CN114621932B

CN114621932B - 一株新型魏氏梭菌噬菌体、包含该噬菌体的噬菌体组合物及其在兔魏氏梭菌病中的应用

Info

Publication number: CN114621932B
Application number: CN202210269593.6A
Authority: CN
Inventors: 潘强; 任慧英; 孙虎芝; 闫艳新; 高金秀
Original assignee: Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Current assignee: Qingdao Phagepharm Bio Tech Co ltd
Priority date: 2021-05-20
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2042-03-18
Also published as: CN114621932A

Abstract

本发明公开了一株具有广谱强裂解性的新型魏氏梭菌噬菌体及包含该噬菌体的噬菌体组合物及其在兔魏氏梭菌病中的应用，该噬菌体不仅可用于制备预防和治疗魏氏梭菌病的药物，还可用于制备兔饲料添加剂、以及消毒剂等。该噬菌体vB_CpeP_PMQ04还可与其他噬菌体，如新型大肠杆菌噬菌体复配形成综合疗效更好的噬菌体组合物。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，在解决因产气荚膜梭菌和大肠杆菌造成的感染的同时，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性产气荚膜梭菌和大肠杆菌的问题，同时还响应了国家替抗减抗的方案。

Description

一株新型魏氏梭菌噬菌体、包含该噬菌体的噬菌体组合物及其在兔魏氏梭菌病中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株新型魏氏梭菌噬菌体、包含该噬菌体的噬菌体组合物及其在兔魏氏梭菌病中的应用。

背景技术

魏氏梭菌(C.welchii)，又名产气荚膜梭菌(C.perfringens)，梭状芽孢杆菌属，产气荚膜梭菌种。在自然界分布较广，可见于土壤、污水、饲料、食物、粪便以及人畜肠道等中。在一定条件下，可引起多种严重疾病。产气荚膜杆菌A型产气荚膜梭菌为兔主要病原菌。除哺乳仔兔外，各种年龄和品种的兔均可感染，发病率和死亡率为20％～90％。一年四季均可发生，尤以冬、春季发病率较高。本病主要通过消化道或伤口感染，发病突然，主要表现为急性水样腹泻，稀便有腥臭味。

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)为革兰氏阴性短杆菌，为条件致病菌，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起动物腹泻，统称致病性大肠杆菌。本病一年四季均可发生，多发于20日龄及断奶前后的仔兔、幼兔。大肠杆菌为肠道正常寄生菌，当饲养管理不当、气候突变等应激因素存在时，机体抵抗力降低，肠道正常菌群活动受到破坏，肠道内致病性大肠杆菌数量急剧增加，其产生的毒素大量积累，引起腹泻。兔群一旦发生本病，常因场地、兔笼的污染而引起大规模流行，造成仔、幼兔大量死亡。

目前针对产气荚膜梭菌和大肠杆菌的防治方法主要是通过饲喂添加有抗生素的饲料或者抗生素的注射治疗。由于产气荚膜梭菌和大肠杆菌都易产生耐药性，现有的菌株已对多种抗生素产生严重的耐药性，其次，长期或大量应用抗生素，可使肉产品中残留大量抗生素，使抗生素通过食物链转移到人体内，给人体健康也带来了严重危害。因此，寻找替代抗生素的防治方案迫在眉睫。

噬菌体是一种针对细菌、支原体、衣原体的病毒，具有安全性、专一性等特点。首先，噬菌体的特异性强，只裂解对应的宿主菌，不破坏正常菌群，可广泛应用于动物全身；其次，噬菌体的使用具有无残留的优点，其可被自然排出动物体外；再者，噬菌体不会导致病原菌产生耐药性，对革兰氏阳性、阴性菌和多重耐药菌均有效；此外，噬菌体与其他药物还具有协同增效的作用，如与抗生素，微生态制剂，抗菌肽，低聚糖等复配，可制备综合疗效更好的药物。

虽然目前噬菌体产品受到越来越多的关注，但是目前还没有出现可有效防治兔腹泻的安全高效的噬菌体产品，因此现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株具有广谱强裂解性的新型魏氏梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04，及包含该噬菌体的噬菌体组合物及其应用；该噬菌体不仅可用于制备预防和治疗兔魏氏梭菌病的药物，还可用于制备兔饲料添加剂、以及消毒剂等。该噬菌体vB_CpeP_PMQ04还可与其他噬菌体，如(大肠杆菌噬菌体)复配形成综合疗效更好的噬菌体组合物。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，在解决因产气荚膜梭菌和大肠杆菌造成的感染的同时，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性产气荚膜梭菌和大肠杆菌的问题，同时还响应了国家替抗减抗的方案。

本发明的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供了一株魏氏梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04，该噬菌体是从兔场粪便中分离得到的，已于2020年11月09日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.20720，保藏地址，中国北京。

电镜下观测到：该产气荚膜梭菌噬菌体的头部呈直径45nm左右的多面体，非伸缩性尾部长15～20nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee onTaxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为短尾噬菌体科，将其命名为vB_CpeP_PMQ04。

第二方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的魏氏梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04。这种噬菌体组合物可通过魏氏梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04与其他噬菌体进行复配，用于制备防治兔腹泻的各类产品。

优选地，所述噬菌体组合物包括前述的魏氏梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04 和大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468。其中，大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468 也是从兔场粪便中分离得到的，已于2020年11月09日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.20718，保藏地址，中国北京。该大肠杆菌噬菌体的头部呈直径90nm左右的多面体，非伸缩性尾部长110～120nm，根据国际病毒分类委员会(The InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为长尾噬菌体科，命名为vB_EcoS_PD468。

第三方面，本申请还提供了上述魏氏梭菌噬菌体或噬菌体组合物在制备预防和治疗因魏氏梭菌感染或魏氏梭菌和大肠杆菌混合感染所致疾病的药物中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

上述魏氏梭菌感染的疾病包括由魏氏梭菌感染引发的各种疾病，包括兔腹泻、坏死性肠炎。噬菌体的应用方法为：将噬菌体PMQ06或其噬菌体组合物或者其加工后的药剂作为治疗药物添加到患有兔饲料中，或进行灌服，或给予肌肉注射，或通过加入饮水中的方式，这样可起到预防及治疗兔腹泻，显著提高兔的存活率的效果，并且该噬菌体的操作简单，应用性强。优选地，上述魏氏梭菌噬菌体可用于制备预防和治疗因魏氏梭菌感染导致的兔腹泻的药物。

第四方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分主要为上述的魏氏梭菌噬菌体或上述噬菌体组合物。

可选地，上述噬菌体药物制剂的剂型为口服给药剂型或注射给药剂型，优选地，采用口服给药剂型。上述药物制剂的剂型具体为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。

可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。

第五方面，本申请还提供一种兔饲料添加剂，其包括如上所述的魏氏梭菌噬菌体或噬菌体组合物，通过与兔饲料进行混拌后，对兔进行饲喂，从而达到预防或治疗产气荚膜梭菌或大肠杆菌性兔腹泻等疾病的效果。优选地，饲料中每种噬菌体的效价至少为1×10⁹PFU/g。

第六方面，本申请还提供一种消毒剂，其有效成分主要为所述的魏氏梭菌噬菌体或噬菌体组合物。优选地，噬菌体的效价为1×10⁸PFU/ml以上。

上述消毒剂的应用方法为：将消毒剂在屠宰场、畜禽产品加工车间及器具、养殖环境中使用，防止环境中魏氏梭菌的污染。例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施、饲养器具或其他环境表面进行消毒去污，并对饲料进行消毒防腐，可用于代替抗生素或传统消毒产品，而且该噬菌体不会对人体及兔群造成损害。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。

第七方面，本发明还提供用于兔类产品消毒的生物抑菌剂，其有效成分主要为上述魏氏梭菌噬菌体或噬菌体组合物。生物抑菌剂的使用方法为：对兔类的生鲜产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中魏氏梭菌/和大肠杆菌的增殖。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一株新型的魏氏梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04、含有该噬菌体的噬菌体组合物以及各种应用，该噬菌体具有广谱杀菌效果，裂解谱宽，可作为活性成分用于制备预防和治疗兔腹泻的药物、消毒剂、兔饲料添加剂以及生物抑菌剂等，可广泛应用于养殖过程、以及产品加工生产过程中各个环节，快速、高效、安全杀灭致病性魏氏梭菌，有效降低发病兔的死亡率，大幅度地提高兔的存活率。

2、在上述基础上，本申请还提供了一种优选的方案，即包括魏氏梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468的噬菌体组合物，通过采用对导致兔腹泻的两种主要致病菌具有高度特异性的噬菌体的协同配合，扩展了其裂解谱，极大地提高了其对兔腹泻的治疗效果。

3、上述噬菌体vB_CpeP_PMQ04和噬菌体vB_EcoS_PD468是来源于自然界，来源广，容易分离获得，并便于进行工业化生产。因此，以上述噬菌体为主要成分的药物制剂成本低、无刺激性气味、无环境污染问题，为兔腹泻的治疗提供一种绿色新型生物制剂。

附图说明

图1为噬菌体vB_CpeP_PMQ04的噬菌斑照片；

图2为噬菌体vB_EcoS_PD468的噬菌斑照片；

图3为噬菌体vB_CpeP_PMQ04的电镜照片；

图4为噬菌体vB_EcoS_PD468的电镜照片；

图5为噬菌体vB_CpeP_PMQ04热稳定性图片；

图6为噬菌体vB_EcoS_PD468热稳定性图片；

图7为噬菌体vB_CpeP_PMQ04 pH稳定性图片；

图8为噬菌体vB_EcoS_PD468 pH稳定性图片；

图9为噬菌体vB_CpeP_PMQ04一步生长曲线图片；

图10为噬菌体vB_EcoS_PD468一步生长曲线图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1 噬菌体的分离和纯化

(1)实验方法：将山东淄博临沂沂源兔场粪样或污水等样品加入胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，充分混匀后离心过滤，去除沉淀后，加入产气荚膜梭菌菌液，于37℃厌氧条件下培养过夜后，将培养液进行离心过滤，取上清备用。取100μl产气荚膜梭菌菌液与100μl前述上清进行混合，使用双层平板法分离噬菌体。若平板上有噬菌斑出现，则挑取单个的较为透亮的噬菌斑于NB 肉汤中，37℃，170rpm条件下，浸出30min后再次纯化。按照前述方法将噬菌斑纯化3代，至双层平板上噬菌斑形态大小单一为止。

大肠杆菌噬菌体与产气荚膜梭菌噬菌体分离方法大体一致，不同之处在于其培养条件为：有氧条件下培养6～8h。

接着，将分离纯化后得到的两种噬菌体进行效价测定。利用双层平板法进行噬菌体效价测定，每个梯度做2个重复，培养一定的时间后计数噬菌斑。两种噬菌体的噬菌斑照片分别见图1和图2。

(2)实验结果：分离得到的产气荚膜梭菌噬菌体的效价为： 3.20×10⁹PFU/ml；分离得到的大肠杆菌噬菌体效价为：1.40×10¹⁰PFU/ml。

实施例2 噬菌体的生物学特性的测定

(1)透射电镜下噬菌体的形态观察

样品处理方法：取高于1×10⁹PFU/ml的噬菌体样品20μl滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μl的2％的磷钨酸 (PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照。

电镜观察发现：如图3所示，该产气荚膜梭菌噬菌体的头部呈直径45nm 左右的多面体，其非伸缩性尾部长15～20nm，根据国际病毒分类委员会(The InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为短尾噬菌体科，命名为vB_CpeP_PMQ04。

如图4所示，该大肠杆菌噬菌体的头部呈直径90nm左右的多面体，非伸缩性尾部长110～120nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy ofViruses，ICTV)第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为长尾噬菌体科，命名为vB_EcoS_PD468。

(2)噬菌体热稳定性检测

将3.20×10⁹PFU/ml的产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和 1.40×10¹⁰PFU/ml的大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468分别于40℃、50℃、60℃、 70℃的条件下，分别水浴中作用30min、60min，每个温度设两个平行组。采用双层平板法测定每组噬菌体的效价。

结果显示：如图5所示，噬菌体vB_CpeP_PMQ04在40℃和50℃作用 60min后基本保持原活性；60℃作用60min效价下降1个数量级。说明噬菌 vB_CpeP_PMQ04能够耐受一定的高温。

如图6的结果显示，噬菌体vB_EcoS_PD468在40℃和50℃作用60min 后基本保持原活性；60℃作用60min效价下降0.5个数量级。说明噬菌体 vB_EcoS_PD468能够耐受一定的高温。

(3)噬菌体的pH稳定性检测

方法：取无菌试管中加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13)的NB肉汤4.5ml，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl的3.20×10⁹PFU/ml的产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和 1.40×10¹⁰PFU/ml大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。

结果表明：如图7所示，噬菌体vB_CpeP_PMQ04在pH5～10范围内效价几乎没变或略有降低，仍然在10⁹PFU/ml以上；而在pH为4和11的条件下处理3h，其效价仅下降1个数量级，可见该噬菌体对pH的适应范围较广。

如图8所示，噬菌体vB_EcoS_PD468在pH4～11范围内效价几乎没变或略有降低，仍然在8.30×10⁹PFU/ml以上；而在pH为3和12的条件下处理3h，其效价分别下降1个和2个数量级，可见该噬菌体对pH的适应范围较广。

(4)噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定

按照常规方法分别对产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468及其宿主菌进行增殖，测定噬菌体初始效价及宿主菌浓度，并将噬菌体和宿主菌进行适当的稀释。分别按照感染复数为10、1、0.1、 0.01、0.001、0.0001的比例各取100μl噬菌体和宿主菌加入到马丁氏肉汤和普通营养肉汤中。37℃、170rpm摇床培养至液体变澄清，记录液体变澄清时间。 11000rpm离心5min，通过双层平板法测定各噬菌体的效价。

结果表明：产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04的最佳感染复数为0.01，效价为7.20×10⁹PFU/ml；大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468的最佳感染复数为 0.001，效价为5.60×10¹⁰PFU/ml。

实施例3 噬菌体的基因组分析

分别提取产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和大肠杆菌噬菌体 vB_EcoS_PD468的基因组，进行全基因组测序，测序得到的基因组序列在 NCBI的GenBank号为MZ995505.1，对其序列进行分析：

(1)噬菌体vB_CpeP_PMQ04的基因组分析

噬菌体vB_CpeP_PMQ04的基因组大小为38947bp，基因组序列A、G、C、 T 4种碱基所占的比例分别为39.89％、19.35％、11.27％、29.49％，G+C％含量为30.6％。

经RAST预测分析，噬菌体vB_CpeP_PMQ04基因组含有68个开放阅读框(ORFs)；使用在线工具BLASTp和保守域数据库(CDD)分别对噬菌体vB_CpeP_PMQ04的68个ORFs进行比对，其中，噬菌体vB_CpeP_PMQ04 含已知编码功能蛋白41个，其余ORFs为假想蛋白。

噬菌体vB_CpeP_PMQ04的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部(tailprotein)蛋白基因序列见序列表中序列1，高度保守的末端酶大亚基(terminase largesubunit)基因序列见序列表中序列2和序列3。上述基因的具体信息见下表1。

使用BLAST在线工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对噬菌体基因组进行序列相似性比对分析。与其同源性最高的噬菌体为Clostridium phage CPD2，其同源性仅达到95.76％。上述结果说明噬菌体vB_CpeP_PMQ04是一株新的产气荚膜梭菌噬菌体，与现有的近缘噬菌体的亲缘关系较远。

表1 噬菌体的vB_CpeP_PMQ04基因序列信息表

(2)噬菌体vB_EcoS_PD468的基因组分析

噬菌体vB_EcoS_PD468的基因组大小为39015bp，基因组序列A、G、C、 T 4种碱基所占的比例分别为24.51％、22.74％、26.02％、26.73％，G+C％含量为48.76％。

经RAST预测分析，噬菌体vB_EcoS_PD468基因组含有51个开放阅读框 (ORFs)；使用在线工具BLASTp和保守域数据库(CDD)分别对噬菌体 vB_EcoS_PD468的51个ORFs进行比对，其中，噬菌体vB_EcoS_PD468含已知编码功能蛋白35个，其余ORFs为假想蛋白。

噬菌体vB_EcoS_PD468的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部(tailprotein)蛋白基因序列见序列表中序列4和序列5，DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的序列见序列表中序列6。上述基因的具体信息见下表2。

使用BLAST在线工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对噬菌体基因组进行序列相似性比对分析。与其同源性最高的噬菌体为Escherichia phage vB_EcoP_PHB20，其同源性仅达到93.55％。上述结果说明噬菌体 vB_EcoS_PD468是一株新的产气荚膜梭菌噬菌体，与现有的近缘噬菌体的亲缘关系较远。

表2 噬菌体的vB_EcoS_PD468基因序列信息表

实施例5 产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和大肠杆菌噬菌体 vB_EcoS_PD468一步生长曲线的测定

实验方法：将感染复数为0.1的vB_CpeP_PMQ04增殖液和其新鲜增殖液各1mL，充分混匀，37℃孵育5min，12000rpm条件下离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5mL TSB肉汤洗涤1次(12000rpm离心30s)，弃上清。用预热的TSB肉汤混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃厌氧培养，在0时刻和每隔10min取出150μL，10000rpm离心1min，测定效价，做2个平行，结果取平均值，以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到vB_CpeP_PMQ04噬菌体的潜伏期、爆发期和爆发量。

将感染复数为0.1的vB_EcoS_PD468增殖液和其新鲜增殖液各1mL，充分混匀，37℃孵育5min，12000rpm条件下离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5mL NB肉汤洗涤1次(12000rpm离心30s)，弃上清。用预热的 NB肉汤混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm 振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150μL，10000rpm离心1min，测定效价，做2个平行，结果取平均值，以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到vB_EcoS_PD468噬菌体的潜伏期、爆发期和爆发量。

爆发量＝稳定期噬菌体浓度/初始菌浓度

结果:如图9所示，产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04在感染初期 30min内，效价基本没变化，潜伏期约为30min；噬菌体侵染宿主菌30min～ 40min内，进入爆发期，噬菌体效价急剧增加，并在60min后达到稳定，达到 4.8×10⁹PFU/mL，爆发期约为30min，通过计算可得出噬菌体vB_CpeP_PMQ04 爆发量为143。可见该噬菌体的潜伏时间短，且爆发速度快。

如图10所示，大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468在感染初期40min内，效价基本没变化，潜伏期约为40min；噬菌体侵染宿主菌50min～70min为爆发期，噬菌体效价急剧增加，并在70min后达到稳定，达到2.3×10⁹PFU/mL，爆发期约为30min，通过计算可得出噬菌体vB_EcoS_PD468爆发量为158。可见该噬菌体的潜伏时间短，且爆发速度快。

实施例6 噬菌体的裂解率的测定

采用双层平板法测定两种噬菌体的裂解谱，结果分别见下表1和表2。

选取56株不同地区的兔源产气荚膜梭菌作为噬菌体vB_CpeP_PMQ04的裂解实验对象。上述56株菌株是2019-2020年内在山东、四川等地兔场患有坏死性肠炎病兔肠道中分离鉴定出来的致病菌。从表1的实验结果可得：噬菌体vB_CpeP_PMQ04能裂解其中的48株，裂解率达85.71％，这说明该噬菌体对兔源产气荚膜梭菌具有很好的裂解能力。同时对申请人另一件已申请专利(CN202010691495.2)中的魏氏梭菌噬菌体PMQ06同时进行了裂解实验，发现PMQ06裂解上述56株兔源产气荚膜梭菌中的27株，裂解率为48.21％(见表3)。vB_CpeP_PMQ04对56株兔源产气荚膜梭菌的裂解率远远高于 PMQ06的裂解率。

选取66株不同地区的兔源大肠杆菌作为噬菌体vB_EcoS_PD468的裂解实验对象。上述66株菌株是2019-2020年内在山东、四川等地兔场患有兔腹泻的病兔肠道中分离鉴定出来的致病菌。从表4的实验结果可得：噬菌体 vB_EcoS_PD468能裂解其中的48株，裂解率达72.73％，这说明该噬菌体对兔源大肠杆菌具有很好的裂解能力。

表3 噬菌体vB_CpeP_PMQ04和PMQ06针对兔源56株产气荚膜梭菌的裂解谱

表4 大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468针对66株大肠杆菌裂解谱

注：+：裂解，软琼脂平板法有透亮噬菌斑；-：未裂解。

实施例7 噬菌体的安全性试验

实验方法：选择30只体重为20～22g的健康SPF小鼠，雌雄各半，分成 2个实验组和1个对照组(每组10只)，每组小鼠雌雄数量各半。对2个实验组的小鼠分别腹腔注射纯化的产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468增殖液(200μl，10⁹PFU/ml)，对照组的小鼠腹腔注射相同量的生理盐水(200μl)；按照上述方式对各组小鼠连续注射3d，接着对各组的小鼠的行为表现连续观察7d，并剖检观察小鼠脏器的变化。

实验结果：2个实验组和对照组的小鼠行为无异常，无死亡现象；剖检发现实现组小鼠的肝脏、肺脏、心脏、脾脏、肾脏等脏器正常，与对照组无明显差别，这说明本发明提供的产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468的使用安全，无毒副作用。

实施例8 噬菌体预防仔兔腹泻试验

实验方法：选择淄博某兔场进行实验，该兔场的多个兔舍曾多次发生过由于产气荚膜梭菌和大肠杆菌感染引起腹泻的现象。选择8个兔舍，每个兔舍1000只仔，将8个兔舍分为6个试验组和2个对照组。

在试验开始的前3天内，试验组1和试验组2饮水添加产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04，添加量为1000只/20mL，噬菌体使用浓度为 1×10⁹PFU/ml，试验组3和试验组4饮水添加大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468，添加量为1000只/20mL，噬菌体使用浓度为1×10⁹PFU/ml，试验组5和试验组6饮水添加产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468混合制剂添加量为1000只/20mL；之后，每周给兔舍的饮用水添加1～2次噬菌体制剂，添加量按照上面同样的比例；对照组不做处理。观察30d，记录这期间发生腹泻的仔兔只数和死亡只数。

实验结果：如下表5所示，30d内，2个对照舍的仔兔发生腹泻的数量分别为155只和206只，死亡数分别132只和178只；试验组1和试验组2发生腹泻的数量分别为79只和82只，死亡数分别为75只和76只；试验组3 和试验组4发生腹泻的数量分别为71只和77只，死亡数分别为65只和70 只；试验组5和试验组6发生腹泻的数量分别为42只和50只，死亡数分别为35只和38只。

由此可见，单独使用产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468能够显著降低兔舍腹泻的发生数和死亡数，而产气荚膜梭菌噬菌体vB_CpeP_PMQ04和大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468的混合制剂比单独使用的效果有明显提升。

表5 噬菌体组合物对兔腹泻的预防结果

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 青岛诺安百特生物科技有限公司

<120> 一株新型魏氏梭菌噬菌体、包含该噬菌体的噬菌体组合物及其在兔魏氏梭菌病中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 471

<212> DNA

<213> 噬菌体vB_CpeP_PMQ04的尾部蛋白(tail protein of vB_CpeP_PMQ04)

<400> 1

atggaaaaga tattgaattt cataaatgat tatttttata aattttacga aagtggaagt 60

tattcaataa acactaacac tataaaagtt aaaggtaaat atataatagg gcaatatgta 120

agaatagaag gcagtacgtt gaatgacgga gtttacaaag ttgcctttgt agatggtcag 180

aatatcacgc tagaaagcct tacaatgcaa gacgaacagt tcgagggggt aatatcctct 240

cttgctattc caagcgattt aataagcctt aaagctaaaa tagaagcata tgagagtgaa 300

aataaaccga gtgctatcgt aagtgaaagt tttgggaatt attcttatag cttagcaact 360

aatgcaaaag gtcaagcttt aacatggcaa gaagtgtttt caaatgaatt aaaaccatat 420

agaaaaatta aaactgtatg ggataagagg ggggtgaaag aaatatgcta g 471

<210> 2

<211> 414

<212> DNA

<213> 噬菌体vB_CpeP_PMQ04的末端大亚基1(terminase large subunit1 of vB_CpeP_PMQ04)

<400> 2

ttgtattcaa gagagattaa ttttttggag aaaatagcac cgaacttcga tgatttactt 60

tatgatgtta tggagcataa tcacacccat tatatgctta aaggagggag aggaagtacc 120

aaaagttcgt ttgtatctaa ggttattcct cttcttataa tggctaatag tgattgccac 180

gctgttatag tcagaaaagt agggcagaca ttaaaaggtt ctgtttataa tcagatgatt 240

tggtctataa atgatttagg attaaatggt tattttaagg tttataaatc tcctttgaag 300

attgtttata ctccaactaa tcaagaaatt gtctttttag gttgcgacga ccctatgaaa 360

gctaaaggta taaccgttcc attcggtaga ataggaattg tgtggtttaa ctaa 414

<210> 3

<211> 819

<212> DNA

<213> 噬菌体vB_CpeP_PMQ04的末端大亚基2(terminase large subunit2 of vB_CpeP_PMQ04)

<400> 3

atgacacagt cttttataag aaagaatggt gataactggg tgttttatac ttttaaccct 60

cctaaatcta agaataactg ggttaatgaa gagcaactaa ttgatagaga agataggttt 120

atccaccaca gtacctattt aactgttccg tctgattggt tagggcaaca attcataata 180

gaagctgaac atctaaagaa tgtaaaagaa gaagcgtata agcatgaata tttaggtgaa 240

gtaactggaa ctggtggaaa tgtatttgat aatgtaatta taagagaaat aacaaaagag 300

gaaataaata atatggagga atttgagtat ggtgttgact ttggatttag tatagaccct 360

gcaacttggt gtaaaatcca ttataaaaac aacaagcttt atattataga tgaaatatac 420

gaacagggat tgagcaataa aaagctaact gataaaatac tggaaaaaga accaaatatc 480

tataagaagc ctattgttgc agatagtgct gatcctaaat ctatctctga aatgagagga 540

tatggcttaa atatgcaaaa agctaaaaaa ggtcctgata gtagggattt cacttataaa 600

tttttgcaga tgttagatga aattgtaatt gataagaaaa gaactccaaa cgccgctaag 660

gaatttatag gttatgagta tgagatgaat aaagatgggc agtttataag taaatatcca 720

gatgggaatg accactatat agatgcagtt aggtatgcta taatggatat agcaagaaga 780

aaacagaaac gtagctttag tgcgaataga attttttag 819

<210> 4

<211> 441

<212> DNA

<213> 噬菌体vB_EcoS_PD468的尾管蛋白 C5( tail tubular protein C5 of vB_EcoS_PD468)

<400> 4

atggcactca ttagccaatc aatcaagaac ttgaagggtg gtatcagtca acagcctgac 60

atccttcgtt atcccgacca agggtcacgc caagttaacg gttggtcttc ggagaccgag 120

ggcctccaaa agcgtccacc tatggttttc cttaagacac tggggggaag tggtgcctta 180

ggacaagcac ctctcattca cctgataaac cgtgatgagt acgagcggta ctacgcagtg 240

tttaccggaa gtaccatccg agtttttgat ttagctggta acgagaaaca agtgcgtttc 300

cctacagggg cagcgtatgt acagacagct aacccaagga atgaccttcg gatggtaaca 360

gttgccgact acacgtttgt cgttaacagg aacgtcactg taaccgagtc cacagaaatt 420

tcaactggtg gtaactttcg g 441

<210> 5

<211> 591

<212> DNA

<213> 噬菌体vB_EcoS_PD468的尾管蛋白A( tail tubular protein A of vB_EcoS_PD468)

<400> 5

atgcgctcat acgatatgaa cgttgagaca gccgctgagt tatctgctgt gaatgacatt 60

ctggcatcta tcggtgaacc tccggtatcg acgcttgagg gtgactcaaa cgcagacgta 120

gcgaacgctc gacgtattct caacaagatt aacagacaga ttcagtctcg tggttggacg 180

ttcaacattg aggaaggtat tacgcttctt ccagacgttt actccaacct tattgtatac 240

agcgacgact acctatcact aatggctacc tctggtcagt caatctatgt caaccgtggt 300

ggctatgtgt atgaccgaac gagtcaatcg gaccgctttg agtctggcat tactgttaac 360

attatccgac tacgagacta cgacgagatg cctgagtgct tccgctactg gattgtcact 420

aaggcttccc gccagttcaa caaccgattc tttggggcac cagaagtaga gggtgtactc 480

caagaagagg aagatgaggc tcgacgtctc tgtatggagt acgaagtgga ctacggtggg 540

tacaatatgc tggatggcga tgcgttcact tctggtctac tgactcgcta a 591

<210> 6

<211> 2115

<212> DNA

<213> 噬菌体vB_EcoS_PD468的DNA聚合酶(DNA polymerase of vB_EcoS_PD468)

<400> 6

atgatcgttt ctgacatcga agctaacgcc ctcttagaga gcgtcactaa gttccactgc 60

ggggttatct acgactactc caccgctgag tacgtaagct accgtccgag tgacttcggt 120

gcgtatctgg atgcgctgga agccgaggtt gcacgaggcg gtcttattgt gttccacaac 180

ggtcacaagt atgacgttcc tgcattgacc aaactggcaa agttacagtt gaaccgagag 240

ttccaccttc ctcgtgagaa ctgtattgac acccttgtgt tgtcacgttt gattcattcc 300

aacctcaaag acaccgatat gggtcttctg cgttccggta agttgcctgg gaaacgcttt 360

gggtctcacg ctttggaggc gtggggttat cgcttaggcg aaatgaaggg tgaatacaaa 420

gatgacttta agcgtatgct tgaagagcag ggtgaagaat acgttgacgg aatggagtgg 480

tggaacttca acgaggagat gatggactat aacgttcagg acgttgtggt cactaaggct 540

ctccttgaga agctactctc tgacaaacat tacttccctc ctgagattga cttcacggac 600

gtaggataca ctacgttctg gtcagaatcc cttgaggccg ttgacgttga acatcgcgct 660

gcatggctac tcgctaagca agagcgcaat ggattcccgt ttgacacgaa agcaatcgaa 720

gagttgtacg tagagttagc tgctcgacgc tctgagttgc tgcgtaaatt gaccgaaacg 780

ttcggctcgt ggtatcaacc taaaggtggc accgaaatgt tctgccatcc gcgaacaggt 840

aagccactac ctaaataccc tcgcattaag acacctaaag ttggtggcat ctttaagaag 900

cctaaaaaca aggcacagag agaaggccgt gagccttgcg aactggatac ccgcgagtac 960

gttgctggtg ctccttatac gccagttgag cacgtagtgt ttaacccttc gtctcgtgac 1020

cacattcaga agaaacttca agaggctggg tgggtcccca cgaagtacac cgataagggt 1080

gcgcctgtgg tggacgatga ggtactcgaa ggagtacgtg tagatgaccc tgagaagcaa 1140

gctgctatcg acctcattaa agagtacctg atgattcaga agagaattgg tcagtctgct 1200

gagggagata aagcatggct tcgttatgtt gctgaggatg gtaaaattca tggttctgtt 1260

aaccccaatg gtgctgttac tgggcgcgct actcacgctt tccctaacct cgcacagata 1320

cccggtgtcc gttctcctta tggtgagcag tgccgcgctg cttttggcgc tgaacatcac 1380

ttagatggag ttaccggtaa gccttgggtt caggctggta tagacgcctc cggtctggag 1440

ttacgttgct tggcccactt catggctcgc tttgacaacg gtgagtacgc tcacgagatt 1500

ctcaatggtg acatccacac taagaaccag atggctgctg agttgcctac ccgtgataac 1560

gctaagacgt ttatctatgg gttcctctat ggtgctggtg atgagaagat tggacagatt 1620

gtcggtgctg gtaaagagcg cggtaaggaa ctcaagaaga aattccttga gaacacccca 1680

gctattgcag cactccgaga gtctatccaa cagacacttg ttgagtcctc tcagtgggta 1740

gctggtgaac agcaagtcaa gtggaaacgt cgctggatta aaggtctgga tggtcgtaag 1800

gtacacgttc gtagtcctca cgctgccttg aataccctac tacaatccgc tggtgctctc 1860

atctgcaaac tgtggattat caagaccgaa gagatgctcg tagagaaagg cttgaagcat 1920

ggatgggatg gggactttgc gtacatggca tgggtacatg acgaaatcca agtaggttgt 1980

cgtaccgaag agattgctca ggtggtcatt gagaccgcac aggaagcgat gcgctgggta 2040

ggggaccact ggaacttcag gtgccttctt gataccgaag gtaagatggg tcctaattgg 2100

gccgtatgtc actaa 2115

Claims

1.一株新型魏氏梭菌噬菌体，其特征在于，被命名为vB_CpeP_PMQ04，其保藏编号为CGMCC No.20720。

2.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的魏氏梭菌噬菌体。

3.根据权利要求2所述的噬菌体组合物，其特征在于，还包括一株大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_PD468，该噬菌体的保藏编号为CGMCC NO.20718。

4.如权利要求1所述的魏氏梭菌噬菌体和如权利要求2或3所述的噬菌体组合物在制备预防和治疗兔魏氏梭菌病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述魏氏梭菌病为兔腹泻。

6.一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括如权利要求1-3中任一项所述的魏氏梭菌噬菌体或噬菌体组合物。

7.根据权利要求6所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。

8.一种兔饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述的魏氏梭菌噬菌体或所述噬菌体组合物。

9.一种消毒剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1-3中任一项所述的魏氏梭菌噬菌体或噬菌体组合物。

10.如权利要求9的消毒剂的应用，其特征在于，所述消毒剂通过喷雾或浸泡的方式对养殖环境、饲养器具和饲料进行消毒。

11.一种用于兔类产品消毒的生物抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1~3中任一项所述的魏氏梭菌噬菌体或噬菌体组合物；生物抑菌剂的使用方法为：对兔类产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中魏氏梭菌的增殖。