CN114736875B - 一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体及包含该噬菌体的噬菌体组合物及其应用，该噬菌体的保藏号为CGMCC NO.21491，并被分类命名为噬菌体vB_RanS_PT03。该噬菌体不仅可用于制备预防和治疗鸭疫里默氏杆菌病的药物，还可用于制备水禽饲料添加剂以及消毒剂等。该噬菌体对引起鸭传染性浆膜炎的鸭疫里默氏杆菌有较强的裂解作用，其可单独使用或通过鸡尾酒法与其他噬菌体复配成噬菌体组合物进行使用。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，在解决因鸭疫里默氏杆菌造成的感染的同时，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性产气荚膜梭菌和大肠杆菌的问题。

Description

一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)是一种能引起鸭、鹅、火鸡等水禽感染，导致严重发病的重要病原菌。鸭疫里默氏杆菌是革兰氏阴性小杆菌，无芽孢，不能运动，有荚膜，经瑞氏染色呈两极浓染。鸭疫里默氏杆菌主要通过呼吸道和伤口发生感染，也可发生垂直传播，因此鸭疫里默氏杆菌的传染性极强，是严重危害养鸭业发展的主要传染病之一。
鸭疫里默氏杆菌病又叫鸭传染性浆膜炎，1～8周龄的鸭易感，2～4周龄的小鸭最易感染。常见的感染源有成年带菌鸭、被污染的饲料、饮水和空气等，常因引进带菌鸭而导致鸭传染性浆膜炎的发病与流行。鸭疫里默氏杆菌病一旦发生感染，发病率可以达到5％～90％以上，死亡率为5％～75％等，同时，鸭大肠杆菌病、巴氏杆菌病、鸭病毒性肝炎等可促进本病的发生。患病的鸭往往呈现精神沉郁、流眼泪和流鼻液、轻度咳嗽和打喷嚏、排绿色稀粪、共济失调、头颈振颤和休克的症状，最急性病例往往表现为看不到明显症状而突然死亡；一旦病死鸭不能及时处理，会导致空气污染，引起鸭疫里默氏杆菌病在鸭舍中的广泛传播，若不及时加以控制，甚至可以引起周围鸭场发病，而且，一旦发生鸭疫里默氏杆菌病疫情，鸭疫里默氏杆菌难以在鸭群内根除，会导致病鸭不生长或生长缓慢，成为僵鸭，给鸭养殖业造成重大的经济损失。
目前，传统治疗鸭疫里默氏杆菌病的主要方法是使用抗生素，常用的抗生素为氟苯尼考、罗红霉素、喹诺酮类药物等，但由于抗生素的滥用，大量鸭疫里默氏杆菌的耐药菌株出现，甚至出现了多重耐药菌株，对鸭疫里默氏杆菌的治疗造成的巨大的困难。而预防鸭疫里默氏杆菌病发生的主要方法是接种疫苗，但目前随着鸭疫里默氏杆菌更多血清型的发现，疫苗免疫常常得不到好的预防效果。由于预防和治疗两方面均不能取得良好的效果，鸭疫里默氏杆菌病的治疗目前遇到了极大的困难。
噬菌体是生物界中数量最大的生物群体，也是目前已知最大的病毒群，任何细菌都有其对应的噬菌体。噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，烈性噬菌体可以在短时间内侵入宿主细菌，迅速复制并裂解宿主细菌，目前已广泛应用于细菌性疾病的治疗。噬菌体在治疗和预防过程中，仅针对对应的宿主菌，不会破坏动物机体的肠道菌群平衡，无副作用。同时，相比于部分抗生素不能通过血脑屏障造成鸭疫里默氏杆菌病治疗的困难，噬菌体可以通过血脑屏障，裂解定植于鸭头部的鸭疫里默氏杆菌。
但是目前还未出现能有效预防和治疗鸭疫里默氏杆菌病的安全高效的噬菌体产品，因此，研发一种兼具预防和治疗，且效果显著、使用安全的噬菌体制剂用于防治鸭疫里默氏杆菌病迫在眉睫。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体及包含该噬菌体的噬菌体组合物及其应用；该噬菌体不仅可用于制备预防和治疗鸭疫里默氏杆菌病的药物，还可用于制备水禽饲料添加剂以及消毒剂等。该噬菌体对引起鸭传染性浆膜炎的鸭疫里默氏杆菌有较强的裂解作用，其可单独使用或通过鸡尾酒法与其他噬菌体复配成噬菌体组合物进行使用。该噬菌体及其噬菌体组合物使用安全、无副作用，在解决因鸭疫里默氏杆菌造成的感染的同时，避免了因使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性产气荚膜梭菌和大肠杆菌的问题。
为解决上述问题，本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供了一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体，该噬菌体是从山东临沂鸭粪中分离得到的，于2021年01月13日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21491，并被分类命名为噬菌体。
电镜下观测到：该鸭疫里默氏杆菌噬菌体的头部长约80～90nm，头部宽70～80nm，尾部长约250～260nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee onTaxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为长尾噬菌体科，将其命名为vB_RanS_PT03。
第二方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03。这种噬菌体组合物可通过鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03与其他噬菌体复配，用于制备防治鸭疫里默氏杆菌病的各类产品。
第三方面，本申请还提供了上述鸭疫里默氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物在制备预防和治疗鸭疫里默氏杆菌病的药物中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
上述鸭疫里默氏杆菌病包括由鸭疫里默氏杆菌感染引发的各种疾病，包括鸭、鹅、火鸡等水禽因感染鸭疫里默氏杆菌导致的疾病。
优选地，所述鸭疫里默氏杆菌选自鸭源鸭疫里默氏杆菌。在上述发明内容中提到的鸭源鸭疫里默氏杆菌包含多种血清型，包括但不限于Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、IX型、SH型和WZ型。
噬菌体的应用方法为：将上述鸭疫里默氏杆菌噬菌体或其噬菌体组合物或者其加工后的药剂作为治疗药物添加到患有水禽饲料中(即拌料)，或直接进行灌服，或给予肌肉注射(如胸肌注射)，或通过加入饮水中的方式，这种使用方式操作简单，且应用性强。优选地，采用鸡肉注射的方式。实验证明，肌肉注射的治疗效果优于灌服方式。
第四方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分主要为上述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或上述噬菌体组合物。优选地，所述噬菌体药物制剂还包括其他具有协同增效的成分，如抗生素、微生态制剂、抗菌肽和低聚糖等活性成分中的一种或几种。
可选地，上述噬菌体药物制剂的剂型为口服给药剂型或注射给药剂型，优选地，采用口服给药剂型。上述药物制剂的剂型具体为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。
第五方面，本申请还提供一种饲料添加剂，其包括如上所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物，通过与水禽饲料进行混拌后，进行饲喂，从而达到预防或治疗鸭传染性浆膜炎的效果。优选地，饲料中每种噬菌体的效价至少为1×108PFU/g。
第六方面，本申请还提供一种消毒剂，其有效成分主要为所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或包含该噬菌体的噬菌体组合物。优选地，噬菌体的效价为1×108PFU/ml以上。上述环境消毒剂还包含其他用于环境中细菌抑制或消灭的活性成分或其他助剂，如能延长噬菌体持效期的助剂。
上述消毒剂的应用方法为：将消毒剂在屠宰场、水禽产品加工车间及器具、养殖环境中使用，防止环境中鸭疫里默氏杆菌的污染。所述养殖环境包括棚舍、料槽、地面、墙壁、粪便和垫料等。包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施、饲养器具或其他环境表面进行消毒去污，并对饲料进行消毒防腐，这种消毒剂可用于代替抗生素或传统消毒产品，而且其对人体及水禽不会造成损害。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。
第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或噬菌体组合物。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用上述鸭疫里默氏杆菌噬菌体或其噬菌体组合物制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的鸭疫里默氏杆菌、或用于防控由其宿主鸭疫里默氏杆菌侵染导致的疾病。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的鸭疫里默氏杆菌噬菌体对鸭疫里默氏杆菌具有较宽的裂解谱和较强的裂解作用，可以有效防治由鸭疫里默氏杆菌感染引起的疾病；其次，该噬菌体及其噬菌体组合物可作为活性成分用于制备预防和治疗鸭疫里默氏杆菌病的药物、消毒剂、饲料添加剂以及试剂盒等，可广泛应用于水禽养殖过程、以及产品加工生产过程中各个环节，快速、高效、安全杀灭致病性鸭疫里默氏杆菌乃至耐药性鸭疫里默氏杆菌，有效降低发水禽的病发率和死亡率。
2、本发明提供的鸭疫里默氏杆菌噬菌体制剂可制成粉剂、水剂或冻干剂，通过注射、口服、喷雾等方式给药，可以快速、有效的方式裂解动物体内的鸭疫里默氏杆菌。本发明提供的鸭疫里默氏杆菌噬菌体无毒副作用，安全性高，无残留，不影响动物肠道菌群平衡，对鸭疫里默氏杆菌病的治疗有较好的作用，为水禽业鸭疫里默氏杆菌病的治疗提供一种绿色新型生物制剂。
附图说明
图1为噬菌体vB_RanS_PT03的噬菌斑图片；
图2为噬菌体vB_RanS_PT03的电镜图片；
图3为噬菌体vB_RanS_PT03热稳定性图片；
图4为噬菌体vB_RanS_PT03的pH稳定性图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1噬菌体的分离培养和生物学特性
(一)菌种的复苏培养和菌悬液的制备
吸取本实施例中鸭疫里默氏杆菌的冻存菌液，将其在TSA平板(加5％新生牛血清)上三区划线，分离单菌落，37℃烛缸中培养24～48h。挑取单菌落，接种5ml TSB肉汤(加5％新生牛血清)中，37℃空气振荡器中，220rpm振荡培养20h，得到单一的菌悬液。
(二)噬菌体的分离与纯化
取临沂某养鸭场的鸭粪样、垫料、污水以及皮毛等样品，加入适量的无菌PBS，37℃，170rpm振荡60min，11000rpm离心5min，取上清后0.45μm细菌滤器过滤备用。
每个50ml离心管中按照25％的量加入各株鸭疫里默氏杆菌，按照25％的量加入离心过滤的上清液，按照50％的量加入2×TSB培养基(加5％新生牛血清)搅拌均匀后，于37℃烛缸，静置培养过夜，11000rpm离心5min，0.45μm的细菌滤器过滤除菌后滤液备用；重复上一步骤，将滤液和宿主菌混合，37℃孵育15min后倒双层平板，待凝固后放入37℃烛缸中倒置培养过夜。
若有噬菌体存在，则会在培养基上形成透明、规则的圆形空斑，即为噬菌斑。抠取单个噬菌斑，于1ml SM缓冲液中，37℃的空气振荡器中浸出60min，再置于4℃冰箱中静置3h，11000rpm离心5min，取上清再用双层平板法得到单个的噬菌斑，如此重复3～5次直至形成圆形透明斑块，边界清晰，斑块直径约0.5mm的噬菌斑，见图1。
(三)噬菌体的增殖和效价测定
1、实验方法：
取100μl宿主菌和噬菌体抠斑浸出液加入到5ml TSB肉汤(加5％新生牛血清)中，于37℃的空气振荡器180rpm的条件下培养5～8h，待混合液变澄清，得到噬菌体增殖液。按照10倍倍比稀释噬菌体增殖液，再通过双层平板法测定噬菌体的效价，每个稀释度分别做3个平行样。
2、实验结果：
取稀释度为10-6/2的3个平行样计数，分别得到161、178和180个噬菌斑，计算效价为3.46×109PFU/ml。
(四)透射电镜观察噬菌体的形态
1、实验方法：
取高于1×109PFU/ml噬菌体样品20μl滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μl的2％的磷钨酸(PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照。
2、观察结果：
如图2所示，电镜条件测定得到，所述噬菌体的头部长约80～90nm，头部宽70～80nm，其尾部长约250～260nm；根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，该噬菌体的形态符合长尾噬菌体科的特征，属于长尾噬菌体科，并将该噬菌体命名为vB_RanS_PT03。
(五)噬菌体的热稳定性检测
1、实验方法：
将3.46×109PFU/ml的噬菌体vB_RanS_PT03的增殖液分别于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，水浴中作用30min，每个温度设两个平行组。双层平板法测定噬菌体的效价。
2、实验结果及分析：
实验结果显示：如图3所示，噬菌体vB_RanS_PT03在40℃～55℃作用30min后基本保持原活性；60℃作用30min成斑率只有40℃作用30min的成斑率的一半。试验结果说明噬菌体vB_RanS_PT03能够耐受55℃以下的高温。
(六)噬菌体的pH稳定性检测
1、实验方法：
取1.5ml的无菌离心管，并分别向各管中加入不同pH值(4、5、6、7、8、9、10)的900μl的SM缓冲液置，并置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，向各管中分别加入100μl的3.46×109PFU/ml的噬菌体增殖液，混匀，37℃水浴作用1h。作用结束之后，分别从各离心管中吸取200μl的混合液，将其加入含有800μl SM缓冲液的1.5ml离心管中，通过双层平板法测定不同PH处理后的噬菌体的效价。
2、实验结果：
如图4所示，在pH4～9范围内，噬菌体vB_RanS_PT03的效价几乎没变，仍然保持在109PFU/ml以上，其在PH10的条件下作用1小时后其效价仅略有下降，这说明噬菌体vB_RanS_PT03能够耐受一定的酸碱性，对酸碱性环境的耐受性较好。
(七)噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定
1、实验方法：
按照常规方法增殖鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03和宿主菌鸭疫里默氏杆菌T110，测定噬菌体初始效价及宿主菌浓度，并将噬菌体vB_RanS_PT03和宿主菌进行适当的稀释。按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01的比例各取200μlvB_RanS_PT03和宿主菌T110加入到TSB肉汤中。于37℃，220rpm振荡培养至液体变澄清，记录液体变澄清时间。11000rpm离心5min，双层平板法测定噬菌体的效价。
2、实验结果：
在感染复数为0.1条件下，噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为4.24×109PFU/ml，在5个感染复数中噬菌体滴度最高。
实施例2噬菌体的基因组分析
提取鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03的基因组，进行全基因组测序，测序得到的基因组序列在NCBI的GenBank号为MZ995504.1，对其序列进行分析：
(1)噬菌体vB_RanS_PT03的基因组分析
噬菌体vB_RanS_PT03的基因组大小为44001bp，基因组序列A、G、C、T 4种碱基所占的比例分别为36.94％、16.16％、18.65％、36.94％，G+C％含量为34.81％。
经RAST预测分析，噬菌体vB_RanS_PT03基因组含有79个开放阅读框(ORFs)；使用在线工具BLASTp和保守域数据库(CDD)分别对噬菌体vB_RanS_PT03的79个ORFs进行比对，其中，噬菌体vB_RanS_PT03含已知编码功能蛋白28个，其余ORFs为假想蛋白。
噬菌体vB_RanS_PT03的基因组中：高度保守的末端酶大亚基(terminase largesubunit)基因序列见序列表中序列1，酪氨酸型重组酶/整合酶(tyrosine-typerecombinase/integrase)基因的序列见序列表中序列2。上述基因的具体信息见下表1。
表1噬菌体的vB_RanS_PT03基因序列信息表
Figure BDA0003551906720000091
实施例3噬菌体的裂解谱的测定
1、实验方法：
采用双层平板法测定上述噬菌体的裂解谱，方法具体为：按照实施例1中的方法得到176株不同宿主菌的菌悬液(这176株鸭疫里默氏杆菌均为鸭源分别分离自山东、重庆、广东、陕西、浙江、福建等地)。将100μl的各个宿主菌的菌悬液分别与100μl的鸭疫里默氏杆菌噬菌体于37℃条件下孵育15min后，加入上层琼脂中(加5％新生牛血清)制备双层平板，待琼脂凝固后置于37℃的恒温箱中倒置培养过夜观察裂解结果。
2、实验结果及分析：
如图2所示，将上述176株鸭疫里默氏杆菌作为宿主菌进行裂解谱的测定，发现，噬菌体vB_RanS_PT03能裂解其中的136株，其裂解率达77.3％。
表2鸭疫里默氏杆菌噬菌体裂解谱
Figure BDA0003551906720000101
Figure BDA0003551906720000111
注：+：裂解，软琼脂平板法有透亮噬菌斑；-：未裂解。
实施例4噬菌体的安全性试验
1、实验方法：
选择20只体重相近的健康10日龄白羽肉鸭，均分到实验组和对照组，对实验组和对照组的白羽肉鸭分别灌服纯化的噬菌体增殖液(300μl，109PFU/ml)和生理盐水(300μl)，连续灌服7d，观察鸭只的行为表现，再剖检观察鸭只组织脏器的变化。
2、实验结果：
实验组和对照组的鸭只行为无异常，解剖结果显示：实验组鸭只的肝脏、心脏、脾脏、肾脏、脑等组织器官都正常，与对照组无明显差别；这说明本发明提供的鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03使用安全，无毒副作用。
实施例5噬菌体预防鸭疫里默氏杆菌病试验
1、实验方法：
选择体重相近的健康10日龄的白羽肉鸭40只，将其均分为试验组和对照组(每组20只)。对试验组每只白羽肉鸭口服1ml的1×109PFU/ml鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03进行预防，对照组每只口服等量生理盐水；给予噬菌体2h后，分别对试验组和对照组的白羽肉鸭颈部皮下注射0.5ml血清型Ⅰ型的鸭疫里默氏杆菌临床分离菌株T109(5×108CFU/只)，观察鸭状态，记录鸭只的死亡情况，连续观察7d。7d后剖检所有的鸭只观察组织器官的病理变化。
2、实验结果及分析：
观察到：7d内，预防试验组的白羽肉鸭的死亡只数为3只，死亡率为15％；对照组死亡16只，死亡率为80％，噬菌体的保护率达到85％，说明该噬菌体可以有效预防鸭疫里默氏杆菌病的发生。
实施例6噬菌体对鸭疫里默氏杆菌攻毒治疗试验
(一)口服治疗试验
1、实验方法：
选择体重相近的健康10日龄白羽肉鸭40只，均分到治疗组和对照组(每组20只)。对每组的鸭只分别颈部皮下注射0.5ml的血清Ⅰ型的鸭疫里默氏杆菌临床分离菌株T109(5×108CFU/只)，处理2h后，治疗组每天灌服含有1×109PFU鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03悬浮液(溶剂为生理盐水)进行治疗，对照组每天灌服等量生理盐水，1次/d，连用3d，观察两组的鸭只状态，并记录鸭只死亡情况，停药后观察7d后。
2、实验结果及分析：
治疗组的鸭只死亡7只，其死亡率为35％，对照组的鸭只死亡17只，死亡率为85％，鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03的保护率为65％。该结果表明，口服噬菌体能够有效治疗鸭疫里默氏杆菌病，且效果明显。
(二)胸肌注射治疗试验
1、实验方法：
选择体重相近的健康10日龄白羽肉鸭40只，分为治疗组和对照组。对两组白羽肉鸭分别颈部皮下注射0.5ml血清Ⅰ型的鸭疫里默氏杆菌临床分离菌株T109(5×108CFU/只)，处理2h后，对治疗组的鸭只每天胸肌注射1ml含有1×109PFU/ml的鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03进行治疗，对照组每天腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连用3d，观察鸭只状态，记录鸭只死亡情况，停药后观察7d后。
2、实验结果及分析
治疗组的鸭只死亡4只，死亡率为20％，对照组鸭只死亡15只，死亡率为75％，鸭疫里默氏杆菌噬菌体vB_RanS_PT03保护率为80％。结果表明，胸肌注射噬菌体能够有效治疗鸭疫里默氏杆菌病，且其治疗效果优于灌服方式。
实施例7噬菌体对鸭养殖场环境消毒试验
1、实验方法：
消毒剂的制备：鸭疫里默氏杆菌噬菌体发酵液。
选择临沂某肉鸭养殖场进行试验，选取2个不相邻的鸭舍分别作为试验舍和对照舍，每个鸭舍2000只13日龄白羽肉鸭。试验组中，每日对鸭舍通过喷雾喷洒2L 1×108PFU/ml鸭疫里默氏杆菌噬菌体；对照组中，每日对鸭舍采用喷雾喷洒等量饮用水。其他按照鸭场规程正常饲喂、用药、免疫。连续喷雾喷洒噬菌体5d，1次/d。记录试验舍和对照舍的死淘率，并对死亡鸭只进行剖检并分离鸭疫里默氏杆菌。
2、实验结果及分析：
结果显示，对照舍日死淘鸭只50～100只，并逐日上升，14d共死亡鸭只847只，死亡率为42.35％；其中，对847只死亡鸭只剖检后分离到鸭疫里默氏杆菌523株。试验舍14d共死亡鸭只198只，死亡率仅为9.9％，198只死亡鸭只剖检后分离到鸭疫里默氏杆菌103株。上述结果表明，经过鸭疫里默氏杆菌噬菌体消毒剂处理的试验舍的死亡率得到大幅度地降低，鸭疫里默氏杆菌噬菌体对鸭场可进行有效的消毒，裂解环境中鸭疫里默氏杆菌，显著减少鸭疫里默氏杆菌病在鸭群中的发病率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 青岛诺安百特生物科技有限公司
<120> 一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1044
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_RanS_PT03的末端酶大亚基(terminase large subunit of vB_RanS_PT03)
<400> 1
atggactttg atacactaca taggaaacga gtaaaacaat acggaagaac ccttgaacaa 60
atctacaatg gtttgattgc aagggtttca tctttggtcg ttaagtctga tattacaaac 120
aagatttacc gcttccgcaa taataaaaaa atactactgg agattgaaaa ggctttagat 180
tcttattaca aaaacacgct taatactatc aatataggaa cggagaaaca gtggcaattc 240
gcaaatgaaa aatacaatgc tttgcgaata gctactttgg aaaggttagc tcataaacta 300
agcaaggaaa cctatatccg agagattgaa aaggtagcaa aaacgcctca taacctcaaa 360
gccttacatt cttttcagca acgaaagata aacgatttta cactatccga gagagtttgg 420
agtattaccc aacaagtaaa gtccgagtta gagatggcta ttgatgttag cctttcggag 480
ggaatgagtg ccaatgaact cgctcgtaaa atcaaaaaga acctaaacga acccgacaga 540
ctataccgca ggataagaga caagcacggc aatttagtat taagtcaaaa tgccaaatat 600
tataatccag gtcagggcgt ttaccgttcg gcacacaaaa acgctttgcg attagctaag 660
gaagaaatta acaccgctta ccgcaccagc gaacaaataa gaataatgca gaataatgat 720
gtggtgggcg tagaaattca tttatcccca agtcataaag tttacgacat ttgcgatgag 780
ttagcaggaa gataccctaa aaactttatc tggaacaagt ggcatattgg ctgtatgtgc 840
cacagaagaa ccattttaaa aagcgatgag gaacttataa aggaactcaa caataaccaa 900
gaactgccac ctgaaacctc taaatactat ataggagcaa caccgaagca gtttaatcag 960
tgggttaaag acaataaaga ccgctttaag aattggaagt ataagcctga atggatagaa 1020
aataatgcta aattactttc ataa 1044
<210> 2
<211> 453
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_RanS_PT03的酪氨酸型重组酶/整合酶(tyrosine-typerecombinase/integrase of vB_RanS_PT03)
<400> 2
atgagtccta ctgaaaaagg aaagatattt gaggattatg ttcaggatat aatgtttcct 60
gttgatagat atatagtcgt tagaaagacg cctaattttg aggacgcaag caaacgattg 120
atagaagatt gcaataatcc tgattttaca tttagaagaa taagaacagg gaaggagtat 180
agcgtagagg ctaaattcag aatacctaga gggtacaatg ttaatgtttg tacggaagaa 240
cagctagaga gatatagaaa gtatgatgag caaagcccta cttttatggc tttaggaata 300
ggagggtgtc cgtctagtcc tacgatatta ctgttttttc atataagtaa gctggcgagc 360
accaatattt tcttacctga tttctttaag gataattatt tcagattgaa cagccctgta 420
ttttctaagt atatggaaaa attattaaga tga 453

Claims (11)

1.一株鸭疫里默氏杆菌噬菌体，其特征在于，被命名为vB_RanS_PT03，其保藏编号为CGMCC NO.21491。
2.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体。
3.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体和如权利要求2所述的噬菌体组合物在制备预防和治疗鸭疫里默氏杆菌感染的疾病的药物中的应用。
4.一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或权利要求2所述的噬菌体组合物。
5.根据权利要求4所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂还包括其他特定病原菌的噬菌体。
6.根据权利要求4所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
7.一种饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或权利要求2所述的噬菌体组合物。
8.根据权利要求7所述的饲料添加剂，其特征在于，饲料中噬菌体的效价≥108PFU/g。
9.一种消毒剂，其特征在于，有效成分包括如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体或权利要求2所述的噬菌体组合物。
10.根据权利要求9所述的消毒剂，其特征在于，每种噬菌体的使用浓度为1×108PFU/ml以上。
11.如权利要求9的消毒剂的应用，其特征在于，所述消毒剂通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具和饲料进行鸭疫里默氏杆菌的消毒。
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