CN107513510A

CN107513510A - 鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107513510A
Application number: CN201710784319.1A
Authority: CN
Inventors: 吴彩艳; 董嘉文; 吕敏娜; 廖申权; 李林林; 孙敏华; 张建峰; 孙铭飞; 徐志宏
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-09-04
Filing date: 2017-09-04
Publication date: 2017-12-26
Also published as: CN108486012A; CN108486012B

Abstract

本发明公开了鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗及其制备方法，本发明的鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗含有鸭疫里默氏杆菌GD株冻干保护剂，鸭疫里默氏杆菌GD株已于2016年4月1日送交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2016161。本发明的鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗安全性好，不会对鸭只产生任何不良反应；免疫效果好，能显著提高雏鸭对鸭疫里默氏杆菌病的抵抗力，可以用于临床上预防鸭疫里默氏杆菌病，具有重大的经济和社会效益。

Description

鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于动物疫苗领域，涉及一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗及其制备方法。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭疫综合征，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一种接触性急性或慢性败血性传染病，主要侵害2-7周龄的雏鸭，临诊上主要表现为眼和鼻分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、共济失调和头颈震颤，慢性经过的病鸭主要表现为脑膜炎症状、颈斜、生长缓慢或成僵鸭，病变以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征，死亡率高达90％，给养鸭业造成巨大的经济损失。调查显示，我国各地均有鸭疫里默氏杆菌病的发生。由于RA具有抗原的多样性和变异性，因此血清型的种类多且复杂，全世界公认有21个血清型，且各型之间几乎无交叉保护。目前普遍采用的方法是选取当地主要流行的血清型菌株研制灭活疫苗，可以达到较好的预防效果。但是雏鸭免疫灭活疫苗后抗体产生时间较慢，免疫持续期较短。而雏鸭免疫弱毒活疫苗后10天即可产生较高水平的抗体，并且免疫持续期较长，能够满足肉鸭养殖生产的需要。

吴彩艳等于2012年从广东地区雏鸭中分离到1株鸭疫里默氏杆菌GD株，通过生物学特性、分子生物学技术和动物回归试验等对GD株进行鉴定。迄今为止，国内未见关于鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗研究的报道。因此，研制一种安全有效的预防鸭疫里默氏杆菌病的疫苗对我国养鸭业的发展具有重要意义。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗，该弱毒活疫苗安全性好，免疫效果可靠。

本发明的目的在于提供一株新菌株鸭疫里默氏杆菌GD株及其应用。

本发明的目另一的在于提供一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗及其制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

鸭疫里默氏杆菌GD株，其分类命名为(Riemerella anatipestifer)GD，已保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2016161。

鸭疫里默氏杆菌GD株株在制备鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗中的应用。

一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗，其特征在于，该弱毒活疫苗中含有鸭疫里默氏杆菌GD株。

进一步的，上述弱毒活疫苗中还含有冻干保护剂。

进一步的，上述冻干保护剂的配方为：明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。

一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)将鸭疫里默氏杆菌GD株进行扩大培养，收获扩大培养后的菌液；

2)将上步扩大培养后的菌液离心浓缩；

3)将离心后的菌液加冻干保护剂混匀，冷冻真空干燥后即得。

进一步的，步骤1)的具体操作为：将鸭疫里默氏杆菌GD株菌种划线接种于含新生牛血清的TSA平板，36.5～37.5℃培养16～24h，挑单菌落接种于含新生牛血清的TSB培养基中，于36.5～37.5℃、160～180rpm/min震荡培养16～24h既得种子液，再将种子液按体积比1:80～150接种于含新生牛血清的TSB培养基中扩大培养，于36.5～37.5℃摇床160～180rpm/min震荡培养16～24h，得扩大培养后的菌液。

进一步的，步骤2)的具体操作为：将扩大培养后的菌液置于无菌离心管中，于5000～8000rpm/min、离心8～12min，收获沉淀，按体积比45～55:1浓缩后溶于培养液中。

进一步的，步骤3)的具体操作为：将浓缩后的菌液与冻干保护剂按体积比0.8～1.2:1进行混匀，–80℃预冻12～16h，转置冷冻真空干燥机中冻干。

进一步的，上述冻干保护剂配方为明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比；将该配方物质混匀后经高压灭菌后制得。

申请人将本发明菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏中心于2016年4月1日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC NO：M 2016161，建议的分类命名为鸭疫里默氏杆菌GD Riemerellaanatipestifer GD，已于2016年4月8日鉴定保藏的菌株是存活的。

本发明的有益效果是：

本发明免疫弱毒疫苗组保护率为100％，免疫油乳剂灭活疫苗组保护率为95％，表明本发明的弱毒疫苗具有较好的保护效果，并且保护效果优于油乳剂灭活疫苗。可见本发明疫苗能保护雏鸭抵抗强毒RAQY株的攻击，可以用于临床上预防鸭疫里默氏杆菌病。

本发明的鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗安全性好，即使用量达3.8×10¹⁰CFU/只，也不会对鸭只产生任何不良反应；免疫效果好，能显著提高雏鸭对同型鸭疫里默氏杆菌的抵抗力，可以用于临床上预防鸭疫里默氏杆菌病，具有重大的经济和社会效益。

附图说明

图1为鸭疫里默氏杆菌GD株在平板上的生长状态；左为麦康凯琼脂平板；右为TSA平板；

图2为鸭疫里默氏杆菌GD株PCR鉴定结果；M.DNA标准DL2000；1.鸭疫里默氏杆菌标准株；2.鸭疫里默氏杆菌GD株；

图3为鸭疫里默氏杆菌GD株16s rRNA PCR鉴定结果；M.DNA标准DL2000；1,2.鸭疫里默氏杆菌GD株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1鸭疫里默氏杆菌GD株

1、菌株来源、保藏情况

本疫苗生产用菌株是黄杆菌科，里氏杆菌新属,鸭疫里默氏杆菌GD株，是本发明人于2012年从广东省某鸭场雏鸭心脏中分离而得，已于2016年4月1日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M 2016161。经革兰氏染色、PCR技术、动物回归试验、生化试验等方法进行鉴定。

2、菌株特性

(1)鸭疫里默氏杆菌GD株的形态

无菌方法取鸭的心脏，划线接种于TSA平板和麦康凯琼脂平板，于37℃烛缸中培养18～24h，挑取单个可疑菌落进行纯培养。该菌在TSA平板上长成光滑、湿润、半透明的奶油状菌落，而在麦康凯平板上无细菌生长(见图1)。

(2)鸭疫里默氏杆菌GD株的革兰氏染色

挑取纯培养的单菌落进行革兰氏染色并镜检，观察细菌的形态和染色特性。镜检观察到该菌为革兰氏阴性的小杆菌，单个或成对存在，无鞭毛。

(3)鸭疫里默氏杆菌GD株的生化试验

将纯培养物分别接种于各种微量生化发酵管，于37℃恒温培养箱中培养后观察并记录结果。该菌不发酵蔗糖、乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇；不产生硫化氢，不利用柠檬酸盐；甲基红试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验阴性；氧化酶、过氧化物酶试验阳性。

(4)鸭疫里默氏杆菌GD株的PCR鉴定

根据覃宗华等报道(覃宗华、蔡建平、吕敏娜、余劲术、吴彩艳、温列娜、谢明权，鸭疫里默氏杆菌病与大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用，畜牧兽医学报，517-521。)合成一对鸭疫里默氏杆菌特异性引物RA-F、RA-R(引物由Invitrogen合成)，预期扩增产物大小为342bp。鸭疫里氏菌基因组DNA，采用Promga公司基因组DNA提取试剂盒提取。

PCR扩增反应：以鸭疫里氏菌GD株基因组DNA为模板，用RA-F：AC GTCA TCCCACC TTCC TC(SEQ ID NO：4)、RA-R：GT TCA GAC TAA GC GAAA G(SEQ ID NO：5)引物，按如下体系进行，反应体积20μL，Premix Taq 10μL，primer(RA-F)1μL，primer(RA-R)1μL，基因组DNA 1μL，ddH₂O 7μL，总体积20μL。PCR扩增程序如下:94℃预变性5min,然后进行30个循环，PCR的扩增(94℃变性30s、50℃退火1min、72℃延伸1min),然后72℃延伸7min。反应结束后取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳,酶切回收目的片段并与pGEM2T-easy连接后转化E.coliJM109。经菌落PCR鉴定和限制性酶切分析均为阳性的克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。结果，通过特异性PCR扩增，分离株扩增到300bp大小的条带，与目的条带大小一致(见图2)。

(5)鸭疫里默氏杆菌GD株的血清型鉴定

利用玻片凝集试验鉴定分离株的血清型，将自制的兔抗RA标准株1型、2型、3型、4型、5型、8型、9型、10型高免血清与制备的凝集抗原按常规方法进行凝集试验，凝集抗原的制备根据吴彩艳等报道方法进行(吴彩艳、覃宗华、袁建丰、吕敏娜、余劲术、蔡建平，广东地区鸭疫里默氏杆菌的血清型及抗药性情况调查，畜牧与兽医，22-25)。结果该分离株凝集抗原与1型高免血清凝集，与其它血清型高免血清均不凝集，因此确定GD株为血清1型。

(6)鸭疫里默氏杆菌GD株16s rRNA序列的测定

根据细菌通用引物合成一对16s rRNA引物，引物序列分别为16s rRNA-F：5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:1)、16s rRNA-R：5‘-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’(SEQ ID NO:2),引物由Invitrogen合成，预期扩增产物大小为1571bp。细菌DNA的提取，采用Promga公司基因组DNA提取试剂盒，根据说明书中不同样品基因组DNA提取的具体方法提取鸭疫里氏菌基因组DNA。

PCR扩增反应以鸭疫里氏菌GD株基因组DNA为模板，以16s rRNA-F、16s rRNA-R引物，按如下进行，反应体积50μL，premix Taq 25μL，primer(16s r RNA-F)1μL，primer(16srRNA-R)1μL，基因组DNA 1μL，ddH₂O 22μL，总体积50μL。PCR扩增程序如下:94℃预变性5min,然后进行35个循环，PCR的扩增(94℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min),然后72℃延伸7min。反应结束后取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳,酶切回收目的片段并与pMD18T-easy连接后转化E.coli JM109。经菌落PCR鉴定为阳性的克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。通过特异性PCR扩增，分离株扩增到1509bp大小的16s rRNA，与目的条带大小一致(见图3)，扩增所得16s rRNA测序结果的序列如SEQ ID NO：3所示。

即16s rRNA：AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCGGGAGGCCTAACACATGCAAGCCGAGCGGTAGAGTGTCTTCGGATACTTGAGAGCGGCGTACGGGTGCGGAACACGTGTGCAACCTGCCTTTATCTGAGGGATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCTCATAATATACTGATTGGCATCAATTAGTATTGAAAGCTCCGGCGGATAGAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCAATGATCTTTAGGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGTGCAAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGAAGGACGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTGTACAGGGATAAACCTACTCTCGTGAGGGTAGCTGAAGGTACTGTACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGCAGGCGGGCTAGTAAGTCAGTGGTGAAAGCCTACAGCTTAACTGTAGAACTGCCGTTGATACTGCTAGTCTTGAGTATAGTTGAGGTAGCTGGAATGAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTCAGAACACCGATTGCGAAGGCAGGTTACCAAGTTATAACTGACGCTGAGGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCTAACTCGTTTTTGGGCTATATGGTTCAGAGACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGATCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGGCTTAAATGGGAATTGATAGCTGTAGAAATACGGTTTTCTTCGGACAATTTTCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTCACTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGGACTCTAGTGAGACTGCCTACGCAAGTAGCGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTTGGGCCACACACGTGATACAATGGCCGGTACAGAGGGCAGCTACACTGCGAAGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCTGGGGGTACCTGAAGTCGGTGGCCGTAAAAGGAGCTGCCTAGGTAAAACTAGTAACTAGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT(SEQ ID NO：3)。

应用DNAStar 5.07分析软件包对测序得到的GD株的序列进行拼接，GD株16s rRNA基因序列全长为1509bp。从NCBI数据库中搜索鸭疫里默氏杆菌属代表菌株的基因序列，应用NCBI数据库中在线BLAST对基因序列进行同源性检索，在此基础上，进行基因的系统发育分析，采用常用的邻位相接法(Neighbor-Joining)构建进化树，并用Bootstrap值来评估进化树的可靠性。GD株16s rRNA序列BLAST结果显示，GD株与2007年从福建分离的鸭疫里默氏杆菌的序列相似性最高，达99％，仅有1个碱基的差异。

(7)鸭疫里默氏杆菌GD株的药敏试验

按K-B标准纸片法进行，即用灭菌棉拭子沾取菌液，在TSA平板上均匀涂布，待平板面稍干，用灭菌镊子将上述药敏纸片平放在板上，然后将平板于37℃培养18～24h，测量并记录各分离株抑菌圈的直径。

结果显示，GD株对阿莫西林、头孢噻吩、利福平、氨苄青霉素、头孢曲松钠、头孢氨噻肟、氧氟沙星、氟苯尼考、痢特灵、庆大霉素、复方新诺明和恩诺沙星、丁胺卡那、四环素、环丙沙星、强力霉素、新霉素、先锋必素、左氧沙星、奥复兴、青霉素敏感，对链霉素、克拉霉素、罗红霉素、多粘菌素B均敏感。

(8)鸭疫里默氏杆菌GD株的致病力试验

从中国农业科学院哈尔滨兽医研究所购入1日龄SPF鸭100只，在实验室条件下饲养至21天后分组，设试验组4组，生理盐水对照组1组，每组各10只。经腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌GD株菌液和生理盐水，1～4组注射剂量分别为3.8×10⁸CFU/只，3.8×10⁹CFU/只，1.9×10⁹CFU/只，3.8×10¹⁰CFU/只；对照组注射生理盐水0.5mL/只，隔离饲养。接种后连续观察14天，结果接种组和对照组均无明显异常，试验期间未见鸭只死亡。剖检检查病理变化，对照组和试验组均无明显鸭疫里默氏杆菌病病变，说明当接种剂量为免疫剂量的10倍、50倍、100倍时对雏鸭均无明显致病力。

(9)鸭疫里默氏杆菌GD株的稳定性试验

2周龄SPF鸭经腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌GD株，接种剂量为3.8×10⁸CFU/只，3～5天后剖检观察病变并无菌采集肝脏、心脏等病料，研磨病料并离心取上清肌肉注射2周龄SPF鸭，如此反复4次，最后一次接种后观察21天，分离鸭疫里默氏杆菌。

结果：2周龄SPF鸭经腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌GD株，剖检未见鸭疫里默氏杆菌病典型病变，经鸭体连续传递4代后，未见毒力返强现象，最后1次接种组织病料，观察21天后未分到鸭疫里默氏杆菌。结果表明GD株遗传性能稳定。

实施例2鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗及其制备方法

实验材料：鸭疫里默氏杆菌GD株，由广东省农业科学院动物卫生研究所寄生生物研究室于2012年从广东省分离及鉴定，于2016年4月1日送交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2016161，检测结果为存活。1日龄SPF鸭购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，用于安全性和免疫效力试验。

鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗的制备步骤如下：

1)菌种

将鸭疫里默氏杆菌GD株接种于TSA(含5％新生牛血清)平板，置37℃温箱中培养18-24h，挑取单个菌落接种于TSB(含5％新生牛血清)培养基，于37℃摇床160～180rpm/min震荡培养16～24h即得种子液，作为基础种子和生产用菌种备用。

2)扩大培养

将种子液按体积比1:100接种于TSB(含5％新生牛血清)培养基中扩大培养，于37℃摇床160～180rpm/min震荡培养16～24h，测定菌液OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值为1.0时，判为合格，无菌收获含菌菌液，用于制备疫苗。

3)杂菌检验

将制备的菌液接种于TSA(含5％新生牛血清)平板和麦康凯平板，置37℃温箱中培养18～24h。结果在TSA平板生长光滑、湿润、半透明的奶油状菌落，而麦康凯平板无细菌生长，因此该菌液无杂菌生长，可用于制备疫苗。

4)制苗

将收获的菌液离心浓缩并重悬于适量的TSB培养基中，与冻干保护剂按1:1混匀，分装于灭菌的西林瓶中，-80℃预冻12～16h，冷冻真空干燥40～48h后即得本发明的“鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗”。制备好的疫苗密封后置于-20℃冰箱保存备用。

所述冻干保护剂配方为明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比；将该配方中物质混匀后经高压灭菌后制得。

下面对本发明制得的鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗做进一步的效果检测。

一、鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗安全性试验

共进行了2次试验。第一次试验用疫苗批号为1402，将1瓶冻干苗溶于250mL生理盐水。将30只2周龄SPF鸭随机分成3组，每组10只，第一组为对照组，经腿部肌肉接种生理盐水，剂量为0.5mL/只；第二组为试验组，经腿部肌肉接种实施例2所得疫苗，剂量为0.5mL/只；第三组为试验组，经腿部肌肉接种实施例2所得疫苗，1.0mL/只，隔离饲养，连续观察14天。结果，对照组和2个试验组均未见不良反应，表明该疫苗安全性较好。

第二次试验用疫苗批号为1421，将1瓶冻干苗溶于250mL生理盐水。将30只2周龄SPF鸭随机分成3组，每组10只，第一组为对照组，经腿部内侧肌肉接种生理盐水，剂量为0.5mL/只；第二组为试验组，经腿部肌肉接种实施例2所得疫苗，剂量为0.5mL/只；第三组为试验组，经腿部肌肉接种实施例2所得疫苗，1.0mL/只，隔离饲养，连续观察14天。结果，对照组和2个试验组均未见不良反应，表明该疫苗安全性较好。

二、鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗效力试验

共进行了2次试验。第一次试验用疫苗批号为1402，将1瓶本发明实施例2所得疫苗溶于250mL生理盐水。取88只5日龄健康SPF鸭随机分成4组，第一组22只，为不免疫不攻毒对照组，第二组22只，为不免疫攻毒对照组，第三组22只，为免疫本发明实施例2所得疫苗组，接种剂量为0.5mL/只；第四组22只，为免疫组，免疫油乳剂灭活疫苗，将1型鸭疫里氏杆菌培养经甲醛灭活后，与油乳佐剂混合乳化，制备灭活疫苗，接种剂量为0.5mL/只(方法参照傅元华、施彬彬、赵宝华，鸭疫里默氏杆菌病二价油乳剂疫苗的研制，中国家禽，2011年第33卷第9期，62-63.)。各组隔离饲养，每天观察各组精神、运动状态、采食、粪便等情况。免疫后21天，每组挑选体重相近的20只鸭进行试验，除第1组不攻毒外，另外3组均用RAQY株进行攻毒：经腿部肌肉接种3.8×10⁴CFU/mL/只，攻毒后连续观察14天。统计各组从攻毒之日起共计14天的死亡数，按下述公式计算各免疫组保护率，保护率(％)＝(1—[死亡鸭总数]÷[免疫鸭总数])×100％。结果，攻毒对照组从攻毒后第二天开始发病并出现死亡，至第4天全部死亡，弱毒疫苗免疫组保护率为100％，灭活疫苗免疫组保护率为95％(见表1)。

第二次试验用疫苗批号为1421，将1瓶冻干苗溶于250mL生理盐水。取88只5日龄健康SPF鸭随机分成4组，第一组22只，为不免疫不攻毒对照组，第二组22只，为不免疫攻毒对照组；第三组22只，为免疫组，经腿部肌肉接种实施例2所得疫苗，接种剂量为0.5mL/只；第四组22只，为免疫油乳剂灭活疫苗组，将1型鸭疫里氏杆菌培养经甲醛灭活后，与油乳佐剂混合乳化，制备灭活疫苗，接种剂量为0.5mL/只(方法参照傅元华、施彬彬、赵宝华，鸭疫里默氏杆菌病二价油乳剂疫苗的研制，中国家禽，2011年第33卷第9期，62-63.)。各组隔离饲养，每天观察各组精神、运动状态、采食、粪便等情况。免疫后21天，每组挑选体重相近的20只鸭进行试验，除第1组不攻毒外，另外3组均用RAQY株进行攻毒：经腿部肌肉接种3.8×10⁴CFU/mL/只，攻毒后连续观察14天。统计各组从攻毒之日起共计14天的死亡数，按下述公式计算各免疫组保护率，保护率(％)＝(1—[死亡鸭总数]÷[免疫鸭总数])×100％。结果，攻毒对照组从攻毒后第二天开始发病并出现死亡，至第4天全部死亡，弱毒疫苗免疫组保护率为100％，灭活疫苗免疫组保护率为95％(见表2)。

表1本发明鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗免疫攻毒试验结果

表2本发明鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗免疫攻毒试验结果

从表1和表2中可以看出，攻毒对照组发病率达100％，死亡率为100％，而本发明免疫弱毒疫苗组保护率为100％，免疫油乳剂灭活疫苗组保护率为95％，表明本发明的弱毒疫苗具有较好的保护效果，并且保护效果优于油乳剂灭活疫苗。可见本发明弱毒疫苗能保护雏鸭抵抗强毒RAQY株的攻击，可以用于临床上预防鸭疫里默氏杆菌病。

综上所述，本发明的鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗安全性好，即接种剂量达3.8×10¹⁰CFU/只，也不会对鸭只产生任何不良反应；免疫效果好，能显著提高雏鸭对同型强毒鸭疫里默氏杆菌病的抵抗力，可以用于临床上预防鸭疫里默氏杆菌病，具有重大的经济和社会效益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗及其制备方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaggaggtga tccagccgca 20

<210> 3

<211> 1508

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgggaggc ctaacacatg caagccgagc 60

ggtagagtgt cttcggatac ttgagagcgg cgtacgggtg cggaacacgt gtgcaacctg 120

cctttatctg agggatagcc tttcgaaagg aagattaata cctcataata tactgattgg 180

catcaattag tattgaaagc tccggcggat agagatgggc acgcgcaaga ttagatagtt 240

ggtgaggtaa cggctcacca agtcaatgat ctttaggggg cctgagaggg tgatccccca 300

cactggtact gagacacgga ccagactcct acgggaggca gcagtgagga atattggaca 360

atgggtgcaa gcctgatcca gccatcccgc gtgaaggacg acggccctat gggttgtaaa 420

cttcttttgt acagggataa acctactctc gtgagggtag ctgaaggtac tgtacgaata 480

agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag cgttatccgg 540

atttattggg tttaaagggt ccgcaggcgg gctagtaagt cagtggtgaa agcctacagc 600

ttaactgtag aactgccgtt gatactgcta gtcttgagta tagttgaggt agctggaatg 660

agtagtgtag cggtgaaatg catagatatt actcagaaca ccgattgcga aggcaggtta 720

ccaagttata actgacgctg agggacgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct 780

ggtagtccac gccgtaaacg atgctaactc gtttttgggc tatatggttc agagactaag 840

cgaaagtgat aagttagcca cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt 900

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acctcctt 1508

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgtcatccc accttcctc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttcagacta agcgaaag 18

Claims

1.鸭疫里默氏杆菌GD株，其分类命名为(Riemerella anatipestifer)GD，已保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016161。

2.权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌GD株在制备鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗中的应用。

3.一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗，其特征在于，该弱毒活疫苗中含有权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌GD株。

4.根据权利要求3所述的弱毒活疫苗，其特征在于，该弱毒活疫苗中还含有冻干保护剂。

5.根据权利要求4所述的弱毒活疫苗，其特征在于，所述冻干保护剂的配方为：明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。

6.一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌GD株进行扩大培养，收获扩大培养后的菌液；

2)将上步扩大培养后的菌液离心浓缩；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)的具体操作为：将鸭疫里默氏杆菌GD株菌种划线接种于含新生牛血清的TSA平板，36.5～37.5℃培养16～24h，挑单菌落接种于含新生牛血清的TSB培养基中，于36.5～37.5℃、160～180rpm/min震荡培养16～24h既得种子液，再将种子液按体积比1:80～150接种于含新生牛血清的TSB培养基中扩大培养，于36.5～37.5℃摇床160～180rpm/min震荡培养16～24h，得扩大培养后的菌液。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)的具体操作为：将扩大培养后的菌液置于无菌离心管中，于5000～8000rpm/min、离心8～12min，收获沉淀，按体积比45～55:1浓缩后溶于培养液中。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)的具体操作为：将浓缩后的菌液与冻干保护剂按体积比0.8～1.2:1进行混匀，–80℃预冻12～16h，转置冷冻真空干燥机中冻干。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂配方为明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比；将该配方物质混匀后经高压灭菌后制得。