CN113476596A - 杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌二联疫苗及其应用 - Google Patents

杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌二联疫苗及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌二联疫苗及其应用，属于生物制品技术领域。本发明公开一种疫苗菌株包括杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌，所述杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌分别于2021年4月19日和2021年4月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：M 2021397和CCTCC NO：M2021422，保藏地址均为武汉大学。所述二联疫苗的抗原为所述的杀鲑气单胞菌和所述的迟缓爱德华氏菌。本发明公开的二联疫苗的抗体效价为1:210，能够有效防治杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌对大菱鲆产生的病害，为鱼用疫苗的发展以及水产养殖中各种病害的防控提供参考。

Description

杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌二联疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，涉及杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌二联疫苗及其应用。
背景技术
大菱鲆(Scophthalmus maximus)是原产于欧洲的冷水性底栖海水鱼类，于1992年引入我国。因其营养丰富、经济价值高，逐渐成为我国北方重要的经济养殖鱼类。随着养殖集约化、规模化的不断发展，大菱鲆病害频发，严重影响了该产业的可持续发展。
疖疮病和腹水病是水产养殖中较常见的细菌性疾病，其中杀鲑气单胞菌是疖疮病的主要致病菌之一，杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)最早由Emmerich和Weible在1890年从鳟鱼中分离并进行了描述。该菌可引起鲑鳟鱼类疖疮病，患病鱼类体表可形成红色脓肿，严重时可发展成溃疡，严重制约了养殖业的健康发展。2005年Bjrnsdóttir等人发现杀鲑气单胞菌对大菱鲆存在一定的致病性，病理变化表现为大菱鲆肝脏出血，体表溃疡等。迟缓爱德华氏菌是爱德华氏菌病的主要致病菌，可导致鱼类严重腹水以及肝脾肾等重要免疫器官的出血、红肿损伤，进而导致鱼类大量死亡。迟缓爱德华氏菌逐渐在大菱鲆、牙鲆、罗非鱼等养殖鱼类中被发现，并于2005到2009年出现大规模的暴发，引起鱼种大面积死亡，造成巨大的经济损失。其中感染最严重的就是大菱鲆，据报道，感染迟缓爱德华氏菌的大菱鲆幼鱼死亡率70-80％之间，而该菌感染成鱼的死亡率高达90-95％。
灭活疫苗是最常使用的疫苗形式，通常是直接将病原菌或其代谢产物用化学或物理(高温、高压等)的方法处理使其丧失活性。灭活疫苗虽然丧失了病原菌原有的致病性，但其免疫原性仍然得到了保留，灭活疫苗制备方法简单，安全性好，任何有可能造成污染的生物因素在灭活的过程中都可能被杀死从而避免任何相关毒害作用。此外，灭活疫苗稳定且便于保藏和运输，同时还便于制备成多联疫苗使用。
前期本实验室工作中发现，大菱鲆感染杀鲑气单胞菌后期可同时伴随迟缓爱德华氏菌的继发性腹水病发生，诱发了大菱鲆大规模死亡。而目前，针对杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌引起的鱼类疾病多是存在单一抗原的疫苗，并且没有针对杀鲑气单胞菌与迟缓爱德华氏菌引起的大菱鲆疥疮病及腹水病的有效疫苗。另外，现有单一抗原疫苗为了实现多种病原菌引起的疾病的防控，还需要针对两种病原菌引起的疾病进行多次重复免疫，而为了使用上避免重复操作、浪费人力物力，针对杀鲑气单胞菌与迟缓爱德华氏菌病原的继发、混合感染，亟需开发一种新疫苗以解决现有技术中单一抗原用于防治上述两种病原引起的鱼类疾病的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌二联疫苗及其应用，该二联疫苗能够有效提高机体免疫力，增强鱼类免疫反应，同时避免免疫重复操作，为鱼用疫苗发展以及水产养殖中多种病害的防控提供参考。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种疫苗菌株，包括杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，所述杀鲑气单胞菌于2021年4月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021397，保藏地址为武汉大学；所述迟缓爱德华氏菌于2021年4月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021422，保藏地址为武汉大学。
本发明还提供一种二联疫苗，所述二联疫苗的抗原为权利要求1中所述的杀鲑气单胞菌和所述的迟缓爱德华氏菌。
优选的是，所述二联疫苗的抗原杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌按照体积比1:1-1:2混合。
优选的是，所述二联疫苗为灭活疫苗。
优选的是，所述二联疫苗还包括763佐剂，具体为MontanideTMISA 763A VG佐剂。
本发明还提供一种所述的二联疫苗在防治杀鲑气单胞菌和/或迟缓爱德华氏菌引起的鱼类疾病的二联疫苗中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
1.本发明公开的二联疫苗为灭活疫苗，其能够保留免疫原性，安全性评价较好，制备技术较为成熟。该二联疫苗的使用能够减少各种抗生素和化学药物的使用，能够消除水产品药物残留隐患，减少对环境的危害。
2.本发明公开的二联疫苗中添加了763佐剂，763佐剂可以增强大菱鲆对杀鲑气单胞菌与迟缓爱德华氏菌的免疫应答。油乳佐剂能够在疫苗注射位点储存抗原，以达到持续激活抗原和免疫细胞的作用；同时油佐剂能维护疫苗抗原和免疫细胞之间的有效联系，来促进持续且强劲的促炎反应和体液免疫反应。
3.本发明公开的二联疫苗的相对免疫保护率为73.33％，免疫保护率高。
4.本发明公开的二联疫苗免疫大菱鲆2周后，抗体效价最高为1：210，血清中的酸性磷酸酶(ACP)最高值为28.0U/100mL，溶菌酶(LZM)最高值为180.0μg/mL，说明该二联疫苗具有较强免疫效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为大菱鲆免疫后，对照组和免疫组血清中酸性磷酸酶(ACP)活力变化；
图2为大菱鲆免疫后，对照组和免疫组血清中溶菌酶(LZM)活力变化；
图3为大菱鲆免疫后，对照组和免疫组血清中抗体效价的变化；
图4为大菱鲆免疫后，对照组和免疫组免疫保护率的测定；
图5为大菱鲆相关免疫基因表达变化测定；
图6为构建的杀鲑气单胞菌进化树；
图7为构建的迟缓爱德华氏菌进化树。
具体实施方式
现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌的分离与鉴定
1、菌株
杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌，自山东某养殖场患病鱼体内分离。
2、方法
2.1疫苗菌株的筛选
患病大菱鲆取自山东烟台某养殖场，病鱼主要表现为腹部部分区域发红，体表形成溃疡，肝脏局部发红。用生理盐水将患病大菱鲆冲洗3遍，在无菌操作下摘取病鱼的肾脏组织。生理盐水冲洗组织块后置于无菌的2.0ml离心管中，剪碎并取少量划线接种于TSB平板，28℃恒温培养24h。待菌落长出后，挑取大小颜色一致的单菌落进行鉴定。送公司进行测序后，将所得序列在NCBI网站比对分析序列同源性。
2.2结果鉴定
1、形态鉴定结果：
TSB培养基上生长正常，呈乳白色，圆形，直径约为(0.5±0.2)mm，表面光滑湿润，边缘整齐，易挑起的优势单菌落为杀鲑气单胞菌。TSB培养基上生长较慢，略微透明，圆形，直径约为(0.8±0.1)mm，表面光滑湿润，边缘整齐，较易挑起的优势单菌落为迟缓爱德华氏菌。
2、16s rDNA测序结果
迟缓爱德华氏菌的16s rDNA测序结果如下SEQ ID NO：1：
gcttacacatgcagtcgagcggtagcagggagaaagcttgctttctccgctgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctggggatctgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgaacccagatgggattagctagtaggtggggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagtagggaggaaggtgtgaacgttaatagcgctcacaattgacgttacctacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagttggatgtgaaatccccgggcttaacctgggaactgcatccaagactggcaagctagagtctcgtagagggaggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggcctcctggacgaagactgacgctcatgtgcgaaagcgtggggagcaaacagggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgatttgggaggttgtgcccttgaggcgtggctttccgagctaacgcgtttaaatcgaccgcctgggggagtacggcccgccaggggtta；
杀鲑气单胞菌16s rDNA测序结果如下SEQ ID NO：2：
tgcaagtcgagcggcagcgggaaagtagcttgctacttttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgcctggggatctgcccagtcgagggggataacagttggaaacgactgctaataccgcatacgccctacgggggaaaggaggggaccttcgggcctttcgcgattggatgaacccaggtgggattagctagttggtggggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaaggttggcgcctaatacgtgtcaactgtgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggttggataagttagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcatttaaaactgtccagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgatttggaggctgtgtccttgagacgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggg。
根据上述测序结果，在NCBI网站比对分析序列为迟缓爱德华氏菌与杀鲑气单胞菌，并根据对比结果构建进化树见图6和图7；同时，将杀鲑气单胞菌命名为HHSM190529，拉丁文为：Aeromonas salmonicida HHSM190529，迟缓爱德华氏菌命名为HHSM190801，拉丁文为Edwardsiella tarda HHSM190801。
实施例2二联疫苗的制备
上述鉴定的杀鲑气单胞菌经活化后，划线接种于LB固体培养皿上，28℃培养24h，挑取单菌落至LB液体培养基培养24h后，送公司进行测序鉴定，确定为杀鲑气单胞菌后，将培养基中的菌体在4℃条件下离心收集，去掉上清后用无菌PBS(pH 7.3)清洗沉淀三次，最后以含有0.5％甲醛(v/v)的PBS重悬，4℃放置24h。次日取一小部分溶液用无菌PBS洗涤三次，涂布平板确定无活菌后，以5000r/min离心(4℃)15min收集沉淀，去掉上清，用灭菌过后的PBS洗涤沉淀3次，并重悬菌体，使浓度约为1×109cfu/mL，得到的溶液即为杀鲑气单胞菌疫苗。用同样的方法得到迟缓爱德华氏菌疫苗。
将获得的杀鲑气单胞菌疫苗与迟缓爱德华氏菌疫苗等比例混合均匀。将杀鲑气单胞菌疫苗与迟缓爱德华氏菌疫苗二联疫苗涂布LB平板确定无活菌后，与763佐剂按体积比例3:7均匀混合乳化后储存于4℃冰箱。
实施例3免疫动物实验
1、免疫方法
选取300尾健康的大菱鲆，分为疫苗组与对照组，每组各150尾鱼。通过腹腔注射的方式免疫大菱鲆。疫苗组每条鱼分别注射0.1ml浓度为1×109CFU/ml的灭活疫苗，对照组注射0.1ml的无菌PBS。
2、免疫后血清中酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LZM)活力测定
分别于免疫前(0W)及免疫后(1、2、3、4W)对大菱鲆进行血液采样，每组每次分别随机取9尾鱼。将血液在室温下静置2h，待凝固后，4℃，3000r/min离心15min，取上清，按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)的相应步骤，用试剂盒测定血清中酸性磷酸酶与溶菌酶的活性。
结果如图1所示，大菱鲆免疫后，免疫组血清中酸性磷酸酶(ACP)活力逐渐上升，在免疫后2w达到最高值(28.0U/100mL)，之后虽然有缓慢下降，但仍然超过对照组ACP水平；对照组血清中ACP活力无明显变化，且一直处于较低的水平，免疫组ACP活力免疫后1w开始明显高于对照组。
如图2所示，免疫组血清中溶菌酶(LZM)活力在免疫后逐渐上升，在免疫后2w达到最高值(180.0μg/mL)，之后虽然有缓慢下降，但仍然超过对照组LZM水平；对照组血清中LZM活力无明显变化，且一直处于较低的水平，免疫组LZM活力免疫后1w开始明显高于对照组。
3、免疫后血清中抗体效价的测定
采用传统的试管凝集法检测血清抗体水平，倍比稀释法将0.1mL待检血清样本用0.9％生理盐水稀释至第12管，每管0.5mL，并在1-10管中分别加入用0.85％生理盐水洗涤稀释的菌液(1×108CFU/mL)0.5mL。将试管置于28℃恒温培养箱，12h，取出，室温放置3h，观察细菌凝集程度。
结果如图3所示，对照组的抗体效价在四个时间点无显著变化，而疫苗免疫组中抗体效价在免疫后按时间呈现升高的趋势，其中在第二周呈现最高的抗体效价1：210。
4、免疫保护率的测定
免疫29d后，将培养至对数周期的杀鲑气单胞菌与迟缓爱德华氏菌离心后弃上清收集菌体沉淀，分别用无菌PBS洗涤后分别重悬至浓度为2.63×106CFU/ml与3.63×104CFU/ml。将获得的杀鲑气单胞菌与迟缓爱德华氏菌菌悬液进行等体积比例混合均匀。灭活组和对照组分别取60尾大菱鲆。对每尾大菱鲆进行腹腔注射，每尾大菱鲆注射0.2ml菌悬液。观察记录14d内的死亡情况。解剖死亡的大菱鲆进行病原菌平板划线分离和PCR鉴定，PCR扩增结果送公司测序后经NCBI网站比对分析序列为迟缓爱德华氏菌与杀鲑气单胞菌，确认死亡是否由于感染病原菌所引起。根据公式计算免疫保护率(Relative percentsurvival，RPS)：
Figure BDA0003161956220000091
结果如图4所示，免疫后第29天用LD50混合菌液浓度进行腹腔注射攻毒感染大菱鲆，对照组在第3天开始出现死亡，疫苗组在第5天出现死亡。相比于对照组，二联疫苗的相对免疫保护率为73.33％，拥有更高的保护率。
5、大菱鲆相关免疫基因表达变化测定
采用qRT-PCR方法检测免疫基因在对照组与实验组不同时间点的表达变化。于免疫后0-4w分别从实验组与对照组取大菱鲆肾脏组织，每组每次分别随机取9条鱼。参考TransZol up(TransGen)说明书提取组织的RNA，通过1％的琼脂糖凝胶电泳来检测RNA完整性，并使用超微量分光光度计测定RNA的浓度和OD260nm/OD280nm比率。检测结果较好的RNA反转录为cDNA，以其为模板进行实时荧光定量PCR扩增，每个样品设3个平行。使用NCBIPrimer针对不同的4对基因进行qRT-PCR引物设计(引物序列如表1所示)，引物由青岛派森诺生物有限公司合成。以β-actin为内参基因，计算在五个时间点(0、1、2、3、4w)实验组与对照组的免疫相关基因表达量。
表1扩增引物
Figure BDA0003161956220000101
结果如图5所示，肝脏中，实验组基因的表达量呈上调趋势(P<0.05)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌二联疫苗及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 868
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcttacacat gcagtcgagc ggtagcaggg agaaagcttg ctttctccgc tgacgagcgg 60
cggacgggtg agtaatgtct ggggatctgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg 120
tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagtggggga ccttcgggcc tcatgccatc 180
agatgaaccc agatgggatt agctagtagg tggggtaatg gctcacctag gcgacgatcc 240
ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac 300
gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt 360
gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagtag ggaggaaggt gtgaacgtta 420
atagcgctca caattgacgt tacctacaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc 480
cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg 540
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcaagtcga gcggcagcgg gaaagtagct tgctactttt gccggcgagc ggcggacggg 60
tgagtaatgc ctggggatct gcccagtcga gggggataac agttggaaac gactgctaat 120
accgcatacg ccctacgggg gaaaggaggg gaccttcggg cctttcgcga ttggatgaac 180
ccaggtggga ttagctagtt ggtggggtaa tggctcacca aggcgacgat ccctagctgg 240
tctgagagga tgatcagcca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca 300
gcagtgggga atattgcaca atgggggaaa ccctgatgca gccatgccgc gtgtgtgaag 360
aaggccttcg ggttgtaaag cactttcagc gaggaggaaa ggttggcgcc taatacgtgt 420
caactgtgac gttactcgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacggagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgca ggcggttgga 540
taagttagat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaattg catttaaaac tgtccagcta 600
gagtcttgta gaggggggta gaattccagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggag 660
gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga caaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg 720
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gatttggagg 780
ctgtgtcctt gagacgtggc ttccggagct aacgcgttaa atcgaccgcc tggggagtac 840
ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggg 875

Claims (6)

1.一种疫苗菌株，其特征在于，包括杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌，所述杀鲑气单胞菌于2021年4月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021397，保藏地址为武汉大学；所述迟缓爱德华氏菌于2021年4月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021422，保藏地址为武汉大学。
2.一种二联疫苗，其特征在于，所述二联疫苗的抗原为权利要求1中所述的杀鲑气单胞菌和所述的迟缓爱德华氏菌。
3.如权利要求2所述的二联疫苗，其特征在于，所述二联疫苗的抗原杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌按照体积比1:1-1:2混合。
4.如权利要求2所述的二联疫苗，其特征在于，所述二联疫苗为灭活疫苗。
5.如权利要求2所述的二联疫苗，其特征在于，所述二联疫苗还包括763佐剂。
6.一种如权利要求1所述的疫苗菌株或者如权利要求2-5任一项所述的二联疫苗在防治杀鲑气单胞菌和/或迟缓爱德华氏菌引起的鱼类疾病的二联疫苗中的应用。
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