CN109957531B - 鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株及其应用 - Google Patents

鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株及其应用，属于生物医药技术领域。本发明通过鱼体攻毒实验筛选出一株舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株，命名为舒伯特气单胞菌OM170701。对其生长、基因组等生物学特性进行研究，发现该弱毒株与强毒株无明显差异，但毒力基因型存在一定差异；经鱼体免疫实验验证该弱毒菌株对对鳢科鱼类具有高达65％的免疫保护力，其可以用于鳢科鱼类舒伯特气单胞菌病的免疫防治中。

Description

鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株 及其应用。
背景技术
舒伯特气单胞菌(Aeromanas.schubertii)，属气单胞菌科(Aeromonadaceae)， 气单胞菌属(Aeromanas)，为革兰氏阴性杆菌；舒伯特气单胞菌具有单极鞭毛， 运动极为活泼。舒伯特气单胞菌广泛存在于淡水、海水、土壤、鱼类和脊椎动 物肠道中，其可导致伤口感染、神经性肌膜炎；舒伯特气单胞菌也是急性腹泻 的重要致病菌，严重时还会引起败血症，危机生命。
1988年在美国德克萨斯州首次发现舒伯特气单胞菌后，之后依次在欧洲及 中国也发现了大量由舒伯特气单胞菌引起的食源性疾病的病例。目前该菌在水 产养殖上作为致病菌的报道也越来越多，危害越来越大。最早是2009年余华等 从温泉鱼上分离到舒伯特气单胞菌，2012年罗霞和刘春等人分别报道了舒伯特 气单胞菌引起的斑鳢及乌鳢等内脏类结节病，其发病时间较短，对鳢科鱼类具 有较高的致病力和致死性。然而，目前还没有针对舒伯特气单胞菌有免疫效果 的疫苗株。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供鱼类舒伯特气单胞菌弱 毒疫苗株及其应用，该弱毒菌株对鳢科鱼类具有高达65％的免疫保护力，其可 以用于舒伯特气单胞菌病的免疫防治中。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种鱼类舒伯特气单胞菌弱 毒疫苗株，其命名为舒伯特气单胞菌OM170701(Aeromanas schubertii OM170701)，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018 年11月01日，保藏编号为：CCTCC NO:M2018741。
另外，本发明还提供所述的鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株在制备用于预 防鱼类舒伯特气单胞菌的疫苗中的应用。
作为上述技术方案的改进，所述鱼类属于鳢科鱼类。
另外，本发明还提供一种用于预防鱼类舒伯特气单胞菌的疫苗，其包含所 述的鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株。
另外，本发明还提供一种用于预防鱼类舒伯特气单胞菌的制剂，其包含所 述的鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株。
作为上述技术方案的改进，所述制剂还包含药学上可接受的辅料。
本发明的有益效果在于：本发明通过鱼体攻毒实验筛选出一株舒伯特气单 胞菌弱毒疫苗株，命名为舒伯特气单胞菌OM170701；对其生长、基因组等生物 学特性进行研究，发现该弱毒株与强毒株无明显差异，但毒力基因型存在一定 差异；经鱼体免疫实验验证该弱毒菌株对对鳢科鱼类具有高达65％的免疫保护 力，其可以用于鳢科鱼类舒伯特气单胞菌病的免疫防治中。
附图说明
图1.感染舒伯特气单胞菌不同菌株的实验组累计死亡曲线；
图2.舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株OM170701的16S rRNA系统发育树；
图3.舒伯特气单胞菌弱毒疫苗免疫乌鳢非特异性免疫基因的相对表达水 平图；
图4.舒伯特气单胞菌弱毒疫苗免疫乌鳢特异性免疫基因IgM的相对表达水 平图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和 附图对本发明作进一步说明。
实施例1舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株的筛选
将保存的OM170701、OM170703、OC170905、OC170908菌种分别接种于 固体BHI平板上，28℃恒温培养24h，挑取单菌落，接种于100mL BHI液体培 养基，28℃振荡(160±5)r/min培养4h，用生理盐水调整浓度为4.5×107CFU/mL 用于攻毒。将50条乌鳢随机分为5组，每组10条，其中4组为试验组，分别 腹腔注射浓度为4.5×107CFU/mL的OM170701、OM170703、OC170905、 OC170908菌液，每尾0.1mL，对照组腹腔注射等量的生理盐水。注射后每天换 水1/2，连续观察7d，记录乌鳢的死亡情况，如有死亡，检测死亡的乌鳢是否是 因为舒伯特气单胞菌引起的。
结果如图1所示，OM170701、OM170703、OC170905、OC170908的死亡 率分别为0，20％，70％，100％。因此，OC170908为强度株，OM170703和OC170905 株毒力相对较弱，而OM170701株为弱毒株，可以用于作为疫苗候选株备用。
实施例2舒伯特气单胞菌OM170701株16S rRNA基因测序与分析
以基因组DNA提取试剂盒提取的OM170701株基因组DNA为模板、F1 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3′)和R1(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCG-3′) 为引物，PCR扩增分离菌株16S rRNA基因。PCR程序为：94℃预变性5min； 94℃变性45s，53℃退火4 5s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后委托广州艾基生物技术有限公司测序，测序 结果上传至NCBI的Blast检索系统进行基因序列分析。
OM170701菌株经16S rRNA基因通用引物可扩增获得约1.5kb的片段，与 预期结果一致；其测序结果表明该片段长度为1390bp的16S rRNA基因，提交 至NCBI，获得序列编号MH359094.1。BLAST比对分析结果表明，该序列与 GenBank上已发表舒伯特气单胞菌16SrRNA序列(NR_119043.1和NR03714.2) 的同源性最高，相似性均为100％。由基于16S rRNA序列构建的系统发育进化 树可知，OM170701菌株与舒伯特气单胞菌NR_119043.1和NR03714.2在系统 发育进化树上也自然聚为一支(如图2所示)。
实施例3舒伯特气单胞菌OM170701株的安全性验证
取纯化培养的OM170701菌株，接种于BHI液体培养基中，28℃振荡(160±5) r/min培养8h，用0.65％无菌生理盐水将菌液稀释成4.5×108、4.5×107、4.5×106和4.5×105CFU/mL 4个菌液浓度，腹腔注射感染健康乌鳢(体长12cm左右) 0.1mL/尾，每组10尾，对照组注射等量的0.65％无菌生理盐水。试验期间水温 25℃，每天观察试验鱼的症状及记录死亡情况，连续观察14d。
腹腔注射浓度为4.5×108、4.5×107、4.0×106和4.5×105CFU/mL的试验组乌鳢，观察14d，结果如表1所示，均未出现死亡；这说明OM170701菌株对乌鳢呈 弱毒性。
表1接种OM170701菌株乌鳢死亡情况
Figure BDA0002002724830000041
实施例4舒伯特气单胞菌OM170701弱毒疫苗株的免疫实验舒伯特气单胞菌 OM170701弱毒疫苗的制备
将保存的OM170701菌种接种于固体BHI平板上，28℃恒温培养24h，挑 取单菌落，接种于100mL BHI液体培养基，28℃过夜培养，然后按1:10转接至 BHI液体培养基中，28℃恒温培养12h，离心收集菌体，PBS调整浓度为4.5×107 CFU/mL，用于浸泡免疫，现配现用。
将保存的OM170701菌种接种于固体BHI平板上，28℃恒温培养24h，挑 取单菌落，接种于100mL BHI液体培养基，28℃过夜培养，离心收集菌体，用 生理盐水稀释至4.5×107CFU/mL，用于注射免疫。
浸泡免疫
健康乌鳢被随机分为2组，每组30尾，其中浸泡免疫组乌鳢在4.5×107 CFU/mL疫苗悬液中浸泡30min，对照组在同体积养殖水中浸泡，浸泡过程中保 持充氧，免疫后将鱼转入塑料桶进行养殖。
免疫后第20天，采用舒伯特气单胞菌强毒株WL1483注射攻毒，注射浓度 为4.5×107CFU/mL，每尾注射100μL，连续观察14d，记录鱼体死亡情况，对 发病和死亡个体进行病原的分离和鉴定，并计算相对免疫保护率RPS＝(1－免 疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。
结果如表2所示，对照组乌鳢从第1天开始出现死亡，OM170701浸泡免疫 组从第2天开始出现死亡，死亡个体出现内脏(肝、脾、肾等)出现明显的白 点，死亡后可从乌鳢肝、脾肾等部位分离到舒伯特气单胞菌；试验期间免疫组 累计死亡率为56.67％，对照组累计死亡率为76.67％，该疫苗采用浸泡免疫对乌 鳢的RPS为26.1％。
表2 OM170701菌株浸泡免疫对乌鳢的免疫保护效果
Figure BDA0002002724830000051
注射免疫
健康乌鳢被随机分为2组，每组45尾，其中注射免疫组乌鳢注射浓度为 4.5×107CFU/mL弱毒疫苗0.1mL/尾，对照组注射同等体积的生理盐水。
免疫后第0h、12h、24h、48h、72h以及第7d、14d、21d、28d每组随机抽 取3尾乌鳢，取其肝脏组织，称取50mg，按照天根提取动物组织RNA试剂盒 说明书提取RNA，检测其非特异性免疫因子IL-8、IL-1β、补体C3及特异性免 疫因子IgM表达情况。
舒伯特气单胞菌弱毒活疫苗OM170701免疫乌鳢后，结果如图3所示，免 疫组IL-8、IL-1β、补体C3表达量均高于对照组的表达量，OM170701免疫组 IL-8、IL-1β、补体C3均在免疫后72h相对表达量达到最高，分别是对照组的相 对表达量的5.57倍，3.94倍，4.95倍，(*代表P<0.05)。IgM的相对表达量如图 4所示，显著高于对照组(P＜0.05)，免疫组从第7天至第28天表达量相对于对 照组均显著上调，其中第28天时OM170701免疫组IgM相对表达量是对照组的 17.26倍(*代表P<0.05)。
免疫后第20天，采用舒伯特气单胞菌强毒株WL1483注射攻毒，注射浓度 为4.5×107CFU/mL，每尾注射100μL，连续观察14d，记录鱼体死亡情况，对 发病和死亡个体进行病原的分离和鉴定，并计算相对免疫保护率RPS＝(1－免 疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。
结果如表3所示，对照组乌鳢从第1天开始出现死亡，注射免疫组第2天 才开始出现死亡，试验期间注射免疫组累计死亡率为17.78％，对照组累计死亡 率为50.1％，该疫苗采用注射免疫对乌鳢的RPS为65％。
表3 OM170701菌株注射免疫对乌鳢的免疫保护效果
Figure BDA0002002724830000061
最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发 明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普 通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不 脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株，其命名为舒伯特气单胞菌OM170701，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018741。
2.如权利要求1所述的鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株在制备用于预防鱼类舒伯特气单胞菌的疫苗中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鱼类属于鳢科鱼类。
4.如权利要求1所述的鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株在制备用于预防鱼类舒伯特气单胞菌的制剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鱼类属于鳢科鱼类。
6.一种用于预防鱼类舒伯特气单胞菌的疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株。
7.一种用于预防鱼类舒伯特气单胞菌的制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗株。
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