CN112063561A

CN112063561A - 猪链球菌3型疫苗株及其应用

Info

Publication number: CN112063561A
Application number: CN202011000342.5A
Authority: CN
Inventors: 肖琦; 何孔旺; 俞正玉; 汪伟; 倪艳秀; 祝昊丹; 周俊明; 王丹丹; 温立斌
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: CN112063561B

Abstract

本发明提供猪链球菌3型疫苗株及其应用，涉及兽用疫苗领域。猪链球菌3型疫苗株，分类命名为猪链球菌3型JSHZ，保藏编号为CCTCC NO:M 2019687。本发明还提供含有所述猪链球菌3型疫苗株的疫苗及该菌株在制备治疗或预防猪链球菌3型感染药物中的应用。本发明猪链球菌3型疫苗株，对小鼠和猪均显示较强的致病性，具有良好的生长性能和免疫原性，是优良的猪链球菌3型疫苗株。采用该疫苗免疫仔猪后能有效抵抗强毒攻击，显示出优良的免疫原性。

Description

猪链球菌3型疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及兽用疫苗领域，具体涉及猪链球菌3型疫苗株及其应用。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，缩写为Ss)是一种重要的人兽共患病病原菌，可导致脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎等疾病，可造成仔猪大量死亡，给全球养猪业造成重大的经济损失。通过荚膜分型，猪链球菌有33个血清型(1～31、33和1/2型)，其中血清2型在患病猪和患病人群中分离率最高，而血清3(缩写为Ss 3)、7和9型在许多国家也很普遍，并且与猪群猪链球菌感染和发病密切相关。临床上猪链球菌病常用阿莫西林、头孢氨苄等敏感药物进行治疗或预防性用药，但猪链球菌极易产生耐药性，而且随着国家对养殖环节抗生素使用限制越来越严格，使用安全有效的疫苗防控猪链球菌病等细菌性疫病成为一种趋势和研究热点。目前，我国已有猪链球菌2型、7型等血清型的商品化疫苗，但尚缺乏高效的猪链球菌3型疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供猪链球菌3型疫苗株，该疫苗株对小鼠和猪均显示较强的致病性，具有良好的生长性能和免疫原性，是优良的猪链球菌3型疫苗株。

本发明的另一目的是提供含有猪链球菌3型疫苗株的疫苗，该疫苗免疫仔猪后能有效抵抗强毒攻击，显示出优良的免疫原性。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

猪链球菌3型疫苗株，分类命名为猪链球菌3型JSHZ，保藏编号为CCTCC NO:M2019687。

本发明还提供含有所述猪链球菌3型疫苗株的疫苗。

在本发明中，所述疫苗是灭活的猪链球菌3型疫苗株的油乳剂疫苗。

优选的技术方案中，所述疫苗采用如下方法制备：将灭活的猪链球菌3型疫苗株菌悬液与吐温-80混合，搅拌均匀，得到水相；将白油与司本80混合，并搅拌均匀，得到油相；将所述水相与油相混合，乳化，得到所述疫苗。

优选的技术方案中，所述菌悬液与吐温-80的体积比为96：3-6，所述白油与司本80的体积比为94：4-8；所述水相与油相的体积比为1:3。

优选的技术方案中，所述猪链球菌3型疫苗株采用甲醛灭活。

本发明还提供所述猪链球菌3型疫苗株在制备治疗或预防猪链球菌3型感染药物中的应用。

本发明还提供所述的猪链球菌3型疫苗株在制备猪链球菌检测的全菌及亚单位标准品中的应用。

有益效果：JSHZ菌株分离自发病猪组织，在THB培养基中生长良好，序列鉴定为Ss3型，生化试验符合猪链球菌生化特性，对小鼠和猪均显示较强的致病性，具有良好的生长性能和免疫原性，是优良的猪链球菌3型疫苗株，该菌株为进一步研究猪链球菌3型的生物学特性、致病机制等提供了生物材料和模型；同时，JSHZ菌株制备的灭活疫苗免疫仔猪后能有效抵抗强毒攻击，显示出优良的免疫原性，为更有效防控猪链球菌病提供了技术支撑。

附图说明

图1分离株猪链球菌gdh基因的PCR鉴定，M为2000DNA Marker，1:菌株JSHZ的PCR扩增产物，2、3、5为Ss阳性参考菌株(SS2-1，SS3-YM4和SS5-MX)，4为以无菌水替代DNA模板的阴性对照。

图2菌株JSHZ的猪链球菌3型PCR鉴定，M:2000DNA Marker；1:菌株JSHZ；2:Ss 3阳性菌株SS3-YM4；3是以无菌水替代DNA模板的阴性对照。

图3菌株JSHZ生长曲线，横坐标为培养时间(单位h)，纵坐标为OD_600nm。

图4Ss 3JSHZ攻毒猪体温变化，横坐标为攻毒后天数，d1-1、d1-2分别表示攻毒后第1天分别测得的第1次和第2次体温，其他依次类推。

图5高剂量组濒死猪心包积液。

图6高剂量组濒死猪心脏病理组织观察图，A:对照组仔猪，B高剂量组濒死猪。

图7高剂量组濒死猪脑病理组织观察图，A:对照组仔猪，B高剂量组濒死猪。

具体实施方式

4周龄Balb/C小鼠(雌鼠)购自扬州大学比较医学中心；30日龄健康仔猪购自江苏某猪场(猪群未发生猪链球菌病且未免疫猪链球菌疫苗)。THB培养基购自BD公司；AgarPowder购自北京索莱宝科技有限公司；链球菌生化试剂盒购自杭州微生物试剂有限公司；2×Taq PCR Mix、2000bp DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；pMD19-T载体购自宝生生物工程(大连)有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；通用型组织固定液(中性)购自武汉塞维尔生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

实施例1

1.细菌分离

病料采自江苏某猪场急性死亡猪肺脏，将采集的肺脏表面无菌处理后，无菌剪取一小块儿内部组织置于THB液体培养基中，37℃增菌培养过夜后，用接种环挑取增菌液划线接种于THB平板，37℃培养24h。挑取乳白色、半透明、直径1-2mm的圆形疑似菌落，再接种于THB液体培养基增菌，将增菌液再划THB平板，再挑单菌落划THB平板培养，直至得到单一的纯菌落。最终获得若干菌株的纯培养物。

2.鉴定

(1)分离菌的革兰氏染色鉴定

挑取各菌株的纯培养物，按《中华人民共和国兽药典(2015版)》的方法进行革兰氏染色，镜检鉴定。结果显示，从1份病料中分离到菌株JSHZ，该菌株在THB平皿上长成灰色菌落，菌落直径为1-2mm。细菌纯培养物涂片、革兰氏染色后，在光学显微镜油镜下观察为革兰氏阳性，呈短链状的蓝紫色球菌，固体培养基培养的菌链较短，液体培养基培养的菌链较长。

(2)猪链球菌PCR鉴定

采用煮沸法提取菌株JSHZ的基因组DNA。由上海英潍捷基生物有限公司合成猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因(gdh)扩增引物Ss F和Ss R，其中Ss F的序列如下：5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’，Ss R的序列如下：5’-CGTTTGACAGAATACGCTGC-3’。

以菌株JSHZ基因组DNA为模板，Ss F、Ss R为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系20uL：2×Taq PCR Mix 10uL，上游引物1uL，下游引物1uL，DNA模板2uL，用ddH₂O补足体积至20uL。PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s、57℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。将PCR产物切胶回收，TA克隆后，委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI BLAST上进行序列比对，确定是否为猪链球菌。结果显示，以菌株JSHZ的基因组DNA为模板，能扩增出大小约为689bp的片段，与预期结果相符(图1)。产物切胶回收，TA克隆后测序。扩增片段测序如SEQ ID NO:1所示，经BLAST，与Ss HB30gdh gene(序列号FJ572237.1)100％同源，表明分离到的菌株JSHZ为Ss。

(3)血清型PCR鉴定

按参考文献(周明瑶.2015年苏南地区健康猪群猪链球菌流行病学调查[D].南京:南京农业大学,2016.)合成猪链球菌不同血清型扩增引物(表1)，由上海英潍捷基生物有限公司合成。以细菌基因组DNA为模板，不同血清型F、R引物对为引物，进行PCR扩增，以鉴定其血清型。PCR反应体系20uL：2×Taq PCR Mix 10uL，上游引物(F)1uL，下游引物(R)1uL，DNA模板2uL，用ddH₂O补足体积至20uL。PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s、X℃(退火温度，见表1)30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。将分型PCR扩增获得的特异性条带切胶回收，TA克隆后，委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI BLAST上进行序列比对，确定猪链球菌血清型。

表1鉴别猪链球菌血清型的引物

将菌株JSHZ用Ss不同血清型扩增引物进行Ss血清型PCR鉴定。结果显示，仅采用Ss3引物进行PCR，能扩增出大小约为340bp的目的片段(图2)。扩增片段测序，序列如SEQ IDNO:2所示，经BLAST，与Ss 3cps3L gene(序列号KC537365.1)100％同源，表明分离到的菌株JSHZ为Ss 3。

3.生化试验

挑取菌株JSHZ纯培养物，按照链球菌生化试剂盒说明书的方法进行生化试验。生化鉴定结果显示，菌株JSHZ对马尿酸钠、6.5％NaCl高盐肉汤、七叶苷、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、尿素、木糖均为阴性，对乳糖、血清菊糖、水杨素、棉子糖、蕈糖、蔗糖、葡萄糖均为阳性。表明，菌株JSHZ符合Ss的生化特性。

4.分离菌生长曲线的测定

用接种环沾取菌株JSHZ冻存的第1代菌液，在THB固体培养基上划线，置于37℃温箱中培养过夜，得到第2代单菌落。挑取3个第2代单菌落接种于5mL THB液体培养基中，置于37℃摇床，200rpm，摇菌过夜，得到第3代菌液。取第3代菌液4mL，接种于含有200mL THB液体培养基的锥形瓶中，置于37℃摇床，200rpm，摇菌培养，每小时取菌液样品，测其OD_600nm值，绘制生长曲线。

结果如图3。培养后，菌株JSHZ对数生长期为0-5h，OD_600nm值达到最高峰的培养时间是8h；JSHZ菌株达到生长平台期时的活菌数为2.5×10⁸cfu/mL。

6.菌株JSHZ的致病性试验

(1)小鼠致病性试验

将45只Balb/C小鼠随机分成5组。其中，实验组4组，每组10只；另5只为对照组。4组实验组小鼠分别腹腔注射2.5×10⁸cfu/mL、5×10⁷cfu/mL、1×10⁷cfu/mL、2×10⁶cfu/mL的JSHZ株菌液，每只均注射1mL；对照组的每只小鼠腹腔注射1mL无菌生理盐水。连续观察3d，记录每组小鼠的死亡数量。死亡小鼠采集血及肝、脾、肺、脑等组织脏器，进行Ss分离，并用Ss 3分型PCR鉴定小鼠体内的菌株与注射菌株的一致性。按Reed-Muench法计算各菌株对4周龄Balb/C小鼠的半数致死量(LD₅₀)。

结果：用JSHZ菌株，按不同菌数腹腔注射Balb/C小鼠。注射后4小时，部分小鼠开始出现被毛粗乱、精神萎糜，随后多数表现出拉稀、闭眼、有的出现神经症状。死亡主要发生在14h～48h。死亡小鼠血及包括脑等组织脏器中均能分离到大量且菌落形态单一的Ss，定型PCR鉴定分离菌为Ss 3。JSHZ菌株4个剂量组对4周龄Balb/C小鼠的致死率(攻毒后3天)分别为100％、90％、20％和0％(表2)，半数致死量LD₅₀为2×10⁷cfu/mL。结果表明，JSHZ菌株对小鼠的致病性很强。

表2 JSHZ菌株对小鼠的致病性试验结果

(2)仔猪致病性试验

7头30日龄健康仔猪，喂7d无抗饲料，随机分成3组，实验组1(低剂量组)有3头、实验组2(高剂量组)和对照组各有2头。实验组1和2分别注射低剂量(6.3×10⁸cfu/头)和高剂量(6.3×10⁹cfu/头)JSHZ菌株菌液，每头仔猪耳缘静脉注射2mL；对照组每头仔猪耳缘静脉注射2mL无菌生理盐水。连续观察7d，记录每头仔猪的体温(每天上下午各测一次体温)、临床表现，每天采血液及有关节炎猪的关节液，进行Ss分离，并用Ss 3分型PCR鉴定。对死亡或濒死猪及时剖检，其他猪在第7d进行安乐死，采集血液及肝、脾、肺、脑等组织脏器，进行Ss分离及组织病理切片观察。

以JSHZ菌株的菌液接种的两实验组仔猪，体温在攻毒后第1天开始出现升高，比正常体温升高1.0℃-1.5℃，最高的升温可达2.8℃，多数猪发热持续2-3个温次，但高剂量组有一头持续发热至第3天(图4)。JSHZ菌株的菌液攻毒后第1天，实验组猪出现关节红肿、跛行、结膜炎、体温升高、精神萎靡、食欲减少等临床症状；攻毒后第2天，高剂量组有1头猪卧地不起、绝食并开始浑身发抖、四肢呈划水状，该猪至第5天时处于濒死状态；其余猪关节炎和跛行等症状在攻毒后第2天～第3天时消失，并在观察期基本恢复正常。攻毒猪的样品分菌结果显示，在攻毒后第1天-第3天，实验组仔猪能在血液中分离出Ss 3；关节炎明显的猪只关节液中亦可分离到Ss 3；高剂量组濒死猪在第5天时扑杀，从其脑组织中能分离到Ss3，但该猪其他脏器中细菌分离阴性；其他所有猪在攻毒后第7天时扑杀，各脏器均未分离出Ss 3。对照组仔猪在观察期内未见任何异常。上述实验结果表明，JSHZ菌株可致猪人工感染并发病，尤其高剂量Ss 3可致猪出现严重的临床表现，并可能引起死亡。

实验猪剖检结果显示，高剂量组濒死猪可见心包积液(图5)、脑部出血，其他脏器病变不明显；而所有在攻毒后第7d扑杀的仔猪剖检仅见心包积液，其他脏器病均未见明显病变。组织病理切片显微观察，高剂量组濒死猪见明显血管套形成，大脑皮层局部胶质细胞增生(图6、图7)；其他猪中部分猪可见心脏有局灶性心肌纤维变性坏死，大脑皮层早期局灶性轻微梗死，和或伴有小角质细胞增多，其他脏器未见明显病理变化。结果表明，JSHZ菌株可引起感染仔猪的脑及心肌的实质性病变。

菌株JSHZ已送至中国典型培养物保藏中心保藏。

分类命名：猪链球菌3型JSHZ，

Streptococcus suis 3JSHZ；

保藏编号：CCTCC NO：M2019687；

保藏日期：2019年9月6日；

地址：中国武汉武汉大学。

实施例2免疫保护试验

猪链球菌3型油乳剂疫苗制备：将猪链球菌3型JSHZ菌种从-70℃冰箱取出，在THB固体培养基上划线，置于37℃温箱培养24h，挑取3个单菌落于5mL的THB液体培养基中，置于37℃摇床，以200rpm的速度摇菌过夜，从其中取4mL菌液加至200mL THB液体培养基中，置于37℃、200rpm的摇床培养6小时。取少量菌液进行活菌平板计数，结果显示菌液浓度为2.5×10⁹cfu/mL。在其余菌液中，加入终浓度(体积百分浓度)为0.3％的甲醛，置于37℃、转速100rpm的恒温摇床中培养48h进行灭活，然后置于4℃备用。取灭活菌液200μL，无菌接种于5mL THB液体培养基中，置于37℃、转速200rpm的恒温摇床中培养24h，无菌生长。

取灭活检验合格的菌液，在8000rpm离心15min，取菌体沉淀用无菌生理盐水重悬，得到浓度为8×10⁹cfu/mL的灭活菌悬液。在该灭活菌悬液中，加入高压灭菌后的吐温-80，搅拌均匀，得到水相，其中灭活菌悬液与吐温-80的体积比为96:4；将白油与司本80按照体积比为94:6混合，并搅拌均匀，高压灭菌，得到油相。在高速分散机的乳化杯中加入3体积份的油相，开机搅拌，缓慢滴入1体积份的水相，高速乳化数次，直至水滴检验不破乳，得到猪链球菌3型油乳剂灭活疫苗。经无菌检验合格后备用。

灭活疫苗免疫攻毒保护试验：10头30日龄断奶仔猪，先用无抗生素饲料饲喂7天，随机分成2组，免疫组、攻毒对照组各5头。免疫组每头颈部注射2mL猪链球菌3型油乳剂灭活疫苗(含JSHZ 4×10⁹CFU)，首免后2周进行二免，免疫剂量和方法同首免。攻毒对照组每头仔猪注射2mL无菌生理盐水。二免后3周攻毒，免疫组和攻毒对照组每头猪耳缘静脉注射对数生长期的猪链球菌3型JSHZ菌液2mL(6×10⁸CFU)。攻毒后连续7天每天观察临床症状，测量并记录体温(上、下午各一次)。若攻毒猪死亡或出现以下临床症状之一的判为发病：体温较基础体温(攻毒前3天测得的温度平均数)升高1℃以上、并持续2个及以上温次；1个或多个关节红肿并跛行；食欲明显减退或废绝，并持续2天以上；倒地、卧地不起、发抖等神经症状。免疫组猪若健活或没有以上发病临床症状的，则判定为攻毒保护。结果见表3，攻毒对照组100％(5/5)发病，而免疫组获得80％(4/5)保护。表明猪链球菌3型JSHZ免疫原性优良。

表3 JSHZ株疫苗免疫猪攻毒保护试验

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 猪链球菌3型疫苗株及其应用

<130> 20200922

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 689

<212> DNA

<213> 猪链球菌3型JSHZ

<400> 1

ccatggacag ataaagatgg aaatgtccaa gtcaaccgtg gctaccgtgt tcagttcaac 60

tcagctgtag gtccttacaa aggcggtctt cgcttccacc caactgtaaa ccaatccatc 120

ttgaagttcc tcggttttga acaaatcttc aaaaacgtct tgactggtct tccaatcggc 180

ggtggtaaag gtggttcaga ctttgatcct aaaggcaaaa cagacgctga gatcatgcgc 240

ttctgccaaa gctttatgac tgaattgcaa aaacacatcg gaccttcact tgacgtccct 300

gctggtgaca tcggtgtcgg tggtcgcgag attggttaca tgtacggtca atacaaacgc 360

ctccgccagt ttgatgcagg tgtcttgact ggtaaacctc ttggctttgg tggttcattg 420

atccgcccag aagcaactgg ttacggtttg gtttacttca ctgataacat gttggcagca 480

aacggtaaat ccttcaaaga ccaaacagtc cttatctcag gttctggtaa cgttgcacaa 540

tatgctgttc aaaaagcgac tgaacttggt gcaaaggtta tttctgtttc agactcaaat 600

ggttacatca ttgacgaaac tggtattgac ttcgacctct tggtggacat caaagaaaaa 660

cgccgcgctc gtttgacaga atacgctgc 689

<210> 2

<211> 340

<212> DNA

<213> 猪链球菌3型JSHZ

<400> 2

agttggtatt tgtttaggaa ctttttctct atatttattg atcactaatc aagctttaat 60

agaccgaata accattttgt ttatcagaac gaagaatttt ggaactgcag caggtaggac 120

tgatgtttgg aaaaatggaa ttgagattgg tttgaataat aatttttggt ttggtttagg 180

tagatatcga gctttagagt taaatctaga attatatcag aatactttgc cttattttca 240

ttccatatat gttgaaacat ttgttacata tggttttttg ggtctttcta ttttgatctc 300

atatttttgt aacatattat caaaaactgc taaatcttcc 340

Claims

1.猪链球菌3型疫苗株，分类命名为猪链球菌3型JSHZ，保藏编号为CCTCC NO: M2019687。

2.含有权利要求1所述猪链球菌3型疫苗株的疫苗。

3.根据权利要求2所述疫苗，其特征在于所述疫苗是灭活的猪链球菌3型疫苗株的油乳剂疫苗。

4.根据权利要求3所述疫苗，其特征在于所述疫苗采用如下方法制备：将灭活的猪链球菌3型疫苗株菌悬液与吐温-80混合，搅拌均匀，得到水相；将白油与司本80混合，并搅拌均匀，得到油相；将所述水相与油相混合，乳化，得到所述疫苗。

5.根据权利要求4所述疫苗，其特征在于所述菌悬液与吐温-80的体积比为96：3-6，所述白油与司本80的体积比为94：4-8；所述水相与油相的体积比为1:3。

6.根据权利要求5所述疫苗，其特征在于所述猪链球菌3型疫苗株采用甲醛灭活。

7.权利要求1所述猪链球菌3型疫苗株在制备治疗或预防猪链球菌3型感染药物中的应用。

8.权利要求1所述的猪链球菌3型疫苗株在制备猪链球菌检测的全菌及亚单位标准品中的应用。