CN102430120B - 增强鱼类疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种增强鱼类疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用方法。其特征是上述的免疫增强剂提取自豆科植物黄芪或其有效成分，包括黄芪皂苷和黄芪多糖，其有效成分可以采用包含黄芪皂苷和黄芪多糖的天然、人工改造或人工合成产物。该佐剂可以提高疫苗成分免疫接种后的特异性免疫保护率，应用中疫苗的成分可以包含有细菌、病毒和寄生虫的灭活病原体、菌蜕成分、弱毒病原体、减毒病原体、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上；使用中可以与疫苗成分混合应用，也可以与疫苗成分不混合应用，还可以与疫苗不同时应用。

Description

增强鱼类疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用

技术领域

本发明涉及鱼类疫苗免疫防治技术，具体是一种可以增强鱼类疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用。

背景技术

鱼类传染性疾病的病原主要包括细菌、病毒或寄生虫，能引起鱼类的急性、亚急性或慢性感染，导致水产养殖生产遭受病害的侵袭，造成严重损失，严重危害养殖业的可持续发展。采用抗生素或化学药物等方法进行预防或治疗，往往带来诸如微生物耐药性、产品药物残留及环境污染等弊端，对感染性疾病进行鱼类疫苗免疫接种可安全高效地腔制疾病发生与流行，是国际上普遍接受的疾病控制技术，对水产养殖产业的健康可持续发展具有重要意义。

针对细菌和病毒性病原的鱼类疫苗在国内外有广泛的研究，许多病原能够通过传统疫苗(包括灭活疫苗、细胞提取物、佐剂疫苗)实现良好的免疫保护，但某些特定病原，例如爱德华氏菌、气单胞菌、鲑鱼肾杆菌、病毒性出血性败血症病毒、神经坏死病毒、鲤春病毒血症病毒等的传统疫苗常达不到好的保护效果。近年来，分子免疫学及基因工程技术的迅猛发展促进新型鱼类疫苗(DNA疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗)不断涌现并显示出良好的前景，但出于研制周期、成本及安全性等因素，因此许多鱼类疫苗离推广应用还有一定的距离。

疫苗佐剂是能提高疫苗特异性免疫保护率的物质，一些无机物、矿物油、表面活性剂、非特异性免疫增强剂都能成为免疫佐剂，但不是所有的非特异性免疫增强剂都具有提高鱼类疫苗的特异性免疫保护率的作用。目前在水产养殖业中有效疫苗免疫佐剂种类较少，其应用效果也不尽一致，为适应当前水产养殖疫苗制剂产业的快速发展及应用要求，新型高效鱼用佐剂开发具有重要意义。

中草药制剂作为新型免疫增强剂因其具有来源广泛，价格低廉，低残留，不宜导致病原菌产生耐药性等优点，近年来在水产养殖业中的应用也日益受到重视。黄芪(Astragalus membranaceus)是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，是种传统名贵中药材，对免疫系统、心血管及内分泌等多系统有着多种药理作用，其主要有效成分包括黄芪皂苷(Astragaloside IV)和黄芪多糖(Astragalus polysacharin)。其中黄芪皂苷又称黄芪甲苷被视为衡量黄芪质量优劣指标，具有改善心肺功能，加强机体免疫功能，抑制病毒繁殖和肿瘤生长的作用，研究证实黄芪提取物具有佐剂作用，可提高抗体效价，但高浓度的黄芪提取物对动物血液中红细胞具有一定的溶血作用。目前，黄芪提取物作为增强鱼类疫苗免疫接种的佐剂在国内外尚没有研究和应用报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强鱼类疫苗免疫接种效果的佐剂，以及这种增强鱼类疫苗免疫接种效果的佐剂的应用，以提高鱼类疫苗成分免疫接种后的特异性和非特异性免疫保护率，克服现有技术的不足。

本发明的免疫佐剂是豆科植物黄芪的根、茎、叶、花、籽、黄芪的提取物或含有有效成分的制品。本发明首先发现了黄芪的主要药用成分，包括黄芪皂苷(Astragaloside IV)和黄芪多糖(Astragaluspolysacharin)，能起到增强鱼类疫苗免疫接种效果，它们就是本发明的免疫佐剂的有效成分。采用包含黄芪皂苷或黄芪多糖的单一组分或混合物都能用于鱼类疫苗佐剂，本发明证实了黄芪主要药用成分具有上述增强鱼类疫苗免疫接种效果的功效，因此本发明的有效成分的功效包含黄芪皂苷和黄芪多糖的天然产物、人工改造产物或人工合成产物。天然的黄芪皂苷和黄芪多糖可提取自蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)、膜荚黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch)bungede)、豆科亚历山大黄芪(Astragalus alexandrines Boiss)、深裂黄芪(Astragalus dissectus)、绵毛黄芪(Astragalus sieversianus Pall)的干燥根或多刺黄芪(Astragalus spinosus Vahl)地上部分提取物等。黄芪多糖也可提取自黄芪的其他部位，如茎、叶、花、种子等，对于不改变黄芪皂苷和黄芪多糖这些有效成分的核心分子结构的人工改造产物或人工合成及仿制的产物可能增强或减弱本发明所涉及的功效，只要这种功效依然保留，就仍然受到本专利的保护。

鱼类疫苗制剂必须包含鱼类病原的抗原或能在鱼体内产生相应的抗原，根据不同疫苗的制备工艺，疫苗的抗原可以包括细菌、病毒和寄生虫的灭活病原体、菌蜕成分、弱毒病原体、减毒病原体、保护性抗原蛋白、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物，这些抗原在鱼类疫苗制剂中可以是单一种或一种以上以联合、整合或多价方式存在。制成的鱼类疫苗制剂除了抗原或能产生抗原的表达载体以外，还可包含其它的佐剂、保护剂、防腐剂、稀释剂、溶剂等多种成分，加之鱼类疫苗可能的多种不同的应用方式，使得本发明的佐剂在疫苗制剂中的用量的可变范围十分宽泛。针对上述问题，本发明认识到决定疫苗的特异性免疫保护作用的关键成分是疫苗的抗原，因此确定了将上述佐剂的有效成分的剂量与抗原的剂量相关联的策略。不同的抗原的免疫能力有差别，例如弱毒疫苗由于能在受免动物体内有限繁殖，其免疫刺激能力通常比灭活疫苗高得多。本发明通过在斑马鱼、大菱鲆等不同大小和不同种类的海水和淡水养殖鱼类中进行的迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌等的灭活疫苗及减毒迟缓爱德华氏菌活疫苗安全性及有效性的临床试验，确定上述佐剂的有效成分与疫苗抗原量的比例在1/10-1000/1范围。

本发明的使用方法包括三种方式：1)可与疫苗抗原混合制成疫苗制剂；或者2)不与疫苗抗原制成单一制剂但同时使用；或者3)与疫苗抗原不同时使用。

对于第1种方式，按有效成分与疫苗抗原重量比为1/10-1000/1的比例将上述佐剂加入到鱼类疫苗注射剂、浸浴剂或口服剂中，制备成含有本发明的佐剂的鱼类疫苗的注射剂、浸浴剂或口服剂的产品，根据鱼类疫苗抗原的免疫要求，按照注射、浸浴或口服的方式对待免疫的鱼体进行免疫接种。

对于第2种方式，根据鱼类疫苗制剂的要求，用鱼类疫苗制剂对健康幼鱼进行注射、浸浴或口服免疫接种时，根据佐剂产品中有效成分的含量和疫苗中抗原的剂量，临时在鱼类疫苗制剂中混入上述佐剂，使佐剂的有效成分与疫苗抗原重量的比例达到1/10-1000/1，然后实施免疫接种。

对于第3种方式，按疫苗制剂的要求对待免疫的鱼体进行注射、浸浴或口服免疫接种，同时在鱼饲料或浸浴水体中加入上述佐剂，使饲料或浸浴水体中的佐剂的有效成分的含量达到1/100000-1/100的浓度，在鱼类疫苗接种前3日至接种后15日的时间范围以内，实施1-5日的投喂或浸浴等免疫增强操作。

所有上述应用方式的目的都是要使佐剂有效成分在疫苗抗原起作用的时间内在鱼体内达到一定的浓度。本发明证实对于不同鱼种有效成分所起功效的最佳剂量差异很大，对疫苗免疫接种的增强作用与有效成分的剂量存在明显的依赖效应。本发明还发现这一浓度的确定与鱼体中佐剂有效成分的安全浓度明显的相关性。对鱼体过度给药导致有效成分在鱼体中浓度过高对鱼有致死作用，有必要针对待免疫鱼种在免疫接种条件下采用佐剂的给药方式测试或查明给药的2-4周内不会导致鱼死亡的最高剂量，以此确定上述佐剂的有效成分的安全剂量。本发明证实有效成分在鱼体中的剂量达到安全剂量的1/100-4/5时能表现出对疫苗免疫接种的增强作用。

本发明的积极效果在于：所涉及佐剂可以提高鱼类疫苗抗原免疫接种后的特异性和非特异性免疫保护率，其中黄芪皂苷与疫苗抗原联合应用能明显提高抗原的特异性免疫保护力，黄芪多糖既能明显提高鱼类的非特异性免疫能力，又能明显提高抗原的特异性免疫保护力。对于爱德华氏菌等类似的存在胞内感染或免疫逃避能力的病原的疫苗，本发明有效成分具有十分明显的免疫保护增强作用。使用方法安全，对环境及操作人员无害，具有良好的应用前景。

具体实施方式

鉴于不同种类的鱼对上述佐剂有效成分在疫苗产品中的浓度存在明显的剂量依赖效应，偏离最佳使用浓度较低或较高的有效成分浓度对免疫效果存在明显影响。显然使用中要保证该佐剂在鱼类疫苗产品、免疫饲料或在给药后鱼体内佐剂有效成分的浓度在安全剂量范围之内，针对具体鱼种、鱼龄和接种方法等通过疫苗保护实验测定出上述有效成分在具体疫苗产品中的最佳使用浓度。在鱼类疫苗制剂中佐剂有效成分的浓度为1mg/g-20mg/g(佐剂有效成分重量/疫苗制剂重量)，鱼类饲料中佐剂有效成分的浓度为0.1g/kg-1g/kg(佐剂有效成分重量/饲料重量)，在给药后鱼体内佐剂有效成分的浓度达到1.0×10-3mg/g-1.0mg/g(佐剂有效成分重量/鱼体重)。应用中所用的鱼类疫苗的成分可以包含有细菌、病毒和寄生虫的灭活病原体、菌蜕成分、弱毒病原体、减毒病原体、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因的表达载体的任何一种或一种以上，这些抗原在鱼类疫苗制剂中可以是单一种或一种以上以联合、整合或多价方式存在，制成的鱼类疫苗制剂除了抗原或能产生抗原的表达载体以外，还可包含其它的佐剂、保护剂、防腐剂、稀释剂、溶剂等多种成分。该佐剂在应用中可以与鱼类疫苗成分混合应用，也可以与疫苗成分不混合应用，还可以与鱼类疫苗不同时应用。疫苗应用于鱼类的免疫接种时可以是注射免疫、浸泡免疫或口服免疫，这种免疫佐剂可用于增强鱼类的疫苗免疫接种。

本发明的的佐剂是黄芪皂苷为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)的干燥根提取物，

使用中与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)灭活疫苗及减毒E.tarda株协同使用。

本发明的使用方法如下：

(1)佐剂安全剂量的确定：制备包含黄芪皂苷或黄芪多糖的混合物或单一组分的0.1％-10％的PBS(pH7.2)溶液，经0.22μm的滤膜过滤等理化方法除菌，用不同浓度的上述佐剂接种待免疫鱼，接种方式可以是注射免疫、浸泡免疫或口服免疫。免疫鱼观察2周，确定该佐剂安全剂量范围。

(3)疫苗制剂制备及使用：灭活疫苗制备中，将病原菌置于1％浓度的福尔马林(36.5-38％甲醛，w/v)中，4℃过夜，用PBS清洗后，制备一定浓度的灭活疫苗。将安全剂量范围内的佐剂与灭活疫苗按一定的剂量混合后对鱼进行免疫接种，再将鱼进行正常养殖管理即可。使用减毒活疫苗时，则无需进行灭活处理，使用方法同上。

(4)疫苗产品中佐剂最佳浓度的确定：待免疫鱼经上述疫苗制剂接种后，30-60天后进行人工感染实验，14-60天后进行相关生理生化指标(如增重率、抗体效价等)和相对保护率(RPS)的分析比较，以确定佐剂的最佳使用浓度。

(5)使用中与疫苗抗原混合制成疫苗制剂，按有效成分与疫苗抗原重量比为1/10-1000/1的比例将上述佐剂加入到鱼类疫苗注射剂或口服剂中，制备成含有本发明的佐剂的鱼类疫苗的注射剂或口服剂的产品，根据鱼类疫苗抗原的免疫要求，按照注射或口服的方式对待免疫的鱼体进行免疫接种。

以下通过实施例对本发明进一步说明。

实施例1：黄芪皂苷对斑马鱼注射安全剂量的确定

1.材料与方法：

(1)试验用鱼及养殖管理：选用健康斑马鱼(0.32±0.08g)，置于分隔的养殖水槽(10L/槽，上海海圣水族设备厂)中，水温为28±1℃。每日灯光照明12h。试验期间按鱼体重3％投喂配合饲料，日投喂2次，试验前暂养2周。斑马鱼注射前用MS222(1∶10000稀释)进行浸泡麻醉处理。

(2)黄芪皂苷对斑马鱼注射安全剂量的确定：分别用浓度为1、2、5、8、10、12、15和20mg/mL的黄芪皂苷腹腔注射20尾斑马鱼，注射剂量为10μL/尾，观察14天。

2.试验结果

各实验组斑马鱼14天中死亡情况见表1，由结果可见确定黄芪皂苷对斑马鱼的最大安全腹腔注射剂量为100μg/尾，即312.5μg/g(黄芪皂苷/鱼体重)。

表1黄芪皂苷对斑马鱼注射安全剂量试验

实施例2：黄芪皂苷添加于福尔马林灭活E.tarda疫苗中，注射免疫接种斑马鱼(Danio rerio)。

1.材料与方法：

(1)试验用鱼及养殖管理：同实施例1。

(2)疫苗制备：将E.tarda接种于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中，28℃振荡培养过夜，再以1∶10转接新鲜TSB中，28℃振荡培养5h，收集菌液，4000g，4℃，10min，无菌PBS(pH7.2)清洗3次，重悬于PBS，并稀释涂布于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，细菌计数采用平板计数法，制成1×10⁹CFU/mL菌悬液，置于浓度为1％福尔马林(36.5-38％，w/v)，4℃过夜，制成灭活疫苗，PBS清洗3次(方法同上)，4℃保存。另取灭活后的菌液0.2mL涂TSA，28℃培养48h，确定无菌落生长。疫苗安全性检测中，取各组疫苗腹腔注射20尾斑马鱼，注射剂量为10μL/尾，观察14天，免疫接种鱼无不良反应，其摄食活动正常，表明所制备的疫苗是安全的，以下同。

2.试验设计

(1)试验分组：对斑马鱼进行随机分组，各组设3个平行组，每平行组50尾。试验设对照组(注射PBS)、黄芪皂苷组、E.tarda灭活疫苗组、不同浓度的黄芪皂苷与E.tarda灭活疫苗配伍组，免疫试验分组见表2。

表2斑马鱼免疫试验分组

(2)免疫方法：腹腔注射，注射剂量为10μL/尾。

(3)免疫后攻毒：免疫30天后，斑马鱼腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜E.tarda菌液(6.16×10³CFU/尾)，进行人工感染试验。

3.试验结果

攻毒后28天统计各试验组的死亡率，并根据公式相对保护率(RPS)＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。计算RPS。结果见表3。

表3黄芪皂苷为迟缓爱德华氏菌灭活疫苗免疫佐剂对斑马鱼的免疫保护效果(平均值±标准差)

试验结果表明，单纯注射E.tarda福尔马林灭活疫苗(10⁶cfu/尾)或62.5μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷对斑马鱼的免疫保护效果较低，其RPS值分别为37.3％和28.6％。灭活疫苗添加31.3、62.5、156.3、250.0和312.5μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷时，可不同程度的提高RPS。其中以灭活疫苗添加156.3μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷可明显提高免疫保护效果，RPS值提高到73.8％。以上结果证明本发明佐剂对淡水鱼具有较好的免疫保护效果。

实施例3：黄芪皂苷对大菱鲆注射安全剂量的确定

1.材料与方法：

(1)试验用鱼及养殖管理：选用健康大菱鲆(11.4±1.8g)，试验前在水泥池中暂养2周后，置于圆形玻璃钢桶(盛水1米³)中，水温为18±2℃，盐度28‰±2‰，24小时连续充气，流水养殖。试验期间按鱼体重3％投喂配合饲料，日投喂3次，每日换水并清污2次。注射前对大菱鲆用MS222(1∶9000)进行浸泡麻醉处理。

(2)黄芪皂苷对大菱鲆注射安全剂量的确定：分别用浓度为2、5、8、10、15和20mg/mL的黄芪皂苷腹腔注射20尾大菱鲆，注射剂量为100μL/尾，观察14天。

2.试验结果

各实验组大菱鲆14天中死亡情况见表4，由结果可见确定黄芪皂苷对大菱鲆的最大安全腹腔注射剂量为800μg/尾，即70.2μg/g(黄芪皂苷/鱼体重)。

表4黄芪皂苷对大菱鲆注射安全剂量试验

实施例4：黄芪皂苷添加于福尔马林灭活E.tarda疫苗中，注射免疫接种大菱鲆(S.maximus)。

1.材料与方法：

(1)试验用鱼及养殖管理：同实施例3。

(2)疫苗制备：参见实施例1。疫苗安全性检测中，取各组疫苗腹腔注射20尾大菱鲆，注射剂量为100μL/尾，观察14天，确定疫苗的安全性。

2.试验设计

(1)试验分组：对健康大菱鲆进行随机分组，各组设3个平行组，每平行组30尾。试验设对照组(注射PBS)、黄芪皂苷组、E.tarda灭活疫苗组、不同浓度的黄芪皂苷与E.tarda灭活疫苗配伍组，免疫试验分组见表5：

表5大菱鲆免疫试验分组

(2)免疫方法：腹腔注射，注射剂量为100μL/尾。

(3)免疫后攻毒：免疫28天后，大菱鲆腹腔注射新鲜E.tarda菌液(1.35×10⁴CFU/尾)，进行人工感染试验。

3.试验结果

攻毒后14天统计各试验组的死亡率，并根据公式RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。计算RPS。结果见表6。

表6黄芪皂苷为爱德华氏菌灭活疫苗免疫佐剂对大菱鲆的免疫保护效果(平均值±标准差)

试验结果表明，单纯注射E.tarda福尔马林灭活疫苗(10⁷cfu/尾)或43.9μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷对大菱鲆的免疫保护效果较低，其RPS值分别为18.5％和12.3％。灭活疫苗添加17.5、43.9和70.2μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷时，可不同程度的提高RPS。其中以灭活疫苗添加43.9μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷可明显提高免疫保护效果，RPS提高到60.6％。以上结果证明本发明佐剂对淡水鱼具有较好的免疫保护效果。

实施例5：黄芪皂苷添加于福尔马林灭活鳗弧菌(V.anguillarum)疫苗中，配合饲料中口服免疫接种大菱鲆(S.maximus)。

1.材料与方法：

(1)试验用鱼及养殖管理：选用健康大菱鲆(7.0±2.7g)，养殖管理同实施例3。

(2)黄芪皂苷对大菱鲆口服安全剂量的确定：将不同浓度的黄芪皂苷添加于粉碎后的大菱鲆配合饲料中，混匀后制成颗粒饲料，连续投喂大菱鲆，每组20尾，观察14天，确定黄芪皂苷对大菱鲆口服安全剂量为20mg/尾，即2857.1μg/g(黄芪皂苷/鱼体重)。

(3)疫苗制备：V.anguillarum接种于50L的含有2216E液体培养基的发酵罐中28℃培养18h，菌液浓度在2.3×10⁹CFU/mL左右，培养液中加入0.05％的甲醛(36.5-38％，w/v)，4℃灭活24h，取0.1mL涂布于2216E固体平板，28℃培养48h，确定无菌落生长。灭活疫苗以4000g，4℃，离心10min，无菌PBS(pH7.2)清洗3次，重悬于PBS，制成1×10¹⁰CFU/mL菌悬液。疫苗安全性检测中，用4×10⁶CFU/尾、4×10⁷CFU/尾和4×10⁸CFU/尾分别腹腔注射10尾大菱鲆，观察14天，确定疫苗的安全性。

2.试验设计

(1)试验分组：对健康大菱鲆进行随机分组，各组设3个平行组，每平行组60尾。试验设对照组(投喂配合饲料)、V.anguillarum灭活疫苗组、不同剂量黄芪皂苷组、不同剂量的黄芪皂苷与V.anguillarum灭活疫苗配伍组，免疫试验分组见表7。

表7大菱鲆免疫试验分组

(2)免疫方法：试验期间用以上各组饲料连续投喂大菱鲆。

(3)免疫后攻毒：免疫30天后，大菱鲆采用10倍LD₅₀剂量的新鲜V.anguillarum进行人工感染试验，感染方式包括腹腔注射(2.58×10⁶CFU/尾)和浸泡(5×10⁷CFU/mL)感染。

3实验结果

攻毒后14天统计各试验组相对保护率，根据公式RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。计算RPS，结果见表8。

表8黄芪皂苷为鳗弧菌灭活疫苗免疫佐剂对大菱鲆的免疫保护效果(平均值±标准差)

试验结果表明，单纯用V.anguillarum灭活疫苗口服免疫对大菱鲆的免疫保护效果较低，其注射攻毒和浸泡攻毒RPS为21.2％和27.5％，单纯在饲料中分别添加714.3、1428.6和2857.1μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷时，其产生的免疫保护效果与灭活疫苗相近。将714.3、1428.6和2857.1μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷与灭活疫苗配伍添加至饲料中，口服免疫大菱鲆可以提高RPS，其中以1428.6μg/g(佐剂剂量/体重)的黄芪皂苷与灭活疫苗配伍时具有较好的免疫保护作用，其注射攻毒和浸泡攻毒的RPS分别达到53.8％和58.8％。该剂量黄芪皂苷也具有相对较好的适口性。以上结果证明本发明佐剂对海水鱼具有较好的免疫保护效果。

实施例6：黄芪皂苷添加于E.tarda的esrB、evpC双基因缺失减毒株中，配合饲料中口服免疫大菱鲆(S.maximus)。

1.材料与方法：

(1)试验用鱼及养殖管理：选用健康大菱鲆(6.2±0.8g)，养殖管理同实施例3。

(2)黄芪皂苷对大菱鲆口服安全剂量的确定：将不同浓度的黄芪皂苷添加于粉碎后的大菱鲆配合饲料中，混匀后制成颗粒饲料连续投喂大菱鲆，每组15尾，观察14天，确定黄芪皂苷对大菱鲆口服安全剂量为10mg/尾，即1612.9μg/g(黄芪皂苷/鱼体重)。

(3)疫苗制备：将E.tarda接种于5mL TSB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，转接2mL菌液至200mLTSB液体培养基中，28℃振荡培养3-5h，接种1000mL菌液至10L发酵罐中，发酵12-14h，收集菌液，4000g，4℃，10min，无菌PBS(pH7.2)清洗3次，重悬于PBS，细菌计数采用比浊法，制成1×10⁸CFU/mL菌悬液。试验饲料制作中将不同剂量灭活菌体、饲料原粉及不同剂量黄芪皂苷充分混匀后，用微型绞肉机制成免疫颗粒饲料，4℃保存。

2.试验设计

(1)试验分组：对健康大菱鲆进行随机分组，各组设3个平行组，每平行组40尾。试验设对照组(投喂配合饲料)、不同浓度的黄芪皂苷组、减毒活疫苗组、不同浓度的黄芪皂苷与减毒活疫苗配伍组，免疫试验分组见表9：

表9大菱鲆口服免疫试验分组

(2)免疫方法：按设计好的各组疫苗进行投喂，各组中减毒活疫苗按终浓度为10⁸CFU/尾进行设计(损失率以30％计)，黄芪皂苷的终浓度见表7，投喂2天，每天2次，以3％体重进行投喂。

(3)免疫后攻毒：免疫后第20天，对大菱鲆浸泡新鲜野生E.tarda菌液(1.88x10⁷CFU/ml)，进行人工感染试验。

3试验结果

攻毒后14天统计各试验组的死亡率，并根据公式RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。计算相对保护率(RPS)。结果见表10。

表10黄芪皂苷为爱德华氏菌减毒疫苗佐剂口服免疫大菱鲆的免疫保护效果(平均值±标准差)

上结果表明，单纯用E.tarda减毒活疫苗口服免疫大菱鲆的RPS为44.0％，单纯在饲料中分别添加806.4μg/g(佐剂剂量/体重)口服大菱鲆的RPS为31.9％。减毒活疫苗中添加403.2、1612.9μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷时，较单纯该剂量的黄芪皂苷具有一定的提高RPS作用，但较减毒活疫苗不具有提高免疫保护效果的作用。减毒活疫苗中添加806.4μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷较单纯该剂量的黄芪皂苷及减毒活疫苗具有提高RPS作用，其RPS提高至60.2％。以上结果证明本发明佐剂对海水鱼具有较好的免疫保护效果。

实施例7：黄芪多糖对大菱鲆注射安全剂量的确定

1.材料与方法：

(1)试验用鱼及养殖管理：同实施例3。

(2)黄芪多糖对大菱鲆注射安全剂量的确定：分别用浓度为2、5、8、10和20mg/mL的黄芪多糖腹腔注射20尾大菱鲆，注射剂量为100μL/尾，观察14天。

2.试验结果

各实验组大菱鲆14天中死亡情况见表11，由结果可见确定黄芪多糖对大菱鲆的最大安全腹腔注射剂量为1000μg/尾，即87.7μg/g(黄芪多糖/鱼体重)。

表11黄芪多糖对大菱鲆注射安全剂量试验

实施例8：黄芪多糖添加于福尔马林灭活E.tarda疫苗中，免疫接种大菱鲆(S.maximus)。

1.材料与方法：

(1)试验用鱼及养殖管理：同实施例3。

(2)疫苗制剂制备：灭活疫苗制备方法同实施例1。疫苗安全性检测中，取各组疫苗腹腔注射20尾大菱鲆，注射剂量为100μL/尾，观察14天，确定疫苗制剂的安全性。

2.试验设计

(1)试验分组：对健康大菱鲆进行随机分组，各组设3个平行组。试验设对照组(注射PBS)、黄芪多糖组、灭活疫苗组、不同浓度的黄芪多糖与灭活疫苗配伍组，免疫试验分组见表12。

表12大菱鲆免疫试验分组

(2)免疫方法：腹腔注射，注射剂量为100μL/尾。

(3)免疫后攻毒：免疫28天后，大菱鲆腹腔注射新鲜E.tarda菌液(1.35×10⁴CFU/尾)，进行人工感染试验。

3.试验结果

攻毒后14天统计各试验组的死亡率，并根据公式RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。计算RPS。结果见表13。

表13黄芪多糖为爱德华氏菌灭活疫苗佐剂注射免疫大菱鲆的免疫保护效果(平均值±标准差)

以上结果表明，单纯用E.tarda福尔马林灭活疫苗注射大菱鲆RPS为18.5％，单纯用43.9μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪多糖注射大菱鲆RPS为70.9％，可明显提高RPS。灭活疫苗添加21.9、43.9和87.7μg/g黄芪多糖时，可不同程度的提高RPS。其中以灭活疫苗添加21.9μg/g(佐剂剂量/体重)的黄芪多糖具有较好的免疫保护效果，RPS提高到78.7％。以上结果证明本发明佐剂对大菱鲆具有较好的免疫保护效果。

实施例9：黄芪皂苷添加于福尔马林灭活鳗弧菌(V.anguillarum)疫苗中，免疫大菱鲆(S.maximus)的应用方式。

选择健康大菱鲆，首先参照实验例2、3中的方法进行黄芪皂苷最佳浸泡大菱鲆剂量及与V.anguillarum灭活疫苗配伍中黄芪皂苷在饲料中的最佳应用剂量的确定。应用中首先采用浸泡免疫，将大菱鲆置于有最佳浸泡剂量黄芪皂苷及终浓度为10⁸CFU/mL灭活疫苗的新鲜海水中，20min后，移入新鲜海水中正常养殖。14-30天后，进行加强免疫1次(加强免疫间隔时间可视鱼体重大小而定，体重较小则时间可缩短，体重较大则时间可适当延长)。投喂含有最佳应用剂量的黄芪皂苷与V.anguillarum灭活疫苗配伍的免疫饲料，免疫饲料中灭活疫苗添加量为0.1g/kg(灭活疫苗重量/饲料重量)，连续投喂5天，再进行正常饲养管理。加强免疫后30-60天，计算试验期间的增重率，另对大菱鲆腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜V.anguillarum菌液，进行人工感染试验。感染后14-30天，统计死亡率，并根据公式RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。计算RPS，对所获数据进行分析，对黄芪皂苷为V.anguillarum灭活疫苗佐剂免疫大菱鲆应用方式进行评估，RPS值超过70％，视为合格。

实施例10：黄芪皂苷添加于E.tarda的esrB、evpC双基因缺失减毒株中，免疫大菱鲆(S.maximus)的应用方式。

选择健康大菱鲆，首先参照实验例2、3中的方法进行黄芪(蒙古黄芪的干燥根)提取物在饲料中最佳应用剂量和E.tarda的esrB、evpC双基因缺失减毒株浸泡大菱鲆最大安全剂量的确定。应用中首先进行浸泡免疫，将大菱浸泡于最大安全剂量减毒E.tarda 10min后，移入新鲜海水中正常养殖。14-30天后，进行加强免疫1次(加强免疫间隔时间可视鱼体重大小而定，体重较小则时间可缩短，体重较大则时间可适当延长)。连续5天投喂含最佳应用剂量黄芪提取物的饲料，再进行正常饲养管理。加强免疫后30-60天，计算试验期间的增重率，另对大菱鲆腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜E.tarda菌液，进行人工感染试验。感染后14-30天统计死亡率，并根据公式RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。计算RPS，对所获数据进行分析，对黄芪提取物为E.tarda减毒活疫苗佐剂免疫大菱鲆应用方式进行评估，RPS值超过70％，视为合格。

Claims (2)

1.黄芪皂苷和/或黄芪多糖在制备增强鱼类疫苗免疫接种效果的佐剂中的应用。

2.权利要求1所述的佐剂在制备鱼类疫苗中的应用，其中，所述的鱼类疫苗的抗原包含细菌、病毒和寄生虫的灭活病原体、菌蜕成分、弱毒病原体、减毒病原体、保护性抗原、抗原亚单位、抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上。