CN101946812B

CN101946812B - 番石榴叶及其提取物的用途

Info

Publication number: CN101946812B
Application number: CN 201010268343
Authority: CN
Inventors: 郭志勋; 李卓佳; 冯娟; 王瑞旋
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2010-08-30
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2030-08-30
Also published as: CN101946812A

Abstract

本发明公开了番石榴叶及其提取物在制备预防或治疗对虾白斑综合症病毒药物中的应用，本发明采用的番石榴叶资源丰富、成本低、加工方便、较少抗药性和药物残留、毒副作用小，本发明所述的番石榴叶或番石榴叶提取物可以有效的杀灭水中的对虾白斑综合症病毒，以降低该病毒在水中的传播的可能性，达到预防该病毒传播的目的。

Description

番石榴叶及其提取物的用途

技术领域

本发明涉及一种番石榴叶及其提取物在制备用于预防或治疗对虾白斑综合症病毒WSSV药物中的应用，属于水产养殖技术领域。

背景技术

经过近三十年的快速发展，对虾养殖业已成为我国农村经济的重要组成部分，在提高沿海地区农渔民就业和经济收入中发挥了重要的作用。但是，随着规模的不断扩大和环境的恶化，对虾病害问题也日趋严重，给对虾养殖业者带来巨大的经济损失自从1974年Couch报道首例对虾杆状病毒(BP)以来，已发现的对虾疾病病原包括病毒、细菌、真菌、立克次氏体和寄生虫等达40多种，众多疾病当中危害较大的是病毒病和细菌病，而其中危害最严重的是对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)，每年给对虾养殖业造成巨大经济损失，至今仍未得到完全控制，成为目前对虾养殖业可持续发展的主要障碍之一。1995年被国际兽疫局、联合国粮农组织以及亚太地区水产养殖发展网络中心将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。

在传统的防治方法中，主要是利用化学消毒剂对水体进行消毒，以阻断其在水中的传播，但是化学消毒剂在杀灭病毒的同时，对细菌、藻类以及其他生物可能也有杀灭做用，破坏了虾池生态平衡，不利于对虾生存环境的稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供番石榴叶或其提取物在制备用于预防或治疗对虾白斑综合症病毒药物中的应用。番石榴叶提取物资源丰富、成本低、加工方便、较少抗药性和药物残留、毒副作用小，且可有效杀灭水体中的对虾白斑综合症病毒，降低该病毒在水中的传播。

实际上，本发明番石榴叶及其提取物在制备预防或治疗对虾白斑综合症病毒药物中的应用。

本发明所述的番石榴叶提取物可以是番石榴叶水提取物，先将番石榴叶粉碎，然后加水提取后，高压灭菌、离心除渣，得番石榴叶水提取物的原液，实际使用时调整养殖水体中番石榴叶提取物的质量浓度范围是1-100g/吨水。

本发明所述的番石榴叶还可以是番石榴叶原材料，使用时将其粉碎后直接抛洒于养殖水体或者与饲料混合投喂对虾，并调整养殖水体中番石榴叶粉末的质量浓度范围是1-100g/吨水。

本发明的优点是：本发明采用的番石榴叶资源丰富、成本低、加工方便、较少抗药性和药物残留、毒副作用小等特点，本发明制备的番石榴叶或番石榴叶提取物可以有效的杀灭水中的对虾白斑综合症病毒，以降低该病毒在水中的传播的可能性，达到预防该病毒传播的目的。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，以下试剂如无特殊说明均为市售或采用常规手段制备获得。

实施例1 番石榴叶粉末的制备

取番石榴叶10g，按常规方法粉碎、过筛后制得番石榴叶粉末，灭菌后分装即可，使用时直接抛洒入海水养殖水体中并使养殖水体中番石榴叶粉末的浓度为1-100g/吨水即可。

实施例2 番石榴叶水提取物的制备

取番石榴叶药材1g，经粉碎过筛后，加入99mL水浸泡，室温浸泡24小时，然后，121℃高压灭菌20min，5000g离心15min除掉药渣，作为储备液密封4℃保存备用，药物的浓度相当于10mg/mL，使用时直接抛洒入海水养殖水体中并使养殖水体中番石榴叶提取物的浓度为1-100g/吨水即可。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

以下通过试验来验证番石榴叶及其提取物作为抗对虾白斑综合症WSSV的新用途。

一、番石榴叶提取物与其它原料对对虾白斑综合症病毒的影响对比

1.1 试验原料的制备

称取番石榴叶1g加入99ml蒸馏水，室温浸泡24h，然后，121℃高压灭菌20min，5000g离心15min除掉药渣，作为储备液密封4℃保存备用，药物的浓度相当于10mg/mL。

同时采用以下单味原料作为对比，称取丁香、板蓝根、辣蓼、百部、金银花、苍术、黄岑、苦辣皮、白芪、穿心莲等10种超微粉碎的原料各1克，分别加入99ml蒸馏水，室温浸泡24h，然后，121℃高压灭菌20min，5000g离心15min除掉药渣，作为储备液密封4℃保存备用，药物的浓度相当于10mg/mL。

1.2 实验对虾的养殖

实验用虾为凡纳宾对虾Litopenaeus Vannamei，购自海南省陵水黎族自治县某虾场，体重约8克，在海南陵水热带水产研究中心陵水新村试验场内暂养一周，实验前将0.5m³的玻璃缸清洗干净，用0.5％的高锰酸碱溶液浸泡1h消毒，然后冲洗干净。放虾前一天注入海水并连续充气。养殖海水经自然经沉淀后沙滤，保持连续充气，每天上午虹吸粪便，隔天换水，换水量约为1/3-1/2，温度28-32℃，盐度32-33，溶解氧6.6-7.0mg/L，氨氮0.3-0.5mg/L。完全适应后挑选体色健康、大小均匀的凡纳滨对虾进行实验。实验用虾每天分三次投料，08:00，17:00和22:00，投料量为虾重的5％-8％，并根据摄食情况适当调节投喂量。

1.3 WSSV感染病毒液的制备

选取具典型WSSV病症，并经PCR检验为WSSV阳性的凡纳滨对虾，取肌肉组织0.1g，加入1ml沙滤海水，冰浴匀浆，然后，再用海水稀释到1000倍，作为病毒粗提液。

1.4 注射液的制备

12种原料储备液各取1ml，分别加入9ml的病毒粗提液，混匀，0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤除菌，室温放置24h，作为病毒注射液，药物的浓度相当于1mg/mL；另外，取各种原料储备液加入9倍体积的海水，过滤除菌后作为阴性对照注射液；最后，分别把海水、1ml海水加9ml病毒粗提液过滤除菌后作为空白对照和阳性对照注射液。

1.5 人工感染实验

把注射液分别注射对虾，每尾对虾注射50μL，分别养在玻璃钢桶中，每天观察死亡情况。

1.6 WSSV的检测

取0.1g对虾肌肉组织，加入PBS缓冲液(8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，加水定容至1L，用HCl调节溶液PH值至7.4，高温高压灭菌20min备用)1mL，冰浴匀浆，6000rpm离心5min。取上清液50μL加入1μL蛋白酶K(10mg/ml)，煮沸15min，立即放于冰上5min后，8000rpm离心10min。上清液用作PCR检测模板，利用中山大学提供的WSSV检测试剂盒进行检测。

表1 抗对虾白斑综合症病毒原料筛选结果

注：单独药名为阴性对照组；药名后加V为实验组

如上表1所示，人工感染WSSV后的第四天，阳性对照组对虾开始出现死亡，第五、六天为死亡高峰期，到第七天死亡率达到100％，而空白对照没有出现死亡。对于实验的11种药物，阴性对照组都没有出现死亡，苍术、黄岑、白芪、穿心莲组中的对虾死亡速度比阳性对照组快，番石榴组中只有2尾对虾死亡，而其余各组对虾死亡情况与对照组相似。实验结果表明番石榴对WSSV具有杀灭作用。

二、不同浓度番石榴叶提取物对对虾白斑综合症病毒杀毒效果的影响

番石榴叶的制备方法、对虾养殖、WSSV感染病毒液的制备和注射液的制备等参考1.1。

本实验针对具有杀毒作用的原料，包括两个方面的内容：1、保持药物病毒和原料的相对浓度不变，把按照1.4中的方法制备的注射液系列稀释10，100，1000倍后，室温放置24小时，人工感染对虾；2、保持病毒的浓度不变，把番石榴叶提取物稀释10，100，1000倍后，按照1.4中的方法制备注射液，人工感染对虾，观察死亡情况。

表2 WSSV浓度不变时不同浓度番石榴的杀毒效果(单位：mg/mL)

注：单独药名为阴性对照组；药名后加V为实验组。

如上表2所示，当保持病毒浓度不变，只改变药物的浓度时，人工感染WSSV后的第三天，阳性对照组对虾开始出现死亡，第五天死亡率达到100％，而空白对照对虾死亡1尾。10^-4和10^-6mg/mL的阴性对照各死亡一尾对虾，可能是由于应激造成的；只有浓度为10^-3mg/mL的实验组对虾没有出现死亡，而其余各实验组死亡情况同阳性对照组相似(见表2)。以上结果表明，在目前的病毒浓度下，只有当药物浓度达到10^-3mg/mL以上时，才能杀灭病毒。

以下为保持药物病毒和原料的相对浓度不变，把按照1.4中的方法制备的注射液系列分别稀释10和100倍后，其相应浓度分别为10^-4和10^-5mg/mL，室温放置24小时，人工感染对虾，模拟实际养殖水体中病毒和番石榴叶的浓度，结果如下表3所示。

表3 WSSV和番石榴相对浓度不变同时降低时的杀毒效果(药物浓度单位：mg/mL)

注：单独药名为阴性对照组；药名后加V为实验组

如上表3所示，当病毒和药物的相对浓度保持不变，把混合液稀释，无论是空白对照还是阴性对照组的对虾都出现少量死亡，而阳性对照组的对虾死亡速度也较慢，即使人工感染后13天，仍有少量对虾存活，特别是稀释度为阳性对照组存活率达到35.7％。各实验组的对虾也出现少量的死亡，但同各阴性对照组相比几乎没有差异。以上结果可以说明药物对病毒的杀灭效果与病毒和药物的相对浓度相关，在达到能够杀灭病毒的相对浓度时，同时降低在水中的绝对浓度，药物的杀毒效果不受影响。

三、药物处理时间对杀毒效果的影响

药物的制备、对虾养殖、对虾人工感染实验、WSSV感染病毒液的制备和注射液的制备等参考1.1。

下表4中的结果表明，用番石榴提取液处理病毒6h以内对WSSV的感染活性基本没有影响，而当处理时间达到12h以上时，WSSV失活，番石榴叶或其水提取液对对虾白斑综合症病毒粗提液处理12h以上可以杀死该病毒。

表4 药物处理时间对杀毒效果的影响

注：单独药名为阴性对照组；药名后加V为实验组

以上为采用番石榴叶水提取物进行的效果试验，其它如番石榴叶粉末等采用上述公开的试验方法也可达到相同效果和类似结果，此处不再一一列举。

Claims

1.番石榴叶及其提取物在制备用于预防或治疗对虾白斑综合症病毒药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的番石榴叶提取物为其水提取物。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：使用时调整养殖水体中番石榴叶或其提取物的质量浓度范围是1-100g/吨水。