发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题,提供一种可防治多种致病原引起的各种鱼病、疗效确切、能提高鱼体免疫力、促进生长发育、不产生耐药性、无任何毒副作用的用于鱼病防治的复方中药微粉。
本发明还提供一种含有上述复方中药微粉的用于鱼病防治的鱼饲料。
本发明复方中药微粉由下述重量份数的原料经超微粉碎制得,
大青叶9-15、杜仲叶6-9、银杏叶9-12、黄芩3-9.0、苦参4.5-9.0。优选大青叶10、杜仲叶7、银杏叶11、黄芩5、苦参8。
所述组分超微粉碎至300目以上。
本发明鱼病防治的鱼饲料,含有重量百分比为4%-6%的鱼病防治复方中药微粉。大青叶、杜仲叶、银杏叶、黄芩和苦参5味中药药味简约、疗效确切、配合紧凑、相互协同、互为补充,能够对鱼类多种疾病的多个靶点同时发挥作用。
发明方中大青叶为君药,味苦、寒,归心、胃经,有清热解毒、凉血消斑等功效,临床用于温邪入营、高热神昏、发斑发疹、黄疸、热痢、痄腮、喉痹、丹毒、痈肿等,大青叶具有抗炎、抗病毒等药理作用,研究发现,其药理作用并非直接抑菌、杀菌,而在于调动机体内的其他抗感染机能,如调动细胞免疫功能治疗感染,有利于控制过度的炎性反应,提高鱼体对氧自由基的清除能力,减轻鱼体遭受自由基攻击所致损伤。需要特别提出的是,较其地下部分的板蓝 根相比大青叶在抗细菌内毒素方面的活性更强,显示出广泛的体内外抗细菌内毒素活性,能够直接中和、降解细菌内毒素,在电镜下可见细菌内毒素网状结构解聚或碎裂崩解,破坏其正常结构。在水产养殖中,大青叶可用于细菌引起的出血性败血症、肠炎、烂鳃、坚鳞、腐皮病、爆发性出血、疖疮病、烂尾、烂咀、赤皮、打印、脱粘、赤鳍、爆发性败血症、肝炎等的治疗;杜仲叶和银杏叶为臣药,杜仲叶味甘、温,归肝、肾经,有补肝肾、强筋骨、安胎等功效,临床用于肾虚腰痛、筋骨无力、妊娠漏血、胎动不安、高血压等,杜仲叶有抗炎抗病毒、提高免疫功能,杜仲叶粉掺入畜、禽及鱼类饲料内,不仅可以提高畜禽及鱼类免疫力,减少疾病的发生,还可以提高畜、禽及鱼类产品的品质,使其味道更浓,更香,使之具有野味的口感;银杏叶味甘、苦、涩、平,归心、肺经,有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛功效,临床用于肺虚咳喘、冠心病、心绞痛、高脂血症等,银杏叶主要有效成分为黄酮苷和萜类内酯,其中银杏萜内酯类化合物是银杏叶中独有的具有特殊分子结构和显著药理活性的有效成分之一,有抗血小板激活因子的作用,具有效抗自由基、提高鱼体免疫功能的作用;黄芩和苦参为佐药,黄芩味苦、寒,归肺、胆、脾、大肠、小肠经,有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效,临床用于湿温、暑温胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高热烦渴、血热吐衄、痈肿疮毒、胎动不安等,其药理活性作用主要为抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗过敏、清除自由基、保护神经元细胞、抑制醛糖还原酶活性、阻止钙离子通道及细胞凋亡等。黄芩抗菌范围较广,对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌及螺旋体等均有抑制作用,对尖孢镰刀菌和白色念珠菌也有抑制作用,同时黄芩中的黄芩苷对多种病毒也有抑制作用,是可以替代抗生素的中草药,对鱼类的细菌性和病毒性致病源引起的各种疾病均有疗效;苦参味苦、寒,归心、肝、胃、大肠、膀胱经,有清热燥湿、杀虫、利尿等功效,临床用于热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下、阴肿阴痒、湿疹、湿疮、皮肤瘙痒、疥癣麻风等,苦参含有的生物碱和黄酮具有抑菌、抗病毒和免疫调节的作用,苦参及其有效成分氧化苦参碱是一种双向免疫调节剂,即其在低浓度时可刺激淋巴细胞增殖,高浓度时则抑制之,另外,苦参在治疗各类寄生虫上效果显著,容易被鱼体吸收并充分代谢,能够避免和解决治疗鱼类寄生虫时存在的化学耐药性和抗菌药的残留及滥用的问题。
以君药大青叶为主对抗细菌内毒素、抗病毒、抗菌,以臣药杜仲叶和银杏叶为辅抗菌、抗病毒同时提高鱼体免疫力、促进生长发育,加以佐药黄芩和苦参抗菌、抗病毒及杀灭寄生虫。本发明复方中药微粉结合了中医清热解毒法的最新研究进展,独辟蹊径,5种中药互为补充,根据中药整体作用的特点,充分发挥了各种中药多种活性成分、多途径、多靶点作用的综合效应,预防并治疗因细菌、病毒、细菌内毒素、真菌、寄生虫等致病原引发的鱼类出血病、败血症、脓毒症等多种鱼类疾病,增强鱼体抵抗力、促进生长发育。
进一步的,市场上的中草药制剂大部分都是提取物、粉剂或散剂等粗制品,粉剂和散剂这种剂型不仅用量大、颗粒粗,导致中草药中的有效成分不能充分发挥;而中药提取物则存在提取不完全,还会留下大量中药残渣,存在提取用的有机溶剂污染等问题。因此,目前为止常规鱼药生产工艺都存在质量控制不稳定,难以被娇嫩的鱼类消化系统吸收,不能充分发挥其预防、治疗、保健等作用的问题。鉴于此,发明人考虑将原料药进行超微粉碎至300目以上,采用超微粉碎具有以下优点:(1)超微粉碎利用机械或流体动力的途径将3毫米以上物料颗粒粉碎至粒径5~10微米以下,其不以粉碎细度为目的,而是追求细胞的破壁率(一般药材细胞破壁率>95%),中药经过超微粉碎后细胞壁被破坏,有效成分不需要通过细胞壁就释放出来,这样大大提高了中药中有效成分的释放速度和释放量,更容易被鱼体消化吸收及转化,中药疗效大幅提高。(2)超微粉碎在低温中进行有利于保留生物活性成分,提高药效。(3)利用超微粉碎技术可以使复方中药在细胞级混炼,在超微粉碎过程中.通过高强度的冲击力使其中各成分均匀混合.使固态物料达到液相混合及乳化的效果,进一步提高疗效。(4)保证疗效的同时,降低中药使用量,微米中药的用药剂量可以减少到原来药材的1/3-1/5,同时,微米中药由于细度的增加,可方便的与鱼饲料充分混合,改善鱼类服食口感,增加食量,促进生长发育。
有益效果:
(1)本发明复方中药五味药材相互协同、互为补充,兼有抗菌、抗病毒、抗细菌内毒素、抗真菌、抗寄生虫和提高免疫力、促进鱼体生长发育的作用,能够对鱼类多种疾病的多个耙点同时发挥作用,有效预防并治疗由致病菌和/或细菌产物(如细菌内毒素)、寄生虫、病毒等引起的出血病、败血症、脓毒症 等多种疾病,对于多种致病原引起的鱼体复合感染疾病有显著的防治效果。
(2)由于可广泛防治各种致病原引起的多种疾病,因此不需要丰富经验或复杂仪器辩别具体病症及其致病原,对管理者要求不高,直接掺入鱼饲料中,治疗过程简便。
(3)本发明复方中药全部原于天然植物原料,经检测无任何毒副作用、不会在鱼体内残留、无耐药性产生,特别适合鱼类消化吸收,不影响鱼肉口感,适用于各种养殖鱼类疾病的防治。
(4)原料广泛易得、制备工艺简单、可靠、生产成本低,微粉剂型使用剂量较普通制剂少,更适于鱼类消化吸收、能有效促进药物疗效的发挥。
(5)本发明鱼饲料含有鱼病防治的复方中药微粉,口感好、鱼群喜食。
具体实施方式
复方中药微粉实施例1
原料重量比为:大青叶9、杜仲叶8、银杏叶12、黄芩6、苦参4.5,
制备方法:分别将大青叶、杜仲叶、银杏叶、黄芩、苦参按上述重量比用高速粉碎机粉碎成20-40目粗粉,然后用高效混合器混合,再用超微粉碎机粉碎成300-400目超微粉即得本发明复方中药微粉1。
复方中药中药微粉实施例2
原料重量比为:大青叶10、杜仲叶9、银杏叶10、黄芩9、苦参6。
制备方法同实施例1,得本发明复方中药微粉2。
复方中药微粉实施例3
原料重量比为:大青叶15、杜仲叶6、银杏叶9、黄芩3、苦参9。
制备方法同实施例1,得本发明复方中药微粉3。
复方中药微粉实施例4
大青叶10、杜仲叶7、银杏叶11、黄芩5、苦参8。
制备方法同实施例1得本发明复方中药微粉4。
复方中药颗料比较例1
大青叶12 黄芩7
制备方法:将上述成份粉碎成20-40目粗粉。
鱼饲料实施例5
将实施例4的复方中药微粉按总量(复方中药微粉加基础鱼饲料)的2%、4%、6%(重量百分比)分别掺入基础鱼饲料中制成含有复方中药微粉的鱼饲料,投饵量为每50kg鱼每日1kg鱼饲料。基础鱼饲料组成及营养水平见表1。
表1基础鱼饲料组成及营养水平
实验一(抗细菌内毒素感染):
为探讨含有本发明中药微粉的鱼饲料对细菌内毒素致异育银鲫死亡的保护作用,将实施例5分别含有重量百分数为2%、4%、6%复方中药微粉的鱼饲料分别配好备用。细菌内毒素,每支5mg,sigma公司,临用前用0.9%氯化钠溶液溶解并稀释成100μg/mL细菌内毒素溶液,备用。
试验用鱼分组;试验用异育银鲫来自武汉市汤逊湖鱼场,运回后,将其用质量分数为3%的食盐水消毒15min,然后放入室外120×120×150cm的水泥池暂养3周,再移入室内100×60×60cm的玻璃水族箱驯养1周,在水族箱内进行正式试验。暂养期间采用基础鱼饲料饲养,每天投喂2次,换水1次,全天充气增氧。暂养结束后挑选体质健壮、无伤病、体重一致的异育银鲫随机分为6 组,每箱20尾鱼。
饲养7天后开始实验:实验前每条称量体重,实验组A组、B组、C组和D组和F组按100μg/kg体重自胸鳍基部注射细菌内毒素溶液(如异育银鲫体重为250g即注射细菌内毒素溶液0.25mL),E组注射同等剂量0.9%氯化钠溶液。试验组饲料给予A组:含有2%复方中药微粉的鱼饲料、B组:4%复方中药微粉的鱼饲料和C组:6%复方中药微粉的鱼饲料、对照组(D组和E组)饲料仍然为为基础鱼饲料,比较组F组给予含有4%比较例1复方中药颗粒的鱼饲料。
饲养管理:正式试验期间各组按计划投喂相应鱼饲料,每日2次,换水1次。每天饲喂和水质管理同驯养期间。观察并记录异育银鲫活动及死亡情况。结果显示,自胸鳍基部注射细菌内毒素溶液后全部产生反应:呼吸急促、头撞玻璃水族箱壁、快速游动、游动不稳、左右晃动、常常出现翻肚子(停留几秒钟)等异常现象。自注射细菌内毒素溶液后30min左右开始出现死亡。至第5天后没有死亡的异育银鲫活动逐渐恢复正常。E组注射同等剂量0.9%氯化钠溶液,注射后没有发生如何异常反应。各组出现死亡时间和死亡数见表2。从死亡百分率可见,A组、B组、C组和D组和F组均出现死亡而E组没有,可见细菌内毒素可以使异育银鲫致死,A组、B组和C组死亡率均较D组低,可见复方中药微粉对异育银鲫有保护作用,而且B组和C组保护作用明显,F组的死亡率高于B组和C组、略低于A组,可见本发明复方中药微粉对异育银鲫的保护作用有剂量依赖性,含有4%-6%(重量百分数)本发明复方中药微粉的鱼饲料具有优异的治疗效果。
表2含有复方中药微粉的鱼饲料对内毒素致异育银鲫死亡的保护作用(n=20)
实验二(抗HSV-I病毒感染)
为探讨含有复方中药微粉的鱼饲料对HSV-I病毒感染鲤鱼的保护作用,将实施例5分别含有2%、4%、6%复方中药微粉的鱼饲料配好备用。试验用鱼购自武汉汤逊湖养鱼场,为野生鲤鱼,每尾重30g左右。实验分组如下:鲤鱼120尾,随机分为6组,每组20尾,分别饲养于面积4平米,深1米的人工土池中。6组鲤鱼分别给予:A组给予含有2%复方中药微粉的鱼饲料、B组给予含有4%复方中药微粉的鱼饲料、C组给予含有6%复方中药微粉的鱼饲料、D组和E组给予基础鱼饲料,F组给予含有4%比较例1复方中药颗粒的鱼饲料。投饵严格按照如下原则:固定投饵点,每天固定时间投饵二次,试验期间水温在12-25℃之间,白天、晚上均记录水温。
各组按上述饲养方法饲养7天后开始实验,实验组A组、B组、C组和D组和F组每条鲤鱼胸鳍基部注射0.02mL病毒HSV-I株,对照组E组注射同等剂量0.9%氯化钠溶液。注射后,各组继续上述饲养方法饲养,30天内观察发病症状及死亡情况。病毒HSV-I株为标准株,由武汉大学医学院病毒学研究所提供,病毒滴度为100TCID50·0.1mL-1,感染剂量为每只0.02mL。结果见表3。
表3复方中药微粉对HSV-I病毒感染鲤鱼的保护作用(n=20)
表3可见,鲤鱼注射HSV-I病毒株后观察30天内,给予基础鱼饲料的对照组D组全部死亡,比较组F组存活率及存活天数也较低,而实验组(A组、B组、C组),特别是B组和C组存活率和存活天数都显著延长,可见复方中药微粉鱼饲料有明显免疫保护作用。
实验三(对鲤鱼和鲫鱼生长发育的影响)
为探讨含有复方中药微粉的鱼饲料对鲤鱼和鲫鱼生长率的影响,将实施例5分别含有2%、4%、6%复方中药微粉的鱼饲料配好备用。试验用鱼购自武汉汤逊湖养鱼场,为野生鲤鱼和鲫鱼,鲤鱼240尾,每尾重30g左右,鲫鱼240尾,每尾重25g左右。实验分组如下:鲤鱼和鲫鱼各240尾,分别随机分为4组,每组60尾,分别饲养于面积4平米,深1米的人工土池中。4组鲤鱼和鲫鱼分别给予:A组给予含有2%复方中药微粉的鱼饲料、B组给予含有4%复方中药微粉的鱼饲料、C组给予含有6%复方中药微粉的鱼饲料、D组为对照组给予基础鱼饲料。投饵严格按照如下原则:固定投饵点,每天固定时间投饵二次,试验期间水温在12-25℃之间,白天、晚上均记录水温。饲养40天,每组随机捞取30尾鱼称重。计算各组鱼的相对生长率。相对生长率=(末尾均重-初尾均重)/初尾均重*100%。
生长速度:由表1可见,鲤鱼试验组A组、B组、C组平均相对生长率都高于对照组D组,其中B组和C组比A组增重更加明显。鲫鱼试验组与对照组的增重见表3、4,由表3、4可见,结果与鲤鱼试验组相似,鲫鱼试验组A组、B组、C组平均相对生长率都高于对照组D组,其中B组和C组比A组增重更加明显。结果显示,基础鱼饲料中添加2%、4%、6%复方中药微粉后,试验组A、B、C组与对照组D组鲤鱼的生长率分别增加59.7%、77.3%、81.7%和55.5%;鲫鱼的生长率分别增加51.6%、65.7%、60.8%和46.2%,本发明复方中药微粉加入鱼饲料中可以增加鲤鱼和鲫鱼的生长速率。
表4试验组与对照组鲤鱼的生长率
表5试验组与对照组鲫鱼的生长率
实验四(抗柱状嗜纤维菌感染)
为探讨败含有复方中药微粉的鱼饲料对鲤鱼和鲫鱼因柱状嗜纤维菌致死的影响,攻毒试验如下:饲养方法、实验分组及投料同实验三,鲤鱼和鲫鱼饲养40天计算各组鱼的相对生长率后,分别从各试验组A组、B组、C组及对照组D组每组随机捞取鲤鱼和鲫鱼各20尾,每尾经胸鳍基部注射6×108/mL柱状嗜纤维菌菌液0.2mL,继续饲养观察2周,随时记录发病症状及死亡情况。对死亡鱼体进行解剖检查,分离细菌,确认死因,计算存活率。试验结果显示:注射柱状嗜纤维菌菌液后,鲤鱼试验组和对照组的存活率分别为35%(A组)、60%(B组)、65%(C组)和30%(D组),鲫鱼存活率分别为40%(A组),60%(B组),60%(C组)和35%(D组)。可见,本发明复方中药微粉加入基础鱼饲料中可以增加鱼体注射柱状嗜纤维菌活菌后的存活率,对鲤鱼和鲫鱼的生长有显著免疫保护作用。
实验五(抗鱼体车轮虫感染)
为探讨败毒微粉颗粒鱼饲料抗鱼体车轮虫作用,鳜鱼(Siniperca chuatsi Basilewsky)为越冬鱼种,体重35~45g,试验用鳜鱼由武汉汤逊湖养鱼场提供,试验鳜鱼在池塘中已患车轮虫病,病鱼黑瘦,鱼的鳃和嘴周围呈微白色,体表其他正常,鳃部黏液较多,鳃丝镜检可发现大量车轮虫寄生,寄生数量在20~ 30个/尾,虫体较小,直径18~30μm,平均22μm。参照有关文献鉴定该车轮虫为微小车轮虫(Trichodinella ninuta Chen)。160尾患车轮虫病的鳜鱼随机分成4个组,每组40尾,A组为对照组仍然用基础鱼饲料饲养,B组、C组和D组为实验组分别给予实施例5的含有2%、4%和6%复方中药微粉的鱼饲料饲养,使用池塘水水族箱饲养(水体体积为1m3,pH7.0,水温在15~25℃),连续饲养3d后改用基础鱼饲料饲养,观察并且记录鱼体鳃部车轮虫的反应及死亡情况。从给予含有复方中药微粉的鱼饲料后第4d、第7d、第10d后每次各组随机捞取存活鳜鱼10条,按寄生虫学试验方法检查鱼体鳃部的车轮虫存活情况,观察鱼体及鳃部车轮虫的反应,并进行统计分析,计算每条鳜鱼鳃部车轮虫存活数。结果发现,用药后第4h开始,试验组中鱼体鳃部部分车轮虫纤毛颤抖运动开始减弱至停止,直至虫体萎缩死亡。结果见表6
表6鳜鱼鳃部车轮虫存活数及鳜鱼死亡数(
n=40)
表6可见,本发明含有复方中药微粉的鱼饲料有抗鳜鱼鳃部车轮虫作用。患有鳃部车轮虫的鳜鱼给予基础鱼饲料饲养,随饲养时间延长鳃部车轮虫数和死亡率逐步增加,至第10天只有9条鳜鱼可供用于检查鱼体鳃部的车轮虫存活数。给予含有复方中药微粉的鱼饲料3d,可以保护鳜鱼生存,减少鳜鱼鳃部车轮虫数,其作用随含有复方中药微粉的鱼饲料中药量增加而增强,含有4%-6%复方中药微粉的鱼饲料可以完全保护鳜鱼生存,含有2%复方中药微粉的鱼饲料只是 开始有死亡(2例)发生。使用含有复方中药微粉的鱼饲料后,鳜鱼鳃部车轮虫都在不断减少,而且从开始使用含有6%复方中药微粉的鱼饲料(3d)后第10d可以完全杀灭鳜鱼鳃部车轮虫。
实验六(对异育银鲫体成分和生长性能的影响)
为探讨添加复方中药微粉的鱼饲料对异育银鲫体成分和生长性能的影响进行试验,试验期为2009年3月10日至5月25日,共计75d,其中正式试验自4月10至5月15日共45d,试验期间水温为20~25℃。
试验用鱼分组;试验用异育银鲫来自武汉市汤逊湖鱼场,运回后,将其用重量百分数为3%的食盐水消毒15min,然后放入室外120×120×150cm的水泥池暂养3周,再移入室内100×60×60cm的玻璃水族箱驯养1周,在水族箱内进行正式试验。暂养期间采用基础鱼饲料,投饵率约为2.5%,每天投喂2次,换水1次,全天充气增氧。暂养结束后挑选体质健壮、无伤病、体重一致的异育银鲫随机分组,共计3个组,每组4个水族箱,每箱15尾鱼。
饲养管理:正式试验期间日投喂饲料2次,换水1次。对照组(A组)饲料为基础鱼饲料,试验组饲料为实施例5的含有4%复方中药微粉的鱼饲料(B组)和实施例5的含有6%复方中药微粉的鱼饲料(C组)。每天饲喂和水质管理同驯养期间。
饲养45天后测定生长性能,观测指标为增重率和饵料系数,鱼体成分分析中,水分采用直接干燥法测定,蛋白质采用凯氏定氮法测定,脂肪采用索氏抽提法测定,灰分采用高温灼烧法测定。
生长性能测试指标;试验始末称量试验鱼空腹体重,精确至0.1g。生长性能的观测指标为增重率和饵料系数,各指标均以重复为单位计算。计算公式如下:
鱼体成分分析:试验结束以后,每箱随机取3尾鱼,称重,然后除去其内脏,称重。测定鱼体的水分、蛋白质、脂肪和灰分含量。其中水分采用直接干燥法 测定,蛋白质采用凯氏定氮法测定,脂肪采用索氏抽提法测定,灰分采用高温灼烧法(550℃左右)测定。
数据处理:观测数据用SPSS软件进行分析。
结果与分析:添加复方中药微粉的鱼饲料对异育银鲫生长性能的影响见表7。表7添加复方中药微粉的鱼饲料对异育银鲫生长性能的影响(
n=15)
注:△与A组比较P<0.05
由表5可知,B组和C组的增重率和饵料系数与A组有显著差异(P<0.05),增重率比A组分别提高了104%和95%,饵料系数分别降低了32%和30%,B组和C组之间无显著性差异。
添加中药微粉的鱼饲料对异育银鲫体成分的影响见表8。
表8添加中药微粉的鱼饲料对异育银鲫体成分的影响(
n=15)
注:△与A组比较P<0.05,“净重比”指除去内脏后的体重占全鱼重的百分比,蛋白质、脂肪和灰分含量均为湿重的百分比。
由表3可知,添加中药微粉的鱼饲料对异育银鲫的净重比、水分和灰分含量均无显著影响(P>0.05)。但能显著提高鱼体的蛋白质和脂肪含量(P<0.05),B组和C组的蛋白质含量分别比A组分别提高了5.4%和5.3%,脂肪含量分别提高了9.9%和10.5%。