CN103191422A - 一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗及制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗，该三联口服疫苗由药用淀粉、麦芽糊精、浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液、浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液及浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液按比例3:1:0.35:0.35:0.35，单位为：克:克:ml:ml:ml混合配制而成；本发明所涉及用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的制备，其方法步骤包括：⑴灭活；⑵微丸制备；⑶肠溶层包衣制备及⑷诱食剂的喷涂；本发明所涉及用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的使用方法，其方法步骤包括：⑴第一次投喂和⑵加强投喂。本发明制备了副溶血性弧菌、溶藻弧菌和迟缓爱德华氏菌三联口服疫苗，并采用投喂接种的方法，免疫效果理想，工作量小，适合大规模接种，同时，本发明采用功能性包衣材料，既保护疫苗在胃液中不被消化，又使疫苗在肠道中迅速释放，产生免疫反应，获得高效免疫效果。

Description

一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗及制备和使用方法

技术领域

本发明属于养殖海水鱼类的疫苗及使用的技术领域，具体涉及一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗及制备和使用方法。

背景技术

我国海水养殖鱼类的疾病呈逐年增加趋势，尤其是副溶血性弧菌、溶藻弧菌和迟缓爱德华氏菌的流行，造成了巨大的经济损失，严重阻碍了我国水产养殖业的发展。目前鱼类细菌性疾病主要是通过采用抗菌药物结合优化养殖技术的方法进行疾病的预防和治疗。然而，长期使用抗生素及化学药品，使大部分细菌产生了较强且广泛的耐药性，并且还造成环境污染以及药物残留超标等食品安全问题。由于药残问题，多次造成我国的水产品出口受限。为了达到环境安全、食品安全及无公害水产养殖的目的，国家已经命令禁止生产和使用危害严重的药物，尽量少用或不用药物。随着免疫学技术的发展，近年来诸多学者研究表明疫苗免疫接种是防治鱼类细菌性疾病的有效方法，为鱼类细菌病的防治寻找到了另一有效安全的防治途径，是我国科学研究重点支持的领域之一。

随着高密度、设施集约化养殖模式的普及，鱼类细菌性疾病呈现出多重感染、混合感染、交叉感染的新趋势，同时感染多种细菌的情况非常普遍，因此一些学者开展了二联疫苗、三联疫苗和多联疫苗研究。如近些年已经开展了鳗弧菌和溶藻弧菌二联疫苗对大菱鲆的免疫效果研究、开展了嗜水气单胞菌和河弧菌二联疫苗对鲫的免疫效果研究、开展了溶藻弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌三联疫苗对大黄鱼常见细菌性疾病免疫保护的实验研究、开展了三联疫苗预防斑点叉尾鮰细菌性疾病研究。以上研究全部采用注射和浸泡免疫方法，由于浸泡具有免疫效果差、疫苗用量大等缺点，注射接种疫苗操作过程繁琐、工作量大、伤口容易感染等，均不适宜在生产实践中应用。口服接种具有免疫效果好、操作方便、刺激较小以及工作强度小等特点，适宜在生产中大规模应用，成为当前的研究热点。

另外，近年来也有科研人员采用2%海藻酸钠、6%PVP-K30制备了银鲫口服嗜水气单胞菌微胶囊疫苗，相对免疫保护率为61.1%，高于全细胞疫苗组的50%；用聚乳酸—乙醇酸共聚物PLG和聚乙烯醇采用复乳挥发法制备嗜水气单胞菌口服疫苗，产品相对免疫保护率为42.9%，高于全细胞疫苗组的32.1%。以上研究均是希望递送疫苗到后肠，刺激肠道粘膜免疫相关淋巴组织发挥免疫作用。但是，以上技术没有对相关鱼类的胃肠道消化生理特性研究，也没有对其进行耐酸性研究，因此疫苗有效成分不能实现肠道释放的目的，如养殖海水鱼类,如大菱鲆、牙鲆等，胃液pH一般在2.5～5.5，胃排空时间一般为4～8小时，肠液pH一般在6.0～7.8，由于鱼用疫苗易受温度、酸碱度、胃蛋白酶影响，直接口服接种会损坏疫苗，降低疫苗免疫效果，如果疫苗过早释放，将被胃酸、消化酶分解，不能起到免疫保护作用，限制了其在生产中的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗及制备和使用方法。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗，该三联口服疫苗由药用淀粉、麦芽糊精、浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液、浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液及浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液混合配制而成，所述药用淀粉:麦芽糊精:浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液的比例为：3:1:0.35:0.35:0.35，单位为：克:克:mL:mL:mL。

而且，所述副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液及迟缓爱德华氏菌菌液经过了0.5%的甲醛灭活。

一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的制备，其特征在于：该制备过程的方法如下：

⑴灭活：使用0.5%的甲醛对副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液和迟缓爱德华氏菌菌液进行灭活；

⑵微丸制备：

①按药用淀粉:麦芽糊精:浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液的比例为：3:1:0.35:0.35:0.35，单位为：克:克:mL:mL:mL的配比将上述物质混合均匀成微湿的软材；

②制微丸：对上述软材使用微丸机制微丸，微丸机采用400转/分钟的转速，制备成10～20目的微丸；

⑶肠溶层包衣制备：

①将主要成分为肠溶型丙烯酸树脂包衣材料溶于90%的乙醇中，制备成10%～15%的悬浊液；

②使用包衣机将上述悬浊液均匀喷涂于疫苗微丸的表面；

⑷诱食剂的喷涂：

①将二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10%～30%的水溶液；

②使用包衣机将上述水溶液均匀喷涂于上述制备的肠溶层包衣表面。

而且，所述步骤⑵所述制备成的微丸的有效疫苗含量为10⁹cfu/g量级水平。

而且，所述步骤⑶的①的步骤中肠溶型丙烯酸树脂的具体标号为EOBS60，pH6.0。

而且，所述步骤⑷的①的步骤中诱食剂二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)，以甜菜碱代替作为诱食剂。

一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的使用方法，其特征在于：该方法的步骤如下：

⑴第一次投喂：在每天正常饵料投喂间隔，将三联口服疫苗微丸投喂鱼，投喂量为正常饵料量的50%，每天2次；

⑵加强投喂；在第一次投喂三联口服疫苗微丸后的第25－35天开始与第一次投喂方法相同的加强投喂。

本发明的优点和效果是：

1、本发明与现有疫苗制备方法相比，本发明首次制备了副溶血性弧菌、溶藻弧菌和迟缓爱德华氏菌三联口服疫苗，并采用投喂接种的方法，免疫效果理想，工作量小，适合大规模接种。

2、本发明采用功能性包衣材料，既保护疫苗在胃液中不被消化，又使疫苗在肠道中迅速释放，与后肠黏膜充分接触，产生免疫反应，获得高效免疫效果，解决了直接口服给药免疫效果差的问题。

3、本发明充分考虑工厂化海水鱼的生活环境、身体机能、捕食习惯等特点，在配方比例上反复进行实验，科学取值，针对性很强，使用方便，效果非常显著，有很高的市场应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。

一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗，该三联口服疫苗由药用淀粉、麦芽糊精、浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液、浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液及浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液混合配制而成，所述药用淀粉:麦芽糊精:浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液的比例为：3:1:0.35:0.35:0.35，单位为：克:克:mL:mL:mL。

在本发明的具体实施中，所述副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液及迟缓爱德华氏菌菌液在使用前要经过0.5%的甲醛灭活。

一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的制备，该制备过程的方法如下：

⑴灭活：使用0.5%的甲醛对副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液和迟缓爱德华氏菌菌液进行灭活；

⑵微丸制备：

①按药用淀粉:麦芽糊精:浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液的比例为：3:1:0.35:0.35:0.35，单位为：克:克:mL:mL:mL的配比将上述物质混合均匀成微湿的软材；

②制微丸：对上述软材使用微丸机制微丸，微丸机采用400转/分钟的转速，制备成10～20目的微丸，所述制备成的微丸的有效疫苗含量为10⁹cfu/g量级水平；

⑶肠溶层包衣制备：

①将主要成分为肠溶型丙烯酸树脂包衣材料溶于90%的乙醇中，制备成10%～15%的悬浊液；在本发明的具体实施中，肠溶型丙烯酸树脂的具体型号为EOBS60，pH6.0；

②使用包衣机将上述悬浊液均匀喷涂于疫苗微丸的表面；

⑷诱食剂的喷涂：

①将二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10%～30%的水溶液；在本发明的具体实施中，所述诱食剂二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)，可以根据不同的鱼种喷涂不同种类，不同浓度的诱食剂，如采用甜菜碱作为诱食剂，其水溶液浓度为20%；

②使用包衣机将上述水溶液均匀喷涂于上述制备的肠溶层包衣表面。

一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的使用方法，该方法的步骤如下：

⑴第一次投喂：在每天正常饵料投喂间隔，将三联口服疫苗微丸投喂鱼，投喂量为正常饵料量的50%，每天2次；

⑵加强投喂；在第一次投喂疫苗微丸后的第25－35天开始与第一次投喂方法相同的加强投喂。

三联口服疫苗及其制备实例1

一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的制备，该三联口服疫苗制剂的配方如下：150g药用淀粉、50g麦芽糊精、55mL经过0.5%的甲醛灭活的副溶血性弧菌、溶藻弧菌和迟缓爱德华氏菌菌液（浓度为1×10¹²cfu,比例为1:1:1），通过微丸机制备出10～20目的微丸，自然晾干或低温烘干，疫苗有效含量为10⁹cfu/g。将肠溶型包衣材料（主要成分为丙烯酸树脂）溶于90%的乙醇中，制备成10%的悬浊液，使用包衣机均匀喷涂于疫苗微丸的表面，最后将二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10%的溶液，使用包衣机均匀喷涂于肠溶层表面。

三联口服疫苗及其制备实例2

一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的制备，该三联口服疫苗制剂的配方如下：150g药用淀粉、50g麦芽糊精、55mL经过0.5%的甲醛灭活的副溶血性弧菌、溶藻弧菌和迟缓爱德华氏菌菌液（浓度为1×10¹²cfu,比例为1:1:1），通过微丸机制备出10～20目的微丸，自然晾干或低温烘干,疫苗有效含量为10⁹cfu/g。将肠溶型包衣材料（主要成分为丙烯酸树脂）溶于90%的乙醇中，制备成15%的悬浊液，使用包衣机均匀喷涂于疫苗微丸的表面，最后将二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成30%的溶液，使用包衣机均匀喷涂于肠溶层表面。

三联口服疫苗的使用方法实例

将上述制备的疫苗微丸投喂半滑舌鳎，投喂量为正常饵料投喂量的50%，其余50%投喂正常饵料，每天2次，连续投喂2天，间隔30天加强投喂2天。

应用效果对比：

水族箱小水体免疫大菱鲆实验，设计两个组，对照组和口服免疫组。口服免疫组每天投喂制备的口服疫苗2次，连续投喂2天，然后投喂正常饵料；对照组投喂正常颗粒饵料。间隔7天采血一次，每组采4尾鱼，测定血清和后肠黏膜中的抗体平均水平。28天后，分别对试验鱼和对照鱼进行溶藻弧菌、副溶血性弧菌和迟缓爱德华氏菌（比例为1:1:1，菌液浓度为1×10⁹cfu/mL）进行人工感染，7天后统计两组鱼的死亡率，并计算免疫保护率。结果见表1和表2。

表1口服免疫后大菱鲆血清中抗体效价均值

表2口服免疫后大菱鲆后肠黏膜中抗体效价均值

口服免疫组血清和后肠黏膜中的溶藻弧菌、副溶血性弧菌和爱德华氏菌的抗体效价在14天时达到最大值，抗体水平都明显高于对照组。口服免疫组鱼的人工感染死亡率分别为50%，远低于对照组100%，相对免疫保护率达到50%。结果证明投喂本发明的养殖海水鱼类三联口服疫苗可以明显提高大菱鲆对溶藻弧菌、副溶血性弧菌和迟缓爱德华氏菌的抵抗力。

工厂化车间对比试验结果：

试验时间：2012年9月至12月；试验地点：天津市鑫永丰水产养殖有限公司，养殖模式：工厂化养殖；养殖鱼类：牙鲆；实验池投喂本发明口服三联疫苗，每天投喂2次，连续投喂2天，30天后加强免疫一次；对照池投喂普通饵料，其它养殖及管理方法相同。3个月后采集10尾鱼血清用凝集法测定抗体效价，并取20尾鱼进行溶藻弧菌、副溶血性弧菌和爱德华氏菌（比例为1:1:1，菌液浓度为1×10⁹cfu/mL）人工感染实验，测定免疫保护率。试验结果见表3。

表3工厂化车间牙鲆的血清抗体效价及免疫保护率

实验池溶藻弧菌、副溶血性弧菌和爱德华氏菌效价均值分别为256、192和217.6，高于对照池的5.6、5.2和4.8；攻毒试验免疫保护率达到60%。实验池效果明显优于对照池。结果证明，工厂化养殖投喂本发明的三联口服疫苗可有效地预防牙鲆溶藻弧菌、副溶血性弧菌和爱德华氏菌病，提高免疫保护率。

Claims (7)

1.一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗，其特征在于：该三联口服疫苗由药用淀粉、麦芽糊精、浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液、浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液及浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液混合配制而成，所述药用淀粉:麦芽糊精:浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液的比例为：3:1:0.35:0.35:0.35，单位为：克:克:mL:mL:mL。

2.根据权利要求1所述的用于养殖海水鱼类三联口服疫苗，其特征在于：所述副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液及迟缓爱德华氏菌菌液经过了0.5%的甲醛灭活。

3.一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的制备，其特征在于：该制备过程的方法如下：

⑴灭活：使用0.5%的甲醛对副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液和迟缓爱德华氏菌菌液进行灭活；

⑵微丸制备：

①按药用淀粉:麦芽糊精:浓度为1×10¹²cfu的副溶血性弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的溶藻弧菌菌液:浓度为1×10¹²cfu的迟缓爱德华氏菌菌液的比例为：3:1:0.35:0.35:0.35，单位为：克:克:mL:mL:mL的配比将上述物质混合均匀成微湿的软材；

②制微丸：对上述软材使用微丸机制微丸，微丸机采用400转/分钟的转速，制备成10～20目的微丸；

⑶肠溶层包衣制备：

①将主要成分为肠溶型丙烯酸树脂包衣材料溶于90%的乙醇中，制备成10%～15%的悬浊液；

②使用包衣机将上述悬浊液均匀喷涂于疫苗微丸的表面；

⑷诱食剂的喷涂：

①将二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10%～30%的水溶液；

②使用包衣机将上述水溶液均匀喷涂于上述制备的肠溶层包衣表面。

4.根据权利要求3所述的用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的制备，其特征在于：所述步骤⑵所述制备成的微丸的有效疫苗含量为10⁹cfu/g量级水平。

5.根据权利要求3所述的用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的制备，其特征在于：所述步骤⑶的①的步骤中肠溶型丙烯酸树脂的具体标号为EOBS60，pH6.0。

6.根据权利要求3所述的用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的制备，其特征在于：所述步骤⑷的①的步骤中诱食剂二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)，以甜菜碱代替作为诱食剂。

7.一种用于养殖海水鱼类三联口服疫苗的使用方法，其特征在于：该方法的步骤如下：

⑴第一次投喂：在每天正常饵料投喂间隔，将三联口服疫苗微丸投喂鱼，投喂量为正常饵料量的50%，每天2次；

⑵加强投喂；在第一次投喂三联口服疫苗微丸后的第25－35天开始与第一次投喂方法相同的加强投喂。