CN101810638B

CN101810638B - 内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方法

Info

Publication number: CN101810638B
Application number: CN 200910215745
Authority: CN
Inventors: 刘宗柱
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2009-12-31
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2029-12-31
Also published as: CN101810638A

Abstract

内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方法，它涉及一种通过诱导内源性干扰素水平的提高。应用内源性干扰素诱导技术，避免了干扰素制剂本身种属特异性强的缺陷，并且可以通过多种方式给药，更方便于生产实践中应用，具有起效剂量极低，降解产物可直接进入动物机体代谢池继续代谢等特点，对于有效控制养殖动物病毒性感染，降低药残危害具有重要意义。

Description

内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种通过诱导内源性干扰素水平的提高，防治养殖动物病毒性感染的药物组合；具体涉及该组合用药物的制备及方便各种应用的制剂制备方法。

背景技术：

病毒性感染是引起养殖动物死亡、影响动物养殖经济效益的重要因素，随着国家兽药质量标准的规范，取消了大批原地方标准的抗病毒药物，可选用的抗病毒药物的短缺与兽医临床的需求矛盾日益突出。

1967年，美国Merck药厂的Field等人发现了酶促合成的双链核酸(double strained RNA，dsRNA)具有诱生干扰素的能力，其中聚肌胞(Polyinosinic-polycytidylic Acid，PIC)的诱生能力最强，它可以刺激机体产生广谱的内源干扰素，进而激活蛋白激酶和2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶、Mx蛋白等抗病毒因子，以降解进入细胞的病毒，达到抑制、治疗病毒性感染的目的。

PIC由寡聚肌苷酸与寡聚胞苷酸在合适的条件下按碱基配对的原则聚合而成。研究表明，PIC分子量的大小、双链的紧密程度及其稳定性是决定其诱导干扰素活性高低的重要影响因素。目前，国内虽然有寡聚肌苷酸及寡聚胞苷酸原料的生产，但尚缺乏对PIC双链配对的合适条件、稳定性影响因素等的系统研究。

关于内源性干扰素诱导剂方面的研究和应用，也有过一些报道。如专利申请号为95111433.6的发明专利“人白细胞干扰素口含片及其制备方法”，直接应用人白细胞干扰素加辅料制成片剂，但该说明书表明该制剂具有激素特性，给人的应用带来潜在的风险；再如，申请号为200310110892.2的发明专利“复方干扰素诱生剂口含片”，以及申请号为90101032.4的发明专利“人体内诱导干扰素的制造方法”，利用新城疫减毒活疫苗作为干扰素诱生剂，外源病毒的引入也会带来病毒重组、突变的潜在风险；申请号为200810154198.3的发明专利“一种用于宠物的聚肌胞滴丸及其制备方法”，以及申请号为ZL93105862.7的发明专利“聚肌胞复合物免疫佐剂及含有该佐剂的疫苗”，利用聚肌胞作为抗病毒制剂或者免疫佐剂，但在制剂类型上，不方便集约化养殖饮水给药，更不方便于水产养殖中通过药浴的方式给药。

发明内容：

本发明的目的是提供一种内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方法，它应用内源性干扰素诱导技术，避免了干扰素制剂本身种属特异性强的缺陷，并且可以通过多种方式给药，更方便于生产实践中应用，具有起效剂量极低，降解产物可直接进入动物机体代谢池继续代谢等特点，对于有效控制养殖动物病毒性感染，降低药残危害具有重要意义。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：400ml-500ml注射用水中依次加入焦亚硫酸钠0.7g-0.9g、氯化钠1.4-g1.6g以及适量的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，加热至20-60℃，进一步优选为30-50℃之间的某一特定温度，加入2800mg--3000mg聚胞苷酸搅拌使溶解，保温10分钟，然后加入2800mg-3000mg聚肌苷酸搅拌使溶解，保温配对15-30分钟，即得到聚肌胞苷酸母液。

为进一步增强双链配对的紧密性，提高聚肌胞苷酸作为内源性干扰素诱导剂的使用效果，并使之方便应用于小群体养殖的动物，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为稳定的注射液制剂。基本过程为：取聚肌胞苷酸母液200ml-300ml，加入CaCl₂ 0.46g，充分搅拌使溶解，用注射用水定容至900ml-1000ml，0.45um微孔滤膜过滤，安瓿瓶灌封，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，流水中迅速冷却，灯检，贴标，即得到聚肌胞苷酸注射液。该注射液可用于宠物、小群体养殖的动物病毒性感染的防治。

鉴于集约化养殖的动物群体，如肉鸡、肉鸭等，最方便的给药途径是通过饮水给药；而对于水产养殖动物而言，便利的给杨方式为药浴或拌饵饲喂。但是，作为小分子RNA，环境及消化道中存在很高的RNA酶的活性，非常容易降解。为解决这一问题，本发明利用壳聚糖将聚肌胞苷酸包被成纳米微囊，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为可口服或药浴使用的溶液制剂。其基本过程为：取壳聚糖1g-2g，加入注射用水100ml-200ml及乙酸1ml-2ml，充分搅拌使溶解，放置12小时，使壳聚糖分子充分伸展；上述溶液中加入聚肌胞母液300ml-400ml，充分搅拌6小时，使外表带有负电荷的聚肌胞苷酸(磷酸基)包裹于带正电荷的壳聚糖的纳米微囊中。必要时，溶液中加入1.5g-1.6g NaCl以增加离子强度，促进壳聚糖纳米微囊的形成。以激光笔照射溶液检验出现“丁达尔”现象，并且溶液形成的“光路”没有明显闪亮的结晶体，则表明形成了稳定的壳聚糖纳米微囊。以纯化水定容至900ml-1000ml，0.22μm微孔滤膜法过滤除菌，分装，即得。该制剂可方便地应用于集约化养殖的鸡、鸭等通过饮水线给药，也可方便地应用于水产养殖动物如鱼、虾、螃、海参等通过药浴或拌饵给药。

本发明具有以下有益效果：应用内源性干扰素诱导技术，避免了干扰素制剂本身种属特异性强的缺陷，并且可以通过多种方式给药，更方便于生产实践中应用，具有起效剂量极低，降解产物可直接进入动物机体代谢池继续代谢等特点，对于有效控制养殖动物病毒性感染，降低药残危害具有重要意义。

附图说明：

图1为本发明聚肌胞苷酸注射液对猪瘟病毒感染的保护试验示意图；

图2为本发明聚肌胞苷酸溶液对雏鸡新城疫感染的保护试验示意图；

图3为本发明聚肌胞苷酸溶液对传染性胰脏坏死症病毒感染的保护试验示意图。

具体实施方式：

本具体实施方式采用以下技术方案：500ml注射用水中依次加入焦亚硫酸钠0.9g、氯化钠1.6g以及适量的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，加热至20-60℃，进一步优选为30-50℃之间的某一特定温度，加入3000mg聚胞苷酸搅拌使溶解，保温10分钟，然后加入3000mg聚肌苷酸搅拌使溶解，保温配对15-30分钟，即得到聚肌胞苷酸母液。从该聚肌胞苷酸母液出发，可进一步制备成注射液以及纳米微囊化的口服或药浴用溶液。

为进一步增强双链配对的紧密性，提高聚肌胞苷酸作为内源性干扰素诱导剂的使用效果，并使之方便应用于小群体养殖的动物，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为稳定的注射液制剂。基本过程为：取聚肌胞苷酸母液300ml，加入CaCl₂ 0.46g，充分搅拌使溶解，用注射用水定容至1000ml，0.45um微孔滤膜过滤，安瓿瓶灌封，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，流水中迅速冷却，灯检，贴标，即得到聚肌胞苷酸注射液。该注射液可用于宠物、小群体养殖的动物病毒性感染的防治。

鉴于集约化养殖的动物群体，如肉鸡、肉鸭等，最方便的给药途径是通过饮水给药；而对于水产养殖动物而言，便利的给杨方式为药浴或拌饵饲喂。但是，作为小分子RNA，环境及消化道中存在很高的RNA酶的活性，非常容易降解。为解决这一问题，本发明利用壳聚糖将聚肌胞苷酸包被成纳米微囊，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为可口服或药浴使用的溶液制剂。其基本过程为：取壳聚糖2g，加入注射用水200ml及乙酸2ml，充分搅拌使溶解，放置12小时，使壳聚糖分子充分伸展；上述溶液中加入聚肌胞母液400ml，充分搅拌6小时，使外表带有负电荷的聚肌胞苷酸(磷酸基)包裹于带正电荷的壳聚糖的纳米微囊中。必要时，溶液中加入1.6g NaCl以增加离子强度，促进壳聚糖纳米微囊的形成。以激光笔照射溶液检验出现“丁达尔”现象，并且溶液形成的“光路”没有明显闪亮的结晶体，则表明形成了稳定的壳聚糖纳米微囊。以纯化水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜法过滤除菌，分装，即得。该制剂可方便地应用于集约化养殖的鸡、鸭等通过饮水线给药，也可方便地应用于水产养殖动物如鱼、虾、螃、海参等通过药浴或拌饵给药。

本具体实施方式应用内源性干扰素诱导技术，避免了干扰素制剂本身种属特异性强的缺陷，并且可以通过多种方式给药，更方便于生产实践中应用，具有起效剂量极低，降解产物可直接进入动物机体代谢池继续代谢等特点，对于有效控制养殖动物病毒性感染，降低药残危害具有重要意义。

实施例1：选取出生日龄、体重接近的30头断奶仔猪，作为实验动物，检验聚肌胞苷酸注射液对猪瘟病毒感染的防治效果。将实验动物随机分为3个试验组，每组10头。分组及试验方法如下：I组：空白对照组(生理盐水组)；II组：黄芪多糖药物对照组(黄芪多糖注射液，按每千克体重20mg)；III组：聚肌胞苷酸药物对照组(聚肌胞苷酸注射液，按每千克体重0.05mg)。将断奶仔猪按以上实验分组隔离饲养，饲养条件保持一致。饲养1周后，各组分别进行猪瘟弱毒疫苗基础免疫。免疫21天，将各组按照分组计划进行药物处理，12小时后进行攻毒(攻毒剂量为10倍LD₅₀猪瘟强病毒)，攻毒后24小时给药组再次注射与首次注射剂量相同的药物。试验过程中，每日观察2次，试验观察持续到猪瘟潜伏期结束。

实验结果参看图1，表明聚肌胞苷酸注射液对猪病毒病的感染发病有明显的保护率和较高的治愈率，能够抑制病毒在家畜体内的增殖，有效降低家畜病毒性感染的死亡率。

实施例2：选取120只AA肉仔鸡为实验动物，检验聚肌胞苷酸溶液对新城疫病毒感染的保护效果。实验用雏鸡出壳育雏至7日龄，进行新城疫弱毒疫苗点眼滴鼻基础免疫。然后将试验用雏鸡随机分为3个试验组，每组40只。I组：空白对照组(生理盐水组)；II组：黄芪多糖药物对照组(黄芪多糖口服液，按每千克体重40mg)；III组：聚肌胞苷酸溶液试验组(聚肌胞苷酸溶液，按每千克体重0.05mg)；将以上雏鸡隔离笼养，饲养条件保持一致。免疫后10d，将各组按照分组计划进行药物处理，12h后将进行攻毒(攻毒10倍LD₅₀的新城疫强毒)，攻毒后24h将各组再按照分组方案口服与首次用药剂量相同的药物观察，观察时间持续到新城疫潜伏期结束。

实验结果参看图2，表明聚肌胞苷酸溶液对家禽新城疫病毒感染发病有明显的保护率和高的治愈率。

实施例3：将120条试验用虹鳟稚鱼随机均分为3个试验组进行试验，每组40条。I组：空白对照组(生理盐水组)；II组：黄芪多糖药物对照组(黄芪多糖口服液，按每公斤体重30mg)；III组：聚肌胞药物对照组(聚肌胞苷酸溶液，按每千克体重0.05mg)。各组所用药物以药浴的方式使用。将虹鳟稚鱼按以上实验分组隔离饲养于水族缸，饲养条件保持一致。饲养一周后，各组按方案分组给药，药浴时，水族缸放出大部分水，加入药物，保持通氧，药浴30分钟，然后加水至常量。12小时后各组水族缸中加入100倍LD₅₀的传染性胰脏坏死症病毒培养液，攻毒后24小时后，按各组方案再次药浴，观察结果。

该实验结果参看图3，表明聚肌胞苷酸溶液可有效抑制水产鱼类病毒病增殖，从而达到对水产鱼类病毒病感染的治疗与预防作用。

Claims

1.一种聚肌胞苷酸注射液制剂的制备方法，其特征在于：母液制备：400ml-500ml注射用水中依次加入焦亚硫酸钠0.7g-0.9g、氯化钠1.4g-1.6g以及适量的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，加热至20-60℃，加入2800mg--3000mg聚胞苷酸搅拌使溶解，保温10分钟，然后加入2800mg-3000mg聚肌苷酸搅拌使溶解，保温配对15-30分钟，即得到聚肌胞苷酸母液；取聚肌胞苷酸母液200ml-300ml，加入CaCl₂0.46g，充分搅拌使溶解，用注射用水定容至900ml-1000ml，0.45um微孔滤膜过滤，安瓿瓶灌封，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，流水中迅速冷却，灯检，贴标，即得到聚肌胞苷酸注射液。

2.一种聚肌胞苷酸纳米微囊化溶液制剂的制备方法，其特征在于母液制备：400ml-500ml注射用水中依次加入焦亚硫酸钠0.7g-0.9g、氯化钠1.4g-1.6g以及适量的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，加热至20-60℃，加入2800mg--3000mg聚胞苷酸搅拌使溶解，保温10分钟，然后加入2800mg-3000mg聚肌苷酸搅拌使溶解，保温配对15-30分钟，即得到聚肌胞苷酸母液；取壳聚糖1g-2g，加入注射用水100ml-200ml及乙酸1ml-2ml，充分搅拌使溶解，放置12小时，使壳聚糖分子充分伸展；上述溶液中加入聚肌胞母液300ml-400ml，充分搅拌6小时，使外表带有负电荷的聚肌胞苷酸(磷酸基)包裹于带正电荷的壳聚糖的纳米微囊中；必要时，溶液中加入1.5g-1.6gNaCl以增加离子强度，促进壳聚糖纳米微囊的形成；以激光笔照射溶液检验出现“丁达尔”现象，并且溶液形成的“光路”没有明显闪亮的结晶体，则表明形成了稳定的壳聚糖纳米微囊；以纯化水定容至900ml-1000ml，0.22μm微孔滤膜法过滤除菌，分装，即得。