CN108939062A - 一种杀鲑气单胞菌疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明从我国山东养殖的半滑舌鳎中分离得到一株杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)，其保藏编号为CCTCC M 2018085；本发明首次在半滑舌鳎中分离获得腹水病的病原菌菌株，该菌株的抗原包含针对杀鲑气单胞菌的保护性抗原，适合用于制备杀鲑气单胞菌的各类疫苗，降低水产养殖业中因病害所导致的损失，减少或消除由于杀鲑气单胞菌发生所致的消毒剂、抗生素等化学药物的滥用，显著提高水产养殖动物及其产品的安全，以及病原菌抗药性增加所带来的生物安全风险。

Description

一种杀鲑气单胞菌疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及水产养殖动物的微生物学及免疫学领域，具体涉及一种杀鲑气单胞菌疫苗及其应用。
背景技术
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevls)属鲽形目(Pleuronectiforme)、舌鳎科(Cynoglossidae)、舌鳎属(Cynoglossus)，为近海常见的暖温性大型底层鱼类，在中国沿海均有分布，尤以渤海、黄海为多，是我国传统的名贵鱼类。近年来，随着人工养殖规模和养殖密度的不断加大，半滑舌鳎疾病频发，严重影响了半滑舌鳎产业的发展。根据已有文献报道，鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)(张晓君等,2009)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)(梁利国等,2010)、河口弧菌(Vibrio aestuarianu)(郑法新等,2009)、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.piscicida)(Wang et al,2007)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)(白芳芳等,2009)和杀鲑气单胞菌(周红霞等,2017)等病原菌均可感染半滑舌鳎，引起溃疡、出血等症状，病害已成为制约半滑舌鳎产业发展的重大障碍。
一般认为，杀鲑气单胞菌分为5个亚种，其中杀鲑亚种属于典型杀鲑气单胞菌，其他亚种属于非典型菌株。目前感染养殖鱼类的主要是4个嗜冷性亚种，包括杀鲑亚种、无色亚种、杀日本鲑亚种和史氏亚种，另有一个非致病型的嗜温性亚种-溶果胶亚种(Holt etal,1994；Pavan et al,2000；Nash et al,2006)。杀鲑气单胞菌曾经对欧美各国的养殖业造成了毁灭性的的打击。其中包括：鲤科、鲈鱼科、裸盖鱼科、还有鲑科、七鳃鳗科等鱼类(Mccarthy et al,1975)。
杀鲑气单胞菌是养殖鱼类的主要致病菌，可以引起鱼类皮肤脓肿、溃烂等疥疮病症状，近年来，在山东地区的养殖大菱鲆、大西洋鲑等冷水性鱼类中先后发现杀鲑气单胞菌感染的病例(吕俊超等,2009；衣萌萌等,2015)，本实验室近年来的流行病学调查发现，杀鲑气单胞菌的发病情况越来越频繁，而目前应对感染主要依靠抗生素。在抗生素的使用中，病原菌耐药性的产生是个不可避免的过程。已有研究文献显示，从加拿大不同省份分离的多株杀鲑气单胞菌杀鲑亚种存在多重耐药性菌株，对氨苄青霉素、氟苯尼考、土霉素、奈啶酮酸、链霉素、磺胺、甲氧苄啶等多种抗生素都具有耐药性，其胞内存在一个低拷贝的大质粒，质粒上包含tetR、tetA、strA、strB等多个抗性基因(Mcintosh et al,2008)；杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的基因组信息也显示，至少有25个与细菌多重耐药相关的基因存在于细菌的基因组上(Michel et al,1991)，急需更环保和更有效的手段来进行病害防治。
发明内容
为了解决现有半滑舌鳎病害严重，没有特效疫苗的问题，我们提出了杀鲑气单胞菌疫苗及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
为实现上述目的，本发明提供一种杀鲑气单胞菌疫苗，疫苗抗原杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)分离自山东潍坊昌邑地区一养殖场患腹水、脱肛症状的养殖半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevls)内脏中，菌株CS-1于2018年2月5日在布达佩斯条约国际确认的微生物保藏单位中国典型培养保藏中心保藏；保藏编号为：CCTCC M 2018085；保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，中国典型微生物保藏中心。。
优选地，上述疫苗抗原的制备方法为灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物中的至少一种。
优选地，上述疫苗的产品为以下三种：
(1)使用该菌株制备的抗原的单一成分制成的疫苗；
(2)使用该菌株制备的抗原与其他细菌的抗原混合生产的联合疫苗；
(3)将制备的单一或联合疫苗的抗原添加佐剂生产的疫苗。
优选地，上述疫苗的接种方式为注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫和口服免疫中的一种。
优选地，上述注射免疫使用的剂量为104-108CFU/g(菌落形成单位/鱼体体重)；创伤免疫和浸浴免疫使用的水体中疫苗浓度为105-109CFU/mL(菌落形成单位/浸泡水体体积)，浸泡时间为2-60min；口服免疫配合于饲料中，浓度为105-1010CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂14-30天。抗原的剂量与免疫效果密切相关，剂量过低，不能诱导足够强的免疫应答，剂量过高，也可能会导致机体的免疫耐受，另外，抗原在应用中也应考虑诸如动物生长阶段、抗原种类、疫苗剂型及接种次数等因素对其剂量需求的影响。因此，在实际免疫应用中，抗原的有效剂量的范围，应根据实验数据来进行确定。以上灭活疫苗在使用中，也可根据实际情况对受免疫鱼实施加强免疫2—3次，两次免疫的时间间隔为14—30天。
一种杀鲑气单胞菌的疫苗应用于海水养殖鱼类(如圆斑星鲽、牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎、大西洋鲑、裸盖鱼、石斑鱼、鲈鱼、真鲷、军曹鱼、大西洋鲑、河鲀等)、半咸水养殖鱼类(如罗非鱼、虹鳟、鲻鱼等)、洄游鱼类(如鳗鲡、小黄鱼等)的疫苗接种。不同的水生动物的抗原的免疫剂量有所不同，对于特定水生动物及特定抗原的在使用中的具体剂量，应该进行单独测试。
优选地，上述疫苗应用于养殖半滑舌鳎的疫苗接种。
优选地，上述疫苗应用于预防杀鲑气单胞菌引起的溃烂病、腹水、脱肛等水产养殖疾病。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次在半滑舌鳎中分离获得腹水病的病原菌菌株，该菌株的抗原包含针对杀鲑气单胞菌的保护性抗原，适合用于制备杀鲑气单胞菌的各类疫苗，可通过注射、浸泡或口服途径对杀鲑气单胞菌感染具有良好的免疫保护作用，适于用作疫苗的生产和应用。
(2)降低水产养殖业中因病害所导致的损失，减少或消除由于杀鲑气单胞菌发生所致的消毒剂、抗生素等化学药物的滥用，显著提高水产养殖动物及其产品的安全，以及病原菌抗药性增加所带来的生物安全风险。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
患病半滑舌鳎中CS-1菌株的分离
发病的半滑舌鳎采集自山东潍坊某一养殖场，体长约20cm，工厂化养殖，养殖水温约为20℃。从发病半滑舌鳎的肝脏、脾脏和肾脏取样，在TSA平板培养基上进行划线，28℃培养箱培养48h，将获得的优势菌落进行纯化培养，纯化培养后的细菌用甘油保存于–80℃冰箱备用。
CS-1菌株的药物敏感性分析
将病原菌在TSA平板上划线，28℃培养箱培养48h，挑取单菌落制成相应浓度菌悬液，采用药敏检测试剂盒ATB-VET(梅里埃,法国)，参照产品使用说明书对菌株进行药物敏感性检测。用ATB-VET药敏试剂条对菌株CS-1的药物敏感性检测结果见表1。由表1可以看出该菌对青霉素、链霉素、卡那霉素、四环素等11种抗生素具有耐药性，对阿莫西林、头孢噻吩、大观霉素、利福平等16种抗生素敏感。(注：“R”表示耐药，“S”表示敏感)
表1CS-1的药敏检测结果
CS-1菌株的生理生化特征
采用微生物鉴定系统API 20NE和Biolog GenIII对CS-1进行生理生化性状的测定，鉴定结果见表2和表3。API 20NE系统判定为杀鲑气单胞菌；Biolog GenIII系统判定为杀鲑气单胞菌。(注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应，“w”表示弱阳性)
表2CS-1API 20NE生理生化特征
表3CS-1Biolog生理生化鉴定表
病原菌人工感染实验
选择健康半滑舌鳎，通过肌肉注射方式对半滑舌鳎进行人工感染。将分离菌株接种于TSB液体培养基，28℃摇床培养36h。离心收集菌体，用生理盐水将菌液依次稀释至9.8×106CFU/ml、9.8×105CFU/ml、9.8×104CFU/ml、9.8×103CFU/ml。每个浓度注射10尾鱼，每尾注射0.1ml，对照组注射等体积的灭菌生理盐水。每天正常饲喂、换水，记录发病和死亡情况，对死亡的鱼及时解剖，并对病原进行分离。同时平板计数稀释液以确定菌液具体浓度。根据改进的寇氏法(杨茂成等,1990)计算菌株的半数致死量(50％lethal dose,LD50)。
从病鱼的肝脏、脾脏和肾脏都得到菌落形态一致的优势菌，细菌在TSA琼脂平板上生长呈白色不透明圆形菌落。所有分离到菌株的菌落形态一致，16S rRNA基因序列测定结果相似度大于99％。
人工感染实验发现，感染的半滑舌鳎很快发病，发病症状与自然发病症状一致，对照组无死亡现象。从人工感染的发病鱼内脏重新分离菌株，在TSA平板上生长48h后，菌落形态及生理生化特征均与CS-1一致。分离株对半滑舌鳎人工感染结果见表4。经计算，其半数致死量(LD50)为1.24×104CFU/尾。
表4分离株对半滑舌鳎人工感染结果
基因分析和系统发育进化树的构建
按照已有文献报道的条件，扩增菌株的16S rRNA、gyrB、recA、dnaJ、rpoD和vapA基因。扩增产物经pclone EZ-TA载体连接转化，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序，获得的序列信息在GenBank中用Blast进行同源性比较，将5个管家基因按照16S rRNA-gyrB-recA-dnaJ-rpoD顺序串联，使用MEGA5.0软件采用邻位相连法(Neighbor-Joining)构建系统发育进化树。毒力基因vapA按照同样方法构建系统发育进化树。
测序结果经过Blast比对分析显示，菌株CS-1菌株基因序列在GenBank中同源性最高的几株菌均为杀鲑气单胞菌，从NCBI数据库中选择不同杀鲑气单胞菌亚种和嗜水气单胞菌属菌株，将5个管家基因串联16S rRNA-gyrB-recA-dnaJ-rpoD拼接后使用MEGA5.0软件构建系统进化树。分析结果显示，CS-1与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种相似性最高。vapA基因进化树结果显示，CS-1与杀日本鲑亚种聚为一簇。
弗氏不完全佐剂与灭活杀鲑气单胞菌菌株CS-1疫苗配伍免疫半滑舌鳎的应用方式
用福尔马林制备杀鲑气单胞菌CS-1菌株2×108CFU/mL灭活疫苗，将等量的疫苗与弗氏不完全佐剂(Freund’sAdjuvant Incomplete，Sigma)分别吸入两个无菌注射器内，两注射器之间以无菌胶管相连，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。制备好的乳化剂滴入冷水中，乳滴若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即视为合格。腹腔注射用MS222(1:9000)进行浸泡麻醉处理后的半滑舌鳎，接种剂量为100μL/尾，移入新鲜海水中正常养殖。对照组则腹腔注射无菌PBS(pH7.2)，免疫后30—60天，对半滑舌鳎腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜杀鲑气单胞菌菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，并计算RPS。其RPS值超过70％，则视为合格。
本应用方式中所用的福尔马林灭活杀鲑气单胞菌疫苗也可用其他物理或化学的灭活病原的方法加以制备，物理方法如热灭活、细胞破碎、紫外、超声或反复冻融等，化学方法如采用强酸、强碱或戊二醛等试剂。免疫方法及评估同上。
杀鲑气单胞菌菌株CS-1疫苗在半滑舌鳎饲料中用量确定的应用方式
首先制备杀鲑气单胞菌菌株CS-1，该抗原的制备方法包括灭活菌体、菌蜕成分、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上。应用中，选择健康半滑舌鳎，各试验组均设3个平行组，20尾/平行组。试验饲料制备中，对照组的饲料按半滑舌鳎配合饲料配方将各原料粉碎到至60目，逐级混匀后加水搅拌，用适宜孔径的绞肉机制成饲料颗粒，7个试验组的饲料制备方法同上，另在原料中添加上述杀鲑气单胞菌菌株CS-1的抗原，抗原/饲料重量比(g/kg)依次为1×10-5/1、1×10-4/1、1×10-3/1、1×10-2/1、1×10-1/1、1/1和10/1。制备的饲料颗粒剪成适宜长度，经自然凉干后贮藏于4℃的冰箱中保存。
免疫实施中，实验各组每天按鱼体体重的3％投喂相应饲料，连续投喂14天后，再投喂正常饲料。30天后，各组进行加强免疫一次，方法同上。60天后，对半滑舌鳎腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜杀鲑气单胞菌CS-1菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，计算RPS，并综合抗原制备成本的考虑，进行杀鲑气单胞菌菌株CS-1抗原在半滑舌鳎饲料中用量的确定。
含有杀鲑气单胞菌菌株CS-1灭活疫苗的多联疫苗，免疫牙鲆的应用方式
首先用传统灭活方法(如福尔马林灭活、热灭活、高压灭活等)对鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和杀鲑气单胞菌菌株CS-1进行灭活，再将三者按1：1：1的比例配制成三联疫苗，该疫苗中三种灭活细菌的终浓度均为108CFU/mL。应用中，牙鲆腹腔注射100μL制备的三联疫苗，30天后将实验鱼随机分成三小组，各小组分别用10倍LD50剂量的新鲜鳗弧菌、嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌菌液，进行人工感染试验，感染采用腹腔注射方式。感染后14—30天，统计死亡率，并计算RPS，感染实验结果中对以上三种菌的任何一种其RPS超过70％，即视为该三联疫苗具有较好的免疫效果。
杀鲑气单胞菌菌株CS-1抗原注射免疫接种大菱鲆时免疫剂量的确定的应用方式
首先制备杀鲑气单胞菌菌株CS-1的灭活疫苗。免疫应用中，选择健康大菱鲆，各试验组均设3个平行组，20尾/平行组。各组均采用腹腔注射的方式进行免疫接种，对照组注射无菌PBS(pH7.2)。5个免疫组抗原的注射剂量为1×108、1×107、1×106、1×105和1×104CFU/尾。各组鱼在注射前，均用MS222进行麻醉处理。30天后，对大菱鲆腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜杀鲑气单胞菌菌液，进行人工感染试验。感染后30—60天，统计死亡率，并计算各免疫组的RPS值，以此进行杀鲑气单胞菌菌株CS-1灭活疫苗腹腔注射免疫接种大菱鲆时，所用免疫剂量的确定。
采用杀鲑气单胞菌菌株CS-1的菌蜕成分、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上作为抗原加以应用时，其免疫应用中的抗原剂量的确定方法同上。

Claims (8)

1.一种杀鲑气单胞菌疫苗，其特征在于：疫苗抗原杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)分离自山东潍坊昌邑地区一养殖场患腹水、脱肛症状的养殖半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevls)内脏中，菌株CS-1保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏日期2018年2月5日，保藏编号CCTCC M 2018085。
2.如权利要求1所述的一种杀鲑气单胞菌疫苗，其特征在于：所述疫苗的制备方法为灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的一种杀鲑气单胞菌疫苗，其特征在于：所述疫苗的产品为以下三种：
(1)使用该菌株制备的抗原的单一成分制成的疫苗；
(2)使用该菌株制备的抗原与其他细菌的抗原混合生产的联合疫苗；
(3)将制备的单一或联合疫苗的抗原添加佐剂生产的疫苗。
4.如权利要求1或2所述的一种杀鲑气单胞菌疫苗，其特征在于：所述疫苗的接种方式为注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫和口服免疫中的一种。
5.如权利要求4所述的一种杀鲑气单胞菌疫苗，其特征在于：所述注射免疫使用的剂量为104-108CFU/g(菌落形成单位/鱼体体重)；创伤免疫和浸浴免疫使用的水体中疫苗浓度为105-109CFU/mL(菌落形成单位/浸泡水体体积)，浸泡时间为2-60min；口服免疫配合于饲料中，浓度为105-1010CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂14-30天。
6.一种杀鲑气单胞菌疫苗的应用，其特征在于：所述疫苗应用于海水养殖鱼类、半咸水养殖鱼类、洄游鱼类的疫苗接种。
7.如权利要求6所述的一种杀鲑气单胞菌疫苗的应用，其特征在于：所述疫苗应用于养殖半滑舌鳎的疫苗接种。
8.如权利要求6所述的一种杀鲑气单胞菌疫苗的应用，其特征在于：所述疫苗应用于预防杀鲑气单胞菌引起的溃烂病、腹水、脱肛等水产养殖疾病。
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