可知，克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_PH35的形态为：其头部长90～100nm，头宽110～120nm，尾长 120～130nm，属于肌尾噬菌体科；铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_PA69为头部长90～100nm，宽80～90nm，尾部270～280nm，长尾噬菌体。
包括上述三种新型噬菌体的噬菌体组合物对单一或者混合病原菌干扰导致的水貂肺炎具有很好的防治效果，可用于制备防治水貂肺炎的药物或水貂养殖场环境消毒剂。
优选地，上述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、克雷伯氏菌噬菌体 vB_KpnM_PH35与铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_PA69的活体数量之比为1：1： 1。优选地，每种噬菌体的含量不低于1×109PFU/ml。这样配合的噬菌体混合物的裂解效果更好。优选地，为了进一步优化噬菌体组合物的裂解谱宽度，还可添加其他可协同配合(如裂解谱相互补)的噬菌体。
第三方面，本申请还提供了上述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30或包含噬菌体vB_PmuP_PS30的噬菌体组合物、或包含前述巴氏杆菌噬菌体、克雷伯氏菌噬菌体与铜绿假单胞菌噬菌体的噬菌体组合物在制备防治毛皮动物源出血性肺炎疾病的药物、消毒剂或饲料添加剂、检测试剂盒中的应用。还提供前述包括巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_PH35与铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_PA69的噬菌体组合物在制备防治毛皮动物出血性肺炎疾病的药物、消毒剂或饲料添加剂中的应用。
所述防治包括预防和治疗。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
优选地，所述毛皮动物源巴氏杆菌病包括出血性肺炎、出血性败血症。上述毛皮动物包括水貂、狐狸以及貉等。优选为水貂出血性肺炎。
第四方面，本申请还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括前述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30或含该噬菌体的噬菌体组合物或包含前述巴氏杆菌噬菌体、克雷伯氏菌噬菌体与铜绿假单胞菌噬菌体的噬菌体组合物；优选的，所述噬菌体药物制剂还包括其他抑菌或杀菌活性成分，如组合使用的抗生素、抑菌酶、益生菌等。
可选地，所述药物组合物的制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型。具体而言，可以经由皮肤、口服、经直肠、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鼻内和吸入途径来给予本发明的组合物。
可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、 Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、各类的培养基等。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂和口服剂型(例如，水性溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、粒剂)和其他中间剂型，如冻干剂。
第五方面，本申请还提供一种消毒剂，其有效成分包括如上所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30或含该噬菌体的噬菌体组合物或包含前述巴氏杆菌噬菌体、克雷伯氏菌噬菌体与铜绿假单胞菌噬菌体的噬菌体组合物；优选地，每株噬菌体的浓度在109PFU/ml以上。这为毛皮动物(如水貂、狐狸、貉)养殖场的环境消毒提供一种安全、有效，无污染的噬菌体产品。
可选地，消毒剂还包含其他用于环境中细菌抑制或消灭的活性成分、或延长其持效期的助剂，如SM缓冲液、MgCl2溶液等；优选的，可应用消毒剂的环境包括水貂饲料、水和养殖环境，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
第六方面，本申请还提供上述消毒剂在毛皮动物养殖场环境消毒中的应用，具体地，应用方法为：将消毒剂在水貂养殖场、水貂产品加工车间及器具等中使用，防止环境中病原菌的污染。所述养殖环境包括棚舍、料槽、地面、墙壁、粪便和垫料等。包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施、饲养器具或其他环境表面进行消毒去污，并对饲料进行消毒防腐，这种消毒剂可用于代替抗生素或传统消毒产品，而且其对人体及家禽不会造成损害。
第七方面，本申请还提供一种饮用水添加剂或者饲料添加剂，其有效成分包括上述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30或含该噬菌体的噬菌体组合物或包含前述巴氏杆菌噬菌体、克雷伯氏菌噬菌体与铜绿假单胞菌噬菌体的噬菌体组合物；优选地，每种噬菌体的浓度为109PFU/ml以上。通过将上述饮用水添加剂或者饲料添加剂加入水或与饲料混拌，对毛皮动物，如水貂进行饲喂，从而对饮用水和饲料进行消毒杀菌，从源头上避免水貂出血性肺炎的传播，有效进行该病的防治。
可选地，饮用水添加剂还包含其他用于细菌抑制或消灭的活性成分；所述饮用水添加剂的形式为液体剂型、粉末剂型或固体剂型，但不仅限于以上三种剂型。
第八方面，本申请还提供一种检测试剂盒，该试剂盒包括前述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30或包含前述巴氏杆菌噬菌体、克雷伯氏菌噬菌体与铜绿假单胞菌噬菌体中的两种或三种。基于上述这几种噬菌体对宿主菌的裂解特异性，本发明提供的试剂盒可应用于不同噬菌体特异裂解的病原菌的快速检测，包括但不限于以试纸、试纸盒等形式对其宿主菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，有效确保检测的灵敏度，还可用于用于检测基于其宿主菌侵染导致的疾病。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供一种自行筛选到的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30，能够有效防治毛皮动物源的巴氏杆菌病，如水貂出血性肺炎，降低水貂死亡率。该噬菌体及其噬菌体组合物可用作消毒剂活性成分、饲料和水添加剂和检测试剂盒等，在解决水貂源巴氏杆菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。
2、本发明还提供一种包括巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_PH35和铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_PA69的噬菌体组合物的药物制剂，以这三种不同种类的噬菌体复配作为活性成分，具有很宽的杀菌谱。与单一噬菌体相比，该药物制剂极大地拓宽了其杀菌范围，增加其杀菌活性，可大幅度地提高毛皮动物的治愈率，为混合感染导致的毛皮动物出血性肺炎(尤其是水貂出血性肺炎)提供了一种安全、高效、无污染的噬菌体产品。
3、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备而的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。
4、经小鼠试验证明，所述噬菌体及噬菌体组合物制剂无毒副作用，安全性高；且由于噬菌体易于培养和繁殖，便于进行大规模的生产；所述噬菌体和噬菌体组合物制剂具有较好的亲水相，容易配制成喷洒液或者注射液，对环境中的多杀性巴氏杆菌或巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌都可进行有效杀灭。
附图说明
图1为巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30的电镜照片；
图2为噬菌体vB_KpnM_PH35的电镜照片；
图3为噬菌体vB_PaeS_PA69的电镜照片；
图4为巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30的热稳定性图；
图5为巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30的pH稳定性图；
图6为巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30的杀菌效果时效图；
图7为巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30的一步生长曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1噬菌体的分离和纯化
1、宿主菌的分离培养
实施例中的巴氏杆菌噬菌体的宿主菌为巴氏杆菌的临床菌株，从山东省诸城某水貂养殖场感染巴氏杆菌的病死水貂身上取得。
实施例中的克雷伯氏菌噬菌体的宿主菌为肺炎克雷伯氏菌的临床菌株，从山东省潍坊某水貂养殖场感染肺炎克雷伯氏菌的病死水貂身上取得。
实施例中的铜绿假单胞菌噬菌体的宿主菌为铜绿假单胞菌的临床菌株，从山东省青岛某水貂养殖场感染铜绿假单胞菌的病死水貂身上取得。
取宿主菌巴氏杆菌接种于5％小牛血清的TSA培养基，培养过夜后，挑取单菌落接种于5％小牛血清的TSB肉汤中，37℃，170rpm摇床中振荡培养18h作为宿主菌培养物备用。
宿主菌克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌按照公开号为CN111363724A的专利进行制备。
2、噬菌体的分离培养
巴氏杆菌噬菌体分离：将水貂场粪便污水等样品放入泡样瓶中，加适量的 TSB肉汤，37℃，170rpm振荡30min，10000rpm离心10min，取上清0.22μm 细菌滤器过滤后的上清液与巴氏杆菌菌液混合，同时加入同体积的马丁氏肉汤以及总体积的5％小牛血清，37℃孵育过夜，混合液10000rpm离心5min。孵育过夜后用0.22μm的细菌滤器滤去细菌细胞碎片。取300μl目标宿主菌菌液加入到胰蛋白胨大豆培养基(TSB)上层(预先加入5％小牛血清)迅速搓动试管混匀，倒入下层平板(普通的NA下层)，待上层凝固后点样10μl，倒置于37℃温箱内培养5～12h，观察结果。
3、巴氏杆菌噬菌体的抠斑纯化、增殖
取1ml营养肉汤备用，将培养皿上的噬菌斑用灭好菌的镊子进行抠取，抠取好的噬菌斑放入1ml营养肉汤中，放在摇床，37℃培养30min，然后11000rpm 离心5min，取上清再用双层平板法得到单个的噬菌斑，抠取单斑纯化3～5次，直至培养皿上出现大小、形态均一的噬菌斑。
各取100μl宿主菌和噬菌体抠斑浸出液加入到5ml TSB肉汤中，再取100μl 宿主菌加入另一个5ml TSB肉汤中，作为对照，同时放入37℃，170rpm摇床中培养3～5h，待混合液变清亮，得到噬菌体增殖液。10倍比稀释噬菌体增殖液，双层平板法测效价，每个稀释度分别做3个平行样。巴氏杆菌噬菌体形成透亮空斑，大小、形态均一，边缘清晰规则，直径为1mm。
实施例2噬菌体的形态学观察和鉴定
1、实验方法：
取1×109PFU/ml噬菌体样品20μl滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μl的2％的磷钨酸(PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照。
2、实验结果：
如图1的电镜图片所示，巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30头部长55～60nm，头宽35～40nm，尾长20～30nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，噬菌体PS30的形态符合短尾噬菌体科的特征，为短尾噬菌体，将其命名为 vB_PmuP_PS30。
如图2的电镜图片所示，克雷伯氏菌噬菌体的头部长90～100nm，头宽为 110～120nm，尾长为120～130nm。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，噬菌体PH35的形态符合肌尾噬菌体科的特征，为肌尾噬菌体，将其命名为 vB_KpnM_PH35。
如图3的电镜图片所示，铜绿假单胞菌噬菌体的头部头部长90～100nm，宽 80～90nm，尾部270～280nm，长尾噬菌体。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，该噬菌体的形态符合长尾噬菌体科的特征，为长尾噬菌体，将其命名为vB_PaeS_PA69。
实施例3噬菌体的生物学特性研究
1、噬菌体vB_PmuP_PS30的生物学特性研究
(1)噬菌体的热稳定性检测
将4.50×109PFU/ml的噬菌体vB_PmuP_PS30的增殖液分别于40℃、50℃、 60℃、70℃、80℃条件下，水浴中作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组。采用双层平板法测定不同条件处理后的噬菌体的效价。
结果如图4所示，噬菌体vB_PmuP_PS30在40℃和50℃作用1h后基本保持原活性；60℃作用20min效价下降1个数量级，1h后效价降低3个数量级； 70℃及80℃的高温作用下，20min噬菌体基本失活。试验结果说明噬菌 vB_PmuP_PS30能够耐受一定的高温。
(2)噬菌体的pH稳定性检测
取无菌试管中加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13)的NB肉汤4.5ml，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，向各个试管中分别加入500μl 4.50×109PFU/ml的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
结果如图4所示，在pH5～10范围内噬菌体vB_PmuP_PS30效价几乎没变或略有降低，仍然在108PFU/ml以上；而在pH为4的条件下处理3h，其效价仅下降1个数量级，可见该噬菌体对pH的适应范围较广，能适应一定的酸性和碱性环境。
(3)噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定
按照常规方法分别对巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30和宿主菌巴氏杆菌 FS31进行增殖，测定噬菌体初始效价及宿主菌浓度，并将噬菌体vB_PmuP_PS30 和宿主菌进行适当的稀释。分别按照感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 的比例各取100μl的vB_PmuP_PS30和宿主菌加入到马丁氏肉汤中。 37℃170rpm摇床培养至液体变澄清，记录液体变澄清时间。11000rpm离心 5min，双层平板法测定噬菌体的效价，结果如表1。
表1噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定结果
Figure BDA0003555665080000081
从表1的测定结果可知：该噬菌体的最佳感染复数是0.001，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为6.24×109PFU/ml，在6个感染复数中噬菌体滴度最高。
(4)噬菌体的体外裂解试验
按照一定的比例加入巴氏杆菌FS31和噬菌体vB_PmuP_PS30，巴氏杆菌 FS31的终浓度为1×108CFU/ml，噬菌体的终浓度分别为1×109PFU/ml， 1×108PFU/ml，1×107PFU/ml，对照组加入与噬菌体相同量的无菌TSB肉汤，菌液和噬菌体混合后在37℃温箱中培养。每隔一定的时间测定OD值直至混合液变清亮，涂布平板法测定作用一定时间后各组菌的残留量。
如图6所示，vB_PmuP_PS30对巴氏杆菌的裂解效果很好，3个不同浓度的噬菌体对巴氏杆菌菌株的裂解率能达到99.9％以上，只是时间长短不同，但是5h以内都能够达到较好的杀灭效果。
(5)噬菌体的一步生长曲线
计算、调整噬菌体效价和菌液浓度，使感染复数为0.1。取调整后噬菌体增殖液和菌液各1ml，充分混匀(此时开始计时)，37℃孵育5min，12000rpm离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，加入5ml TSB培养基，混匀，12000rpm 离心30s，弃上清。加入5ml 37℃预热的TSB培养基充分混悬沉淀，37℃，170rpm 条件下进行培养，在0时刻和每隔10min取出300μl，10000rpm离心1min，取上清，双层平板法测定噬菌体效价。以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，总结出噬菌体的潜伏期、爆发期。计算出爆发量。
爆发量＝稳定期噬菌体数量/初始菌数量
实验结果及分析：噬菌体裂解周期时长约为90min：噬菌体感染宿主菌后，30min内效价基本稳定，表明噬菌体潜伏期约为30min；噬菌体侵染宿主菌后的 30～70min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体的爆发期约为40min；在随后的20min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。噬菌体的裂解量约为 3.52×109PFU/ml/2×107CFU/ml＝176PFU/细胞。噬菌体潜伏期和裂解期时间较短，同时裂解量较高，适合用于噬菌体治疗。
2、噬菌体vB_KpnM_PH35和vB_PaeS_PA69的生物学特性研究
克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_PH35和铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_PA69 已经在公开号为CN111363724A的专利中进行了公开，这两株噬菌体的生物学特性研究详见该专利文件。
实施例4噬菌体裂解谱的测定
1、实验方法：
采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：按照实施例1中的方法得到宿主菌的菌悬液，42株巴氏杆菌分别来源于潍坊、济南和青岛等地区的出血性肺炎死亡的水貂、狐狸等毛皮动物的肺脏。将300μl噬菌体vB_PmuP_PS30 分别与42株300μl巴氏杆菌于37℃条件下孵育5min后，加入上层琼脂中(加 5％新生牛血清)制备双层平板，待琼脂凝固后置于37℃的恒温箱中倒置培养 12h观察裂解结果。
2、实验结果及分析
从表2的裂解结果可知，对于临床分离的42株毛皮动物源巴氏杆菌，噬菌体vB_PmuP_PS30能裂解其中的30株，裂解率达71.43％，这一结果说明该噬菌体对毛皮动物源巴氏杆菌具有强裂解性、宽裂解谱的特点。
作为比较，巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01对47株兔源巴氏杆菌具有良好裂解能力，裂解率能达到85％；但是，其对上述水貂、狐狸、貉等毛皮动物源巴氏杆菌的裂解率较低，仅能裂解42株中的10株，裂解率为23.8％，具体见表2。
巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS02对猪源巴氏杆菌具有优异的裂解性能，对50株耐药的巴氏杆菌的裂解率达90％；其仅能裂解本申请的上述42株水貂、狐狸、貉等毛皮动物源巴氏杆菌中的26株，其裂解率为61.9％，具体见表2。
由此可见，噬菌体vB_PmuP_PS30对上述毛皮动物源巴氏杆菌裂解率明显高于噬菌体vB_PmuP_PS01和噬菌体vB_PmuP_PS02；并且，三株噬菌体对宿主的裂解特异性存在显著差异，如对于FS05，FS26、FS27、FS29、FS31、FS32、 FS34、FS35、FS37和FS38这几株巴氏杆菌，vB_PmuP_PS02不能裂解，而 vB_PmuP_PS30对其具有优异的裂解能力。由此可见，不仅噬菌体 vB_PmuP_PS30对毛皮动物源的噬菌体的裂解谱更宽，并且其对宿主的裂解特异性与其他两株噬菌体差别很大，并不能相互取代。
表2 vB_PmuP_PS30与另外2株噬菌体对毛皮动物的裂解情况
Figure BDA0003555665080000101
Figure BDA0003555665080000111
(二)vB_KpnM_PH35噬菌体裂解谱的测定
采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：按照实施例1中的方法得到宿主菌的菌悬液，73株肺炎克雷伯氏菌分别来源于潍坊、济南和青岛等地区的出血性肺炎死亡的水貂、狐狸等毛皮动物的肺脏。将噬菌体vB_KpnM_PH35 分别与73株肺炎克雷伯氏菌铺双层平板，倒置培养过夜。
结果显示，用73株肺炎克雷伯氏菌作为宿主菌进行裂解谱的测定，噬菌体 vB_KpnM_PH35能裂解其中的65株，裂解率达89.04％。
(三)vB_PaeS_PA69噬菌体裂解谱的测定
采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：按照实施例1中的方法得到宿主菌的菌悬液，123株铜绿假单胞菌分别来源于青岛、潍坊、日照、大连等地的出血性肺炎死亡的水貂、狐狸等毛皮动物的肺脏。将噬菌体 vB_PaeS_PA69分别与123株铜绿假单胞菌铺双层平板，倒置培养5～6h。
结果显示，用123株铜绿假单胞菌为宿主菌进行裂解谱的测定，噬菌体 vB_PaeS_PA69能裂解其中的111株，裂解率达90.24％。
(四)噬菌体混合制剂的裂解谱测定
按照实施例1中的方法对各噬菌体进行增殖，11000rpm，5min，0.22μm细菌滤器过滤后将3种噬菌体按照1：1：1的比例配制成噬菌体混合制剂，各个噬菌体的效价均大于1×109PFU/ml。
选取实验室保存的42株巴氏杆菌(编号为FS01～FS42)，73株肺炎克雷伯氏菌(编号为H1～H73)和123株铜绿假单胞菌(编号为A1～A123)，采用双层平板法检测vB_PmuP_PS30，vB_KpnM_PH35和vB_PaeS_PA69噬菌体的组合物的裂解谱，裂解谱具体见下表3。
表3不同噬菌体的裂解谱
Figure BDA0003555665080000121
Figure BDA0003555665080000131
实验结果显示：本申请的噬菌体混合制剂对42株巴氏杆菌的裂解率达 71.43％，对73株克雷伯氏菌的裂解率达89.04％，对123株铜绿假单胞菌的裂解率达90.24％；可同时识别多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌，其裂解能力被最大化。这说明噬菌体鸡尾酒组合可弥补噬菌体单一应用时只对某一种致病菌有效的局限性。
实施例5噬菌体对非宿主性细菌的裂解试验
1、实验方法
选取10株大肠杆菌、10株沙门氏菌和10株变形杆菌，这些不同的非宿主性细菌，按照实施例4中裂解谱的测定方法进行的裂解实验。
2、实验结果及分析
与非宿主性细菌10株大肠杆菌、10株沙门氏菌和10株变形杆菌铺双层平板测定裂解谱，噬菌体组合物与这30株非非宿主性细菌均没有噬菌斑出现表明噬菌体均无法识别上述10株大肠杆菌、10株沙门氏菌和10株绿脓杆菌等非宿主性细菌，这说明供噬菌体vB_PmuP_PS30，vB_KpnM_PH35和vB_PaeS_PA69 具有极强的宿主特异性，且对微生物群落无损伤作用。
实施例6噬菌体的安全性试验
1、实验方法：
选择体重为18～20g的健康BALB/C小鼠50只，雌雄各半，分成4个实验组和1个对照组，每组小鼠雌雄各半，4个实验组依次分别灌服200μl的纯化的 vB_PmuP_PS30增殖液、vB_PaeS_PA69增殖液、vB_KpnM_PH35增殖液、 vB_PmuP_PS30、vB_PaeS_PA69和vB_KpnM_PH35混合制剂(109PFU/ml)，对照组灌服等量的生理盐水，连续灌服7d，观察小鼠的行为表现，并剖检观察小鼠脏器的变化。
2、实验结果及分析
4个实验组和对照组的小鼠的行为无异常，剖检发现：肝脏、肺脏、心脏、脾脏、肾脏等脏器正常，与对照组无明显差别。这说明噬菌体对试验小鼠是安全的。
实施例7噬菌体混合制剂对水貂饲料中多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌的消毒效果
1、实验方法：
将过夜培养的多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌浓度分别调整为1×108CFU/ml，用小型喷雾器将1ml混合菌液均匀喷洒在100g摊开的貂料表面，摊开面积约0.5m2，然后用混合制剂的噬菌体实施喷洒，喷洒量为1ml， vB_PmuP_PS30、vB_KpnM_PH35和vB_PaeS_PA69效价均为1×109PFU/ml，分别在喷洒0h、1h、2h、3h、4h、5h后分别检测饲料中多杀性巴氏杆菌、克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌的数量，同时设置喷洒1ml混合菌液不做噬菌体消毒的对照组。
2、实验结果及分析
检测结果显示，在喷洒噬菌体1h后，饲料中多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌的数量显著下降，3h后多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌的数量均下降到20CFU/g以下，具体数据见表4，说明该噬菌体混合制剂可以有效杀灭水貂饲料中的多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌。
表4噬菌体混合制剂消毒效果
Figure BDA0003555665080000151
实施例8噬菌体对水貂出血性肺炎的防治实验
1、噬菌体vB_PmuP_PS30防治多杀性巴氏杆菌感染导致的水貂出血性肺炎
(1)实验方法：选择1～2kg的健康水貂，20只水貂，10只公貂，10只母貂，分为2组，每组公母各一半。试验前水貂后肢趾间静脉采血300μl，双层平板法测定血液中噬菌体，确认无噬菌体存在时，每只貂饲喂10g拌有1ml 109PFU/ml的vB_PmuP_PS30混合制剂的饲料，对照组每只水貂饲喂10g拌有 1ml生理盐水的饲料，饲喂噬菌体1h后，实验组和对照组20只水貂按照 5×108CFU/只的量腹腔注射攻毒多杀性巴氏杆菌临床分离菌株。观察并记录水貂的死亡情况，连续观察7d，对疑似出血性肺炎死亡的水貂进行剖检，核实由出血性肺炎引起的死亡，统计死亡率和保护率(见表5)。
表5噬菌体对水貂出血性肺炎的控制效果
Figure BDA0003555665080000152
(2)实验结果表明：提前饲喂噬菌体的水貂因出血性肺炎引起的死亡率为 30％，噬菌体的保护率为70％，对照组的死亡率为60％，说明噬菌体 vB_PmuP_PS30对多杀性巴氏杆菌引起水貂出血性肺炎的具有良好的控制效果。
2、噬菌体vB_KpnM_PH35防治克雷伯氏菌感染导致的水貂出血性肺炎
(1)实验方法：选择1～2kg的健康水貂，20只水貂，10只公貂，10只母貂，分为2组，每组公母各一半。试验前水貂后肢趾间静脉采血300μl，双层平板法测定血液中噬菌体，确认无噬菌体存在时，每只貂饲喂10g拌有1ml 109PFU/ml的vB_KpnM_PH35的饲料，对照组每只水貂饲喂10g拌有1ml生理盐水的饲料，饲喂噬菌体1h后，实验组和对照组20只水貂按照2×108CFU/只的量腹腔注射攻毒克雷伯氏菌临床分离菌株。观察并记录水貂的死亡情况，连续观察7d，对疑似出血性肺炎死亡的水貂进行剖检，核实由出血性肺炎引起的死亡，统计死亡率和保护率(见表6)。
表6噬菌体对水貂出血性肺炎的控制效果
Figure BDA0003555665080000161
(2)实验结果表明：提前饲喂噬菌体的水貂因出血性肺炎引起的死亡率为 20％，噬菌体的保护率为80％，对照组的死亡率为70％，说明噬菌体 vB_KpnM_PH35对克雷伯氏菌引起水貂出血性肺炎的具有良好的控制效果。
3、噬菌体vB_PaeS_PA69防治铜绿假单胞菌感染水貂引起的出血性肺炎
(1)实验方法：选择1～2kg的健康水貂，20只水貂，10只公貂，10只母貂，分为2组，每组公母各一半。试验前水貂后肢趾间静脉采血300μl，双层平板法测定血液中噬菌体，确认无噬菌体存在时，每只貂饲喂10g拌有1ml 1010PFU/ml的vB_PaeS_PA69的饲料，对照组每只水貂饲喂10g拌有1ml生理盐水的饲料，饲喂噬菌体1h后，实验组和对照组20只水貂按照4×108CFU/只的量腹腔注射攻毒铜绿假单胞菌临床分离菌株。观察并记录水貂的死亡情况，连续观察7d，对疑似出血性肺炎死亡的水貂进行剖检，核实由出血性肺炎引起的死亡，统计死亡率和保护率(见表7)。
表7噬菌体对水貂出血性肺炎的控制效果
Figure BDA0003555665080000162
(2)结果表明，提前饲喂噬菌体的水貂因出血性肺炎引起的死亡率为20％，噬菌体的保护率为80％，对照组的死亡率为80％，说明噬菌体对铜绿假单胞菌引起水貂出血性肺炎的具有良好的控制效果。
4、噬菌体组合物制剂防治多杀性巴氏杆菌、克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌混合感染引起的水貂出血性肺炎
(1)实验方法：选择1～2kg的健康水貂，20只水貂，10只公貂，10只母貂，分为实验组和对照组，每组公母各一半。试验前水貂后肢趾间静脉采血 300μl，双层平板法测定血液中噬菌体，确认无噬菌体存在时，每只貂饲喂10g 拌有1ml 109PFU/ml的vB_PmuP_PS30、vB_KpnM_PH35和vB_PaeS_PA69(效价比为1:1:1)的饲料，对照组每只水貂饲喂10g拌有1ml生理盐水的饲料，饲喂噬菌体1h后，实验组和对照组40只水貂按照5×108CFU/只多杀性巴氏杆菌、 4×108CFU/只铜绿假单胞菌和2×108CFU/只克雷伯氏菌的量腹腔注射攻毒混合菌液临床分离菌株。观察并记录水貂的死亡情况，连续观察7d，对疑似出血性肺炎死亡的水貂进行剖检，核实由出血性肺炎引起的死亡，统计死亡率和保护率(见表8)。
(2)实验结果表明：提前饲喂噬菌体的水貂因出血性肺炎引起的死亡率为 30％，噬菌体的保护率为70％，对照组的死亡率为100％，说明上述噬菌体组合物对巴氏杆菌、铜绿假单胞菌和克雷伯氏菌混合感染引起的水貂出血性肺炎的具有良好的控制效果。
表8噬菌体混合制剂对水貂出血性肺炎的控制效果
Figure BDA0003555665080000171
实施例9噬菌体对水貂出血性肺炎的治疗试验
1、噬菌体vB_PmuP_PS30对水貂出血性肺炎的治疗试验
(1)实验方法：选择1～2kg的健康水貂，20只水貂，10只公貂，10只母貂，分为实验组和对照组，每组公母各一半。实验组和对照组20只水貂按照 5×108CFU/只多杀性巴氏杆菌的量腹腔注射攻毒临床分离巴氏杆菌菌株，攻菌后2h后，每只貂饲喂10g拌有1ml109PFU/ml的vB_PmuP_PS30的饲料，对照组每只水貂饲喂10g拌有1ml生理盐水的饲料。观察并记录水貂的死亡情况，连续观察7d，对疑似出血性肺炎死亡的水貂进行剖检，核实由出血性肺炎引起的死亡，统计死亡率和保护率(见表9)。
(2)实验结果：
噬菌体治疗的实验组水貂因多杀性巴氏杆菌引起的出血性肺炎死亡率为 30％，噬菌体的保护率为70％，对照组的死亡率为90％，说明噬菌体 vB_PmuP_PS30对水貂出血性肺炎具有良好的治疗效果。
表9 vB_PmuP_PS30对水貂出血性肺炎的控制效果
Figure BDA0003555665080000172
2、噬菌体混合制剂对水貂出血性肺炎的治疗试验
(1)实验方法：选择1～2kg的健康水貂，20只水貂，10只公貂，10只母貂，分为实验组和对照组，每组公母各一半。实验组和对照组20只水貂按照 5×108CFU/只多杀性巴氏杆菌、4×108CFU/只铜绿假单胞菌和2×108CFU/只克雷伯氏菌的量腹腔注射攻毒混合菌液临床分离菌株。攻菌后2h后，每只貂饲喂 10g拌有1ml的每种噬菌体浓度均达到1×109PFU/ml的vB_PmuP_PS30、 vB_KpnM_PH35和vB_PaeS_PA69混合制剂的饲料，对照组每只水貂饲喂10g 拌有1ml生理盐水的饲料。观察并记录水貂的死亡情况，连续观察7d，对疑似出血性肺炎死亡的水貂进行剖检，核实由出血性肺炎引起的死亡，统计死亡率和保护率(见表10)。
(2)实验结果：
噬菌体混合制剂治疗的实验组水貂因多杀性巴氏杆菌引起的出血性肺炎死亡率为40％，噬菌体的保护率为60％，对照组的死亡率为90％，说明噬菌体混合制剂对水貂出血性肺炎具有良好的治疗效果。
表10噬菌体混合制剂对水貂出血性肺炎的控制效果
Figure BDA0003555665080000181
实施例10噬菌体vB_PmuP_PS30的全基因组分析
提取噬菌体的基因组，进行全基因组测序，测序得到的基因组序列在NCBI 的GenBank号为MZ995506.1，对其序列进行分析，结果如下：
(1)噬菌体vB_PmuP_PS30：
基因组全长38176bp，G+C含量为40.77％，碱基C、G、A、T含量依次为 18.59％、22.19％、32.47％和26.76。全基因组RAST在线注释结果显示该基因组含有48个开放阅读框(ORFs)。在这48个开放阅读框(ORFs)中，发现结构蛋白有20种，主要包括噬菌体的结构和包装蛋白(头蛋白、尾蛋白、尾纤维蛋白、颈蛋白、衣壳蛋白和末端酶大亚基等)、噬菌体的裂解有关蛋白(裂解酶)、 DNA复制和修饰有关的蛋白质(限制性内切核酸酶、DNA结合蛋白、含内含子的DNA聚合酶前体、HNH核酸内切酶、DEAD/DEAH盒解旋酶等)、其他功能性蛋白(重复感染免疫蛋白)。同时在48个ORFs中，有47个起始密码子为ATG，0个起始密码子为GTG，1个起始密码子为TTG。经软件tRNAscan-SE 分析该基因组不含tRNA基因。经在线工具CGE server分析该基因组不含耐药基因及毒力基因。经PHASTER分析该基因组不含溶原性相关基因。
噬菌体的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部纤维(tail fibers protein)蛋白基因序列见序列表序列1；高度保守的末端酶大亚基(terminase large subunit)蛋白基因的序列见序列表中序列2；DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的序列见序列表中序列3，这些序列的相关信息具体见下表11。
表11基因序列信息表
Figure BDA0003555665080000182
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 青岛诺安百特生物技术有限公司
<120> 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、其噬菌体组合物及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1635
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_PmuP_PS30的尾部纤维蛋白(tail fibers protein of phage vB_PmuP_PS30)
<400> 1
atgtcatcaa gagatatcag tacggttgcg acttacagaa ttgatggttc taccgtagag 60
tttctgattc ccttcgagta tcttagccgt aaattcgtta gggtcactct gattggtaga 120
gaccgaaagg aacttgttgt aaatagggat taccgttatg tatcagctac ccaaatcaga 180
acaactaaaa cttggcaagt cagtgaaggt tatgagttca ttgaattacg tagacacaca 240
agtgcaaccg agcgtattgt tgattttaaa gatggttcaa ttcttcgtgc gcaagaccta 300
aacattagta caatccaagc gttacacatt gctgaggaag ctcgaggtct agcagccgat 360
accttagggg tcaatgatga tgggcattta gatgctagag gtcgaaagat tgtaaatgtg 420
gctaacccag attctgaccg agacgctgtt aactttaggt tcctcgatga ggccgagaag 480
tcagtcactc agaccttagt ggaagtcaga cgcttaaagc aagatattga cgctaaacat 540
acacaggttg gtaaagatac gaacgaggta agacaagcgg ttgttactac tagtcaacat 600
aaagtcgctt ctggggaagc aagagatcgt gcggaaactg ctgcctcaca ggcgagacag 660
tcagctagtg ttgcaactac taaagctaat caagcgagtc aatcagaaca aaacgcttct 720
accagcgcgt cacaagccag taaatcagca accaaagcgg aacaagaagc aaccaaagcg 780
gaacaagctg caaacaaagc tatcggtggt gccatcccaa ttacaagtct tgtacaagaa 840
acaggacaat ctacaacact tgtgatgagc cagaagtcag tcacggaggg tcttaaaggt 900
aaattaggtc gaactggtac acagattatt gaaggtgatt tagagttaaa agatgcgcat 960
agaaatagtg ctttgaaact cttcaatgaa agcgatcaac acgctagttt tgaggtacag 1020
tccccatcaa aaaatgattc ctttatccaa cttatattga aagacaatga ccaacaaact 1080
gtggtaaacc gtcttaaatt tccgagagta aatggaacga tggtaacatc agctaacata 1140
ctttctagtt gggactctaa gccagcggat tattcccttt acaatgcttc ttatattaac 1200
tacctcttca atagagcggt tccaaaagat aacattgtgc aaactactgg acagtctgat 1260
aatctcatta tgagtcagaa agctgttaca gatgccttag gtaataaacc agtgtgggaa 1320
aacatttaca ctggtgttgg tgtggctgaa tataggtggg tcccagcgaa gatgccaact 1380
ggagattttg aatttcttgt acaactttcg gaggatacca gccaaggcac tagatttaac 1440
aaaaccccga ataagggctt catcttttat gacccaaata aaggtaggtt ctgtgaaaca 1500
tttatttgtt atggggacgg cggagactgg ggtaggtacg gtattcaagt gtttcctagt 1560
agtacgaacg ctttcctgtt taaagctggt catttacgga tgacagcaat ctggattcga 1620
agattggagg attaa 1635
<210> 2
<211> 1770
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_PmuP_PS30的末端酶大亚基(erminase large subunit of phage vB_PmuP_PS30)
<400> 2
atgactaaaa agaaccaagc acagatgaat aaggagaaca tcgggctact gaaagggaac 60
ttcgtagcct ttatgtttgt tgtctgggca gcgctaggtc tccctaagcc tactaaatgt 120
caaattgaca tggctaaaac gcttgcagac acctccagaa ctcgttttat cttacaagcc 180
ttccgtggta tcggtaaatc ttttatcacc tgtgcgttcg ttgtgtggct cctatggaac 240
aatcctcaac ttaaaatctt gattgtctcc gcttccaagc aacgtgcaga tgataactct 300
acctttatta agaatatcat caacctatta cccttcttac acgagctgaa accacaagct 360
ggtcaacgtg attcagttat tgccttcgac gtaggtggag cgaccccaga ccactcacct 420
tctgttaaat cagttggtat cactggacag ttaacaggtt cccgtgcaga catcattatt 480
gctgatgacg ttgagattcc atctaatagt gcaacacaag gtgcccgaga gaaactttgg 540
acactcgttc aagagtttgc tgccttgatt aaaccattgg aaagttctcg tataatctac 600
ttagggaccc cacagactga aatgaccctc tacaaggaac tggaagacaa ccgtgggtat 660
tccactgtga tttatcctgc cttgtatcct agaactaaag aggaagaatt attctatgga 720
gaccgactag cgaagttgct tagagatgag tatgtggaaa accaagagtt acttagaggt 780
gaaccaacag accccgttcg attcgataaa gaggaactaa ggggacgtga gttagagtat 840
ggtaaagctg gtttcacttt acagttcatg cttaatccta acttaacgga tgcagcaaga 900
taccctctga gacttcgtga tttaatcgta ggtgacctaa acgattcaac cagtcctatg 960
gtataccaat ggctcccaca cgcttctaat ctcattcagt cgcttccaaa tgtgggtctg 1020
aaaggagaca cttaccacaa ttggcattca accagtcccc atgtaggtga atatactcgt 1080
aagattctag ttgttgaccc tagtggtcgt ggtagcgatg agacaggttg gtgcatcctt 1140
tactcattga atggctatat cttcttaatg gataatggtg gttgtaaaga tggttattcc 1200
gatgtgaccc tagagttcct agcgaagaaa gctaagcaat ggaaagttga cactactatc 1260
ttcgagagta actttgggga cggtatgttc ggtaaggtat tctcacctgt cctcttaaag 1320
caccatagat gcgttctaga ggagattaga gcaaaaggac agaaagaggt acgtattatt 1380
gacactcttg agccagtcct ctctacgcac cgtttagtgg tctctaagga ctgtattgat 1440
acagactaca aaacagccgt gaacaacgat ggtaaacatg aagttaaata ttcattattc 1500
taccaactat cccgtatcac taaagataga ggagcactgg ctaaagatga ccgcttagat 1560
tcattagcat taggtgtcga ataccttaaa gaactcgtta agttaaacgc tgataaacag 1620
caagaggagc tcatagagga gtttttagaa tcccacatga gcaaccctat tagttccaat 1680
gagagcatct ctacgactct ctcaggaggc gttacgttta tctggaatga agaacaagat 1740
gagttcggtg tgattaacta tttgaactga 1770
<210> 3
<211> 2151
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_PmuP_PS30的DNA聚合酶(DNA polymerase of phage vB_PmuP_PS30)
<400> 3
atgattattt cagatatcga agcgaacggt ttactagaca ctgtaagtag gttccattgt 60
gcagtgactt atgatacagc aacaggagag accaagaagt atcgacctac tgatttcgaa 120
gtgtacctaa gagaccttga gaaagtggta acagctgacg gcttagtgac tttccataat 180
ggttataagt acgatattca agcattaaat atcctagcga agcagtatgg aattaaatgg 240
tctggtattc cacaacgtaa ttctatcgac acacttgttt tgtctcgcct tatttattca 300
gacatcaaag acagagacat gggtctgcta cggtcaggta agattcaagg cacacacttt 360
gggtctcatg gtcttgaagc ttggggctac cgattaggtg aaatgaaagg tgagtacaag 420
tatgacttca aggagcgtat tgagtctgag ggtgaagaat acattgcagg tatggaatgg 480
gaacacttct cagaggaaat gttagaatat aacgttcaag acgtagtggt cacaacgaaa 540
cttatggaac gcttgatggc tcacaagtgg tattcctcta aggtagaggg tttcgactgg 600
aagacttgca atgctgatga tttttggtcg tcacatggtc attcatttac ccttgaacat 660
gaagcagcat ggttgttaag taaacaagaa cgtaacggtt tcccttttga ccgtaaaggt 720
attgagacac tttacattga gttgtcatcg aaacgggcag agctaaccca gaagttagta 780
gaaatgttcg gttcatggta tcgaccaaaa ggtggtaaag agttctttaa acaccctaaa 840
actggtgtgg aattagttaa atatcctaaa gtcatctacc cgaaaactgg tagtatgttc 900
ctcaaaccaa agaacaaagc acagcgagag ggtagagaac ctttagaaaa atcaaagacg 960
ccttacatta aaggttgtcc ttatacacca gtagaacacg tcacgtttaa tccaagtagt 1020
cgtgagcata tcgcattgaa acttcaagaa gctggatgga caccaactga gttcacagac 1080
aaggggtcac ccgtagtcaa cgatgagaca ctagattcgg ttatcgtgga cgaccctaaa 1140
aagcaggcag ctattgattt gattaaggaa tacttaatga ttcagaagcg aataggacag 1200
gtagctgaag gtgacaaagc atggctcaag tacgaccaaa atgggtacat tcatggtagt 1260
gtaaatccaa atggtgctgt aactggtcga gcaacacata gcttccctaa cctcgcacag 1320
attcctagtg cacctcacga taagcaagga aacccaatca tgggtcttac tggtaagtat 1380
ggtgtggaat gtcgcatggc ttttggcgct gaacatcaca aagggtctga tggtaaagcc 1440
tggattcaag ttggaacaga cgctagtggt ttagaactta gatgtttggg tcactacatg 1500
tatcctttcg ataacggaga gtatattgat gttatccttg aaggcgatat ccataccaaa 1560
aaccaaatag ctgctggact acccaccaga gacaatgcta agacatttat ttatggtttc 1620
ctttatggag caggggacgc taagattggt gagattgtac aaggtacagc agctgatggt 1680
aaacgtctca aagctaagtt cttggagaat acgccagcaa tcaagatgtt acgtgatagt 1740
atcaccaatg cgcttgtagc tgaatctaaa tgggtgggta accagaacat tattaaatgg 1800
aaacgtaggt atattaaggg tctagacggt cgcatggttc acatccgaag tcctcactca 1860
gcattaaacg cattgttaca atcagcaggt gcattgattt gtaaggagtg gattgttgag 1920
acagaaaagt tattattagc taatggtctt aaacatggtt ggggcgggga ctttgcttat 1980
atggcttggg tacacgatga aatccaagtg gcttgtagga cacaagaagt agccaaaaag 2040
gtcgcagagt tatctcaaca agctatgcgt aacgtacagg aattttataa atttagatgt 2100
caactagaca ctgagtctaa gattggcgga aactgggcag agtgccacta a 2151

Claims (11)

1.一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.22376。
2.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30。
3.根据权利要求1所述的噬菌体组合物，其特征在于，包括巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、vB_PmuP_PS01和vB_PmuP_PS02；所述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS01的保藏编号为CGMCC NO.19971；所述巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS02的保藏编号为CGMCC NO.19972。
4.如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30或如权利要求2所述的噬菌体组合物在制备防治毛皮动物源巴氏杆菌病的药物、消毒剂或饲料添加剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述毛皮动物源巴氏杆菌病包括出血性肺炎和出血性败血症。
6.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，其有效成分包括如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
7.根据权利要求6所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述药物制剂还包括药学上可接受的载体；所述药物制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型。
8.一种饲料添加剂或饮用水添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
9.一种消毒剂，其特征在于，有效成分包括如权利要求1所述的巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
10.根据权利要求9所述的消毒剂，其特征在于，噬菌体的使用浓度为1×109PFU/ml以上。
11.如权利要求9所述的消毒剂在毛皮动物养殖环境、产品消毒中的应用，其特征在于，所述消毒剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲养器具进行病原菌的消毒。
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