TWI744983B

TWI744983B - 針對多巴脫羧酵素之雙股rna的用途

Info

Publication number: TWI744983B
Application number: TW109123921A
Authority: TW
Inventors: 鄭文騰; 劉郁芬
Original assignee: 國立屏東科技大學
Priority date: 2020-07-15
Filing date: 2020-07-15
Publication date: 2021-11-01
Also published as: TW202204614A

Abstract

一種針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，係用以製備提升南美白蝦的免疫能力之藥物，其中，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA係投予一蝦體，以增強該蝦體之免疫能力。

Description

針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途

本發明係關於一種針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，特別係該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA用以製備提升南美白蝦的免疫能力之藥物的用途。

近年來，台灣蝦類養殖蓬勃發展，蝦體不僅可以作為食物來源，亦可以外銷為國家帶來豐富的經濟效益。由於南美白蝦養殖快速發展，而限於土地價格高，養殖業者須採用高密度養殖，以降低成本。

高密度的養殖方式會造成養殖環境惡化，使南美白蝦之間容易相互傳染疾病，因而會使南美白蝦的死亡率上升；為了降低死亡率，養殖業者常會於飼料中添加抗生素，然而抗生素的濫用，不僅是導致食用者攝取南美白蝦而發生過敏的原因，亦可能會誘發病原菌產生抗藥性，因此仍需進一步的改善。

本發明提供一種針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，係可以提升南美白蝦之免疫能力，以免除抗生素的使用者。

本發明之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，係用以製備提升南美白蝦的免疫能力之藥物，其中，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA係投予一蝦體，以增強該南美白蝦之免疫能力；其中，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA具有如SEQ ID NOS：1及2所示之核苷酸序列。

本發明之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，係藉由該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的投予，可以提升南美白蝦之總血球細胞數及酚氧化酵素的活性等免疫參數、促進南美白蝦之血球細胞的吞噬率與清除細菌之能力，且降低南美白蝦遭受病原菌攻擊的死亡率，是以可以降低養殖業者於養殖過程中的抗生素使用量，為本發明之功效。

並且，藉由該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA具有如SEQ ID NOS：1及2所示之核苷酸序列，可以具有較佳的提升該蝦體之免疫能力的效果。

本發明之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，其中，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA係注射投予該蝦體，較佳係注射至該蝦體的頭胸部腹面血竇；如此，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA可以經由該蝦體之血淋巴流向各組織，而具有較佳的提升該蝦體之免疫能力的效果。

本發明之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，其中，蝦體該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA係以每公克之蝦體重投予2μg之劑量投予該蝦體蝦體蝦體；如此，藉由該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的投予劑量而具有較佳的提升蝦體之免疫能力的效果。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：

本發明所述「針對多巴脫羧酵素之雙股RNA」，係具有對應多巴脫羧酵素之基因序列的核苷酸序列，因而當該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA投予一蝦體時，可以於該蝦體中阻斷多巴脫羧酵素的蛋白質活性，此為本領域所屬具有通常知識者所廣泛應用，在此不加以贅述；舉例而言，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA可以具有如SEQ ID NOS：1及2所示之核苷酸序列，但不以此為限。

該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA可以阻斷多巴脫羧酵素的蛋白質活性，因而可以將一有效劑量之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA投予該蝦體，以提升該蝦體之免疫能力。

舉例而言，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA係可以利用注射方式投予該蝦體，例如將該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA注射至該蝦體的頭胸部之腹面血竇，該腹面血竇係接近心臟，為該蝦體之血淋巴集中處，是以該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA可以經由該蝦體之血淋巴流向各組織；於本實施例中，該有效劑量係以每公克之蝦體重投予2 μg之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA。

為證實該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA可以有效提升南美白蝦的免疫能力，及降低南美白蝦遭受病原菌攻擊的死亡率，遂進行以下試驗：

（A）對免疫參數（immune parameter）的影響

本試驗係選用從屏東養殖場取得的白蝦，試驗前，先將該南美白蝦置於實驗室養殖兩週，使其適應試驗養殖環境（淡水環境，鹽度為20 ppt；水溫為27±1℃），在試驗過程中，以市售蝦飼料（購自全興國際水產股份有限公司）進行餵飼。

請參照第1表所示，將該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA（SEQ ID NOS：1及2）注射投予第A3組之白蝦，另將非針對多巴脫羧酵素之雙股RNA注射投予第A2組之白蝦以作為控制組（第A2組係投予針對人類甘油醛3-磷酸脫氫酶之雙股RNA），各組雙股RNA之注射劑量均為2 μg/g；另以未投予任何雙股RNA之第A1組作為控制組。

接著，於注射投予各組之雙股RNA的3天後，抽取該南美白蝦的血淋巴，並計算各組南美白蝦之血淋巴中的總血球數（total haemocyte count，簡稱THC）、檢測各組南美白蝦之酚氧化酵素的活性（phenoloxidase activity，簡稱PO activity），及進行呼吸爆試驗（respiratory burst assay，簡稱RB assay）。前述之總血球數、酚氧化酵素的活性及呼吸爆（即，超氧陰離子O ₂ ^-產量）皆為免疫參數（immune parameters），各免疫參數值越高，即表示免疫系統越強化。

第1表、用以投予本試驗各組南美白蝦之雙股RNA

組別	雙股RNA
第A1組	－
第A2組	針對人類甘油醛3-磷酸脫氫酶之雙股RNA （SEQ ID NOS：3及4）
第A3組	針對多巴脫羧酵素之雙股RNA （SEQ ID NOS：1及2）

請參照第1a、1b、1c圖所示，相較於第A1、A2組，投予針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的第A3組的總血球細胞數、酚氧化酵素的活性及超氧陰離子O ₂ ^-的產量均有大幅的提升（ p＜0.05，相較於第A1組分別增加約41.3%、58.7%及105.4%），顯示該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的投予確實可以提升南美白蝦的免疫能力。

（B）對抗溶藻弧菌的效能

請參照第2表所示，本試驗同樣將各組之雙股RNA注射投予該南美白蝦（注射劑量均為2 μg/g），並且於注射投予各組之雙股RNA的3天後，以溶藻弧菌注射各組南美白蝦，使該南美白蝦感染溶藻弧菌（感染劑量為2x10 ⁷CFU/蝦體，溶於0.85%氯化鈉水溶液中）1.5小時後，再抽取血淋巴，並進一步檢測各組南美白蝦之血球細胞的吞噬率及血淋巴液中清除細菌之能力，以評估對抗溶藻弧菌的效能；本試驗另以尚未注射投予雙股RNA的南美白蝦之血球細胞的吞噬率及血淋巴液中清除細菌之能力作為第B0組。

第2表、用以投予本試驗各組南美白蝦之雙股RNA

組別	溶藻弧菌	雙股RNA
第B0組	－	－
第B1組	＋	－
第B2組	＋	針對人類甘油醛3-磷酸脫氫酶之雙股RNA （SEQ ID NOS：3及4）
第B3組	＋	針對多巴脫羧酵素之雙股RNA （SEQ ID NOS：1及2）

請參照第2a、2b圖所示，相較於第B1、B2組，投予針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的第B3組的血球細胞的吞噬率及血淋巴液中清除細菌之效能均有大幅的提升（ p＜0.05，相較於第B1組分別增加約4.5%及44.5%），顯示該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的投予確實有助於清除血淋巴液中的溶藻弧菌。

（C）溶藻弧菌感染後的存活率

請參照第3表所示，本試驗同樣將各組之雙股RNA注射投予該南美白蝦（注射劑量均為2 μg/g），並且於注射投予各組之雙股RNA的3天後，以溶藻弧菌注射各組南美白蝦，使該南美白蝦感染溶藻弧菌（感染劑量為2x10 ⁵CFU/蝦體，溶於0.85%氯化鈉水溶液中），並於1、2、3、4、5及6天分別計算各組南美白蝦的死亡率。

第3表、用以投予本試驗各組南美白蝦之處理條件

組別	溶藻弧菌	雙股RNA
第C0組	－	－
第C1組	＋	－
第C2組	＋	針對人類甘油醛3-磷酸脫氫酶之雙股RNA （SEQ ID NOS：3及4）
第C3組	＋	針對多巴脫羧酵素之雙股RNA （SEQ ID NOS：1及2）

請參照第3圖所示，未感染溶藻弧菌之第C0組南美白蝦於6天內的死亡率為0；僅感染溶藻弧菌，未投予該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的第C1、C2組南美白蝦於5～6天內的死亡率約為50%；優先投予該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA後才感染溶藻弧菌的第C3組南美白蝦於5～6天內的死亡率降低至30%（ p＜0.05），顯示該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA可以有效預防溶藻弧菌的感染，降低南美白蝦受到溶藻弧菌的感染而死亡的風險。

綜合上述，本發明之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，係藉由該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的投予，可以提升南美白蝦之總血球細胞數及酚氧化酵素的活性等免疫參數、促進南美白蝦之血球細胞的吞噬率與清除細菌之能力，且降低南美白蝦遭受病原菌攻擊的死亡率，是以可以降低養殖業者於養殖過程中的抗生素使用量，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

無

〔第1a圖〕試驗(A)各組南美白蝦之血淋巴中的總血球數。

〔第1b圖〕試驗(A)各組南美白蝦之酚氧化酵素的活性。

〔第1c圖〕試驗(A)各組南美白蝦之呼吸爆(respiratory burst)。

［第2a圖］試驗（B）各組南美白蝦之血球細胞的吞噬活性。

［第2b圖］試驗（B）各組南美白蝦之溶藻弧菌的清除能力。

［第3圖］試驗（C）各組南美白蝦之存活率。

                         序列表
          <![CDATA[<110>  國立屏東科技大學]]>
          <![CDATA[<120>  針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途]]>
          <![CDATA[<160>  4     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人造序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  LvDCC dsRNA]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GAPDH dsRNA]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
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          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211> ]]> 21
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          <![CDATA[<213>  人造序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  4]]>
          aaccauguag uugaggucat t                                                 21

Claims

一種針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，係用以製備提升南美白蝦的免疫能力之藥物，其中，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA係投予一蝦體，以增強該蝦體之免疫能力；其中，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA具有如SEQ ID NOS：1及2所示之核苷酸序列。
如請求項1之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，其中，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA係注射投予該蝦體。
如請求項2之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，其中，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA係注射至該蝦體的頭胸部腹面血竇。
如請求項1之針對多巴脫羧酵素之雙股RNA的用途，其中，該針對多巴脫羧酵素之雙股RNA係以每公克之蝦體重投予2μg之劑量投予該蝦體。