CN107568117B

CN107568117B - 一种鱼类免疫试剂

Info

Publication number: CN107568117B
Application number: CN201710833158.0A
Authority: CN
Inventors: 李其昌; 陈善真; 陈克宏; 刘博奇; 王志花
Original assignee: Guangdong Haid Animal Husbandry And Veterinary Research Institute Co ltd
Current assignee: Guangdong Haid Animal Husbandry And Veterinary Research Institute Co ltd
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2037-09-15
Also published as: CN107568117A

Abstract

本发明公开了一种鱼类免疫方法，包括两步：浸泡免疫：先用鱼体表面处理液清洗鱼体，后用疫苗浸泡液浸泡鱼苗。每1L表面处理液含有0.05‑2mL38‑40wt％的甲醛溶液，0.001‑0.0035g苯扎氯胺，0.04‑0.08g乙醇酸和10‑20mL甘油；每1L疫苗浸泡液含有50‑200mL 0.01‑0.1％的卡波姆，1‑5mL的三乙醇胺，10‑20mL的甘油和1×10⁶‑1×10⁸CFU/mL的疫苗抗原；口服免疫：浸泡免疫后的鱼苗隔12‑48h后饲喂口服疫苗饲料。通过浸泡免疫与口服免疫的配合应用，提高鱼体表皮的通透性，增加鱼体对疫苗抗原的吸收效率，提高免疫效果，相对免疫保护率提高10％以上。

Description

一种鱼类免疫试剂

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，尤其涉及一种鱼类免疫方法。

背景技术

近几十年来，鱼用疫苗的发展相当迅速，在水产养殖中发挥的作用越来越大，疫苗的种类日益增多，分类方式也多种多样。按免疫方式分为注射疫苗、浸泡疫苗和口服疫苗；按疫苗抗原成分类型分为菌体疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗和DNA疫苗等，按照抗原制备方式分为灭活疫苗、减毒疫苗、基因缺失疫苗等。目前鱼用疫苗的接种方法主要有三种：一是注射，二是浸泡，三是口服。注射法虽剂量准确，诱导免疫应答比其它几种方法都强，但注射免疫费时费力，鱼的应激反应也大，对鱼苗和较小的鱼类并不适用；浸泡免疫省时方便，是仅次于注射法的有效给药途径，并且可适用于难以实施注射的鱼苗；口服免疫对鱼体无损伤，操作方便，不受时间、地点、鱼体大小的限制，也是容易实施的免疫途径。

目前国产尚无上市的鱼用浸泡和口服疫苗，已有报道多停留在研发阶段。浸泡免疫在生产中，免疫效果受到多种因素影响，效果不佳；口服疫苗受胃肠道环境(pH太低、各种消化酶以及内容物)影响，疫苗抗原很难到达黏膜诱导位点而引起有效的免疫反应。而国外关于无乳链球菌感染罗非鱼时，先通过粘附作用定植于罗非鱼体表或腔道的粘液，且最主要感染途径为胃肠道的研究报道，为其浸泡和口服疫苗的开发可行性奠定了理论基础。因此改善鱼类疫苗浸泡方式，研制新型口服疫苗的制备及免疫方法，是水产养殖健康、快速发展中亟待解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可方便快捷的应用于鱼苗免疫的新型的浸泡免疫和口服疫苗制备及免疫方法，以及最佳的免疫操作规程，联合应用这两种免疫方法能够显著提高疫苗抗原进入机体的量，从而提高疫苗的免疫效果。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种鱼类免疫方法，包括：

浸泡免疫步骤：先利用鱼体表面处理液清洗鱼苗体表，然后用疫苗浸泡液浸泡免疫鱼苗；

每1L表面处理液中含有0.05-2mL 38-40wt％的甲醛溶液，0.001-0.0035g苯扎氯胺，0.04-0.08g乙醇酸和10-20mL甘油；

每1L疫苗浸泡液中含有50-200mL 0.01-0.1％的卡波姆，1-5mL的三乙醇胺， 10-20mL的甘油和1×10⁶-1×10⁸CFU/mL的疫苗抗原；

口服免疫步骤：浸泡免疫后的鱼苗隔12-48h后饲喂口服疫苗饲料；

每1kg口服疫苗饲料包括40-100g的口服疫苗佐剂，口服疫苗佐剂由以下按重量份计的以下组分组成：3-6份抗胃酸组分、2-5份胃消化酶抑制组分、2-5份促肠道吸收组分和2-6份多糖包裹组分；所述抗胃酸组分用于将疫苗在胃肠道局部的pH值调节为6.5-7.5；所述促肠道吸收组分用于协助运载疫苗扩散到黏膜细胞，包括表面活性剂、油酸类或增稠剂；所述多糖包裹组分为非蛋白类多糖。

进一步地，浸泡免疫步骤中，包括以下三个过程：

1)首次浸泡：利用鱼体表面处理液浸泡鱼苗1-3min；

2)洗涤：转移至清水桶中洗涤1-2min；

3)疫苗浸泡：将洗涤后的鱼苗于含有疫苗浸泡液的疫苗桶中浸泡免疫 20-60min。

进一步地，浸泡免疫步骤中，全程充氧，鱼苗体重与疫苗浸泡液的比例为 30-40kg/250L。

进一步地，口服免疫步骤中，连续饲喂疫苗饲料7天，每天饲喂2次，饲喂量为30-50g/kg.bw。

进一步地，所述抗胃酸组分为碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、磷酸钙、碳酸钙、碳酸镁、氢氧化镁、磷酸镁、氧化镁和带有负电荷的多聚体透明质酸中的一种或两种以上。

进一步地，所述胃消化酶抑制组分为植物源性胃蛋白酶抑制剂、血红蛋白、卵清蛋白、蛋白酶体或EDTA中的一种或两种以上。

进一步地，所述促肠道吸收组分包括皂角苷、水杨酸钠、十二醇硫酸钠、油酸、亚油酸、胆汁盐类、油酸甘油酯、卡波姆、卵磷脂、溶血卵磷脂、山梨糖醇酐和磷脂类中的一种或两种以上。

进一步地，所述多糖包裹组分包括多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、壳聚糖、海藻酸、胶原蛋白、琼脂糖和硫酸纤维中的一种或两种以上。

进一步地，所述疫苗抗原为无乳链球菌、海豚链球菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、爱德华氏菌、点状假单胞菌、荧光假单胞菌、柱状纤维菌、草鱼出血热病毒和锦鲤疱疹病毒中的任意一种或几种；所述疫苗抗原的所处状态为灭活抗原、亚单位抗原或减毒活疫苗抗原中的任意一种或两种以上。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的方法通过鱼体表面处理液与口服免疫佐剂的配合应用，可提高鱼体表皮的通透性，增加鱼体对疫苗的吸收效率，显著提高免疫效果。

2)浸泡加口服免疫联合应用的相对免疫保护率比单独应用浸泡免疫可提高 10％以上。

3)联合免疫操作可在苗种场完成，最大限度的节省了免疫成本且不会增加苗种的养殖周期，从而也节省了养殖成本，免疫后罗非鱼苗养殖发病高峰期的死亡率与普通苗相比可降低10％以上。

附图说明

图1为实施例2的各组的疫苗水平曲线图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

以下具体实施方式中，如未特殊说明，所采用的组分或抗原均可通过市售方法或常规技术手段获得。

一种鱼类免疫方法，包括：

浸泡免疫步骤：先利用鱼体表面处理液清洗浸泡免疫鱼苗体表，然后用浸泡疫苗液浸泡免疫鱼苗；

口服免疫步骤：浸泡免疫的鱼苗隔12-48h后饲喂口服疫苗饲料；

每1kg口服疫苗饲料包括40-100g的口服疫苗佐剂，口服疫苗佐剂由以下按重量份计的以下组分组成：3-6份抗胃酸组分、2-5份胃消化酶抑制组分、2-5份促肠道吸收组分和2-6份多糖包裹组分；

所述抗胃酸组分用于将疫苗在肠道中pH值范围调节为6.5-7.5；所述促肠道吸收组分用于运载疫苗扩散到黏膜细胞，包括表面活性剂、油酸类或增稠剂；所述多糖包裹组分为非蛋白类多糖。

该鱼类免疫方法，通过浸泡与口服相结合的方式，能有效提高鱼体表皮的通透性，增加鱼体对疫苗的吸收效率，显著提高免疫效果。

进一步地，浸泡免疫步骤中，包括以下三个过程：

1)首次浸泡：利用鱼体表面处理液浸泡鱼苗1-3min；

2)洗涤：转移至清水桶中洗涤1-2min；

本发明所述的鱼类免疫方法中，所述抗胃酸组分为Bronsted碱，采用抗胃酸组分的主要作用是在疫苗表面形成一保护氛围，使鱼胃中疫苗所在局部pH值为6.5-7.5，以减少疫苗抗原受胃部消化酶的影响而失活；优选地，所述抗胃酸组分可以选自但不限定于碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、磷酸钙、碳酸钙、碳酸镁、氢氧化镁、磷酸镁、氧化镁和带有负电荷的多聚体透明质酸中的一种或两种以上。

本发明所述的鱼类免疫方法中，所述促肠道吸收组分可促进疫苗抗原在鱼肠道内的吸收和利用，使疫苗抗原在鱼的中后肠部位引起有效的免疫反应；优选地，本发明所述促肠道吸收组分可以选自但不限定于皂角苷、水杨酸钠、十二醇硫酸钠、油酸、亚油酸、胆汁盐类、油酸甘油酯、卡波姆、卵磷脂、溶血卵磷脂、山梨糖醇酐和磷脂类中的一种或两种以上。

本发明所述的鱼类免疫方法中，所述多糖包裹组分包裹疫苗抗原后具有缓释功能，包裹结构在鱼胃部酸性环境中不会被破坏，而在鱼肠道的碱性环境中逐渐释放，利于疫苗抗原的吸收和利用；多糖包裹组分为天然材料，不会在体内产生过敏反应，而且会在体内逐渐降解，利用多糖包裹组分将疫苗包裹于饲料颗粒表面，保证鱼类在摄食的同时摄入疫苗，大大提高了疫苗的利用率，同时也不会影响鱼类对饲料的消化吸收。优选地，所述多糖包裹组分可以选自但不限定于多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、壳聚糖、海藻酸、胶原蛋白、琼脂糖和硫酸纤维中的一种或两种以上。

实施例1

试验采用体重为8-10g的健康罗非鱼苗600尾，随机分为四组，每个组设3 个平行，每个平行50尾鱼。疫苗抗原为罗非鱼无乳链球菌的灭活抗原；

每1L表面处理液中含有1mL 38-40wt％的甲醛溶液，0.002g苯扎氯胺，0.06g 乙醇酸和15mL甘油；

每1L疫苗浸泡液中含有100mL 0.01％的卡波姆，1mL的三乙醇胺，10mL 的甘油和1×10⁶CFU/mL的疫苗抗原，疫苗抗原常规方法制备及灭活；每1kg口服疫苗饲料包括80g的口服疫苗佐剂，口服疫苗佐剂由以下按重量份计的以下组分组成：3份抗胃酸组分；2份胃消化酶抑制组分；2份促肠道吸收组分；2 份多糖包裹组分。抗胃酸组分包含柠檬酸钠1份、无水碳酸钙2份；所述胃消化酶抑制组分包含卵清蛋白1.5份、EDTA 0.5份；所述促肠道吸收组分包含亚油酸1份，卡波姆1份；所述多糖包裹组分为海藻酸1份、多聚赖氨酸1份。

第一组为绝对空白对照组，即采用清水浸泡鱼苗、不加免疫佐剂的空白饲料进行饲喂；

第二组为相对对照组，即采用含有疫苗抗原的清水浸泡鱼苗20min、不加免疫佐剂的空白饲料进行饲喂；

第三组为第一试验组，即采用表面处理液浸泡鱼苗1min，后用含有疫苗抗原而不含浸泡免疫佐剂的清水浸泡鱼苗20min、不加免疫佐剂的空白饲料进行饲喂；

第四组为第二试验组，即采用表面处理液浸泡鱼苗1min，后用含有浸泡免疫佐剂的疫苗液浸泡鱼苗20min，不加口服免疫佐剂的空白饲料进行饲喂；

免疫结束14天后，每组取30尾进行攻毒试验，采用无乳链球菌进行攻毒，攻毒菌浓度为5.1×10⁷CFU/mL，每尾鱼攻毒剂量为100μL，攻毒后观察7天统计每组死亡数量，计算死亡率和相对保护率。

根据公式

计算相对免疫保护率。由下表结果可知，相对对照组的未经表面处理液浸泡的鱼苗抗原吸收很差，相对免疫保护率只有6.90％；第一试验组经表面处理液浸泡而未加浸泡免疫佐剂组的相对免疫保护率为17.24％，第二试验组经过表面处理液浸泡和加浸泡免疫佐剂组的相对免疫保护率可达51.72％，这说明表面处理液和浸泡佐剂的应用可增加鱼体表皮的通透性，促进疫苗抗原进入鱼体，显著提高疫苗的免疫效果。

表1 攻毒保护率结果

实施例2.不同免疫方式的免疫效果对比试验

本实施例是为了比较不同免疫方式下罗非鱼无乳链球菌疫苗的免疫保护效果。

本实施例选用8-10g、检测无罗非鱼无乳链球菌感染的健康罗非鱼苗。试验分为五组，每组3个平行，每个平行50尾鱼。第1组采用表面处理液进行浸泡免疫20-60min后隔天口服空白饲料饲喂7天，第2组采用表面处理液进行浸泡免疫20-60min后隔天采用口服疫苗饲料饲喂7天；第三组为空白对照组，采用清水浸泡后口服空白饲料饲喂7天；第四组为第一对照组，采用清水浸泡口服疫苗饲料饲喂7天；第五组为第二对照组，采用注射方式免疫，注射用疫苗抗原为灭活的无乳链球菌抗原与矿物油佐剂按1:1的比例乳化制备，抗原含量为 1×10⁷CFU/mL，注射剂量为100μL/尾。

疫苗浸泡液和口服疫苗饲料中的疫苗抗原均为无乳链球菌灭活苗，菌体浓度为1×10⁷CFU/mL/g。各组饲喂量为30g/kg.bw.，2次/日，观察记录鱼的死亡情况。

免疫后每隔7天采血一次，每个平行组采2尾鱼，ELISA方法测定鱼体内血清抗体水平。饲喂免疫结束后14天用无乳链球菌攻毒，每组取30尾，攻毒剂量4.8×10⁷CFU/mL，100μL/尾，之后连续观察7天，记录统计试验结果。

根据公式

计算相对免疫保护率，根据ELISA检测结果对比不同免疫方式下的抗体水平。

免疫结束后每组取30尾攻毒，攻毒后观察7天统计死亡数，计算相对保护率，结果见下表。

表2 相对保护率比较

由上表的结果可见，单纯采用疫苗浸泡液进行浸泡免疫的试验组，相对保护率为45.16％，疫苗浸泡液浸泡加口服疫苗免疫联合应用的相对保护率为 66.13％，口服疫苗免疫的相对保护率为20.97％，注射免疫组的相对保护率为 77.42％。由上述对比结果可见，疫苗浸泡液浸泡或口服疫苗免疫单独对鱼苗进行处理时，相对保护率均不是很理想，而两者相结合，相对保护率可达到66％以上，明显高于预期，虽与注射免疫相比稍低，但可以满足水产疫苗临床免疫的效果需求。

各组鱼分别于免疫结束后7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d采血，每个平行采集2尾鱼，每个试验组3个平行共采集6份血清样本，将收集的血清样本通过自建ELISA方法检测血清中无乳链球菌的特定抗体水平，当S/P值大于 0.25时说明有无乳链球菌抗体的存在。每组检测结果取6份样品抗体水平的平均值统计结果。

由图1结果可见，免疫后除空白对照组外其它各组免疫水平均有升高，随着免疫后天数的增加抗体水平呈逐渐递增趋势，至免疫后42d时抗体水平达到最高，到49d时虽稍有下降但仍维持在较高水平。不同免疫方式的抗体水平对比发现，注射免疫组抗体上升水平优于浸泡+口服疫苗组，浸泡免疫组次之，口服免疫组最差，但仍可产生保护性抗体。这说明采用的包裹技术及免疫佐剂可以有效地防止疫苗抗原被降解，帮助疫苗抗原顺利到达鱼肠道部位从而引起有效的免疫反应。

实施例3免疫苗与普通苗在罗非鱼链球菌发病高峰期的死亡率比较

在苗种标粗场按照实施例2第二组方法处理的罗非鱼苗，免疫完成后的鱼苗再分配到不同的优选客户中养殖，常规饲养及管理，在罗非鱼的养殖发病高峰期，即夏季高温期(6-8月)调查收集普通罗非鱼和免疫罗非鱼的发病及死亡情况，对比死亡率有无降低。

以福建地区的调查结果为例，比较免疫苗和普通苗的高温期发病死亡情况，具体结果见下表。

表3 不同罗非鱼苗的发病及死亡情况

由上表结果可见，普通苗的总体发病率为50/107(46.73％),免疫苗的总体发病率为39/148(26.35％)，普通苗的死亡率为21.26％，而免疫苗的死亡率为 9.43％。对比可见免疫苗的整体死亡率显著低于普通苗，且死亡率降低在10％以上。

实施例4不同疫苗饲料利用效率对比试验

本实施例的目的是对比空白饲料与疫苗饲料饲喂后在罗非鱼体内的消化吸收及利用率情况，验证经表面处理液及疫苗浸泡液浸泡免疫后的鱼苗，再投喂疫苗及其佐剂包裹的口服饲料是否会影响饲料在罗非鱼体内的消化吸收。

试验分三组进行，采用体重为10g左右的健康罗非鱼苗，每个组设3个平行，每个平行40尾鱼。第一组为无乳链球菌亚单位疫苗免疫组，即浸泡免疫亚单位疫苗同时口服亚单位疫苗饲料；第二组为对照组，不做任何处理，只饲喂空白饲料；第三组为无乳链球菌灭活疫苗免疫组，即浸泡免疫灭活疫苗后口服饲喂灭活疫苗饲料。

具体地，每1L表面处理液中含有1mL 38-40wt％的甲醛溶液，0.002g苯扎氯胺，0.06g乙醇酸和15mL甘油；无乳链球菌亚单位抗原使用浓度为： 1×10⁸CFU/mL/g，灭活抗原浓度为1×10⁸CFU/mL，常规方法制备及灭活；

第一组采用浸泡与口服结合的免疫方法，先用表面处理液浸泡3min后，清水洗涤1min，再用疫苗浸泡液浸泡免疫30min，次日开始口服免疫，口服饲喂免疫7天，饲喂量为40g/kg.bw.，每天饲喂2次。第二组不做浸泡处理，饲喂空白罗非鱼饲料。第三组采用与第一组相同的免疫方法，不同之处为将无乳链球菌亚单位抗原换为灭活抗原。

三组分别饲喂不同饲料，免疫期内记录罗非鱼的生长情况，如初、末体重，尾数，计算净增重及饲料系数等。饲喂一个免疫期后对各组鱼的各项生长指标进行对比，统计结果见下表。

饲料系数＝饲料消耗量/增重量×100％，根据总投喂量和净增重计算饲料系数，比较三组的生长情况。

表4 罗非鱼疫苗免疫后各项生长指标评估

由上表结果可见，虽然三组之间结果稍有差异，但LSD多重差异性比较分析结果发现，各组之间饲料系数的对比差异不显著(P＞0.05)，说明疫苗饲料与空白饲料在鱼体内的消化利用率差异不显著，即空白饲料外面的疫苗包裹层不会影响饲料的消化吸收。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种鱼类免疫试剂，其特征在于，包括表面处理液、疫苗浸泡液和口服疫苗饲料；每1L表面处理液中含有0.05-2mL 38-40wt％的甲醛溶液，0.001-0.0035g苯扎氯胺，0.04-0.08g乙醇酸和10-20mL甘油；

每1L疫苗浸泡液中含有50-200mL 0.01-0.1％的卡波姆，1-5mL的三乙醇胺，10-20mL的甘油和1×10⁶-1×10⁸CFU/mL的疫苗抗原；

所述抗胃酸组分用于将疫苗在胃肠道局部的pH值调节为6.5-7.5；所述促肠道吸收组分用于协助运载疫苗扩散到黏膜细胞，包括亚油酸和卡波姆；所述多糖包裹组分包括多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、壳聚糖、海藻酸、胶原蛋白、琼脂糖和硫酸纤维中的一种或两种以上。

2.如权利要求1所述的鱼类免疫试剂，其特征在于，所述抗胃酸组分为Bronsted碱。

3.如权利要求1所述的鱼类免疫试剂，其特征在于，所述抗胃酸组分为碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、磷酸钙、碳酸钙、碳酸镁、氢氧化镁、磷酸镁、氧化镁和带有负电荷的多聚体透明质酸中的一种或两种以上。

4.如权利要求1所述的鱼类免疫试剂，其特征在于，所述胃消化酶抑制组分为植物源性胃蛋白酶抑制剂、血红蛋白、卵清蛋白、蛋白酶体或EDTA中的一种或两种以上。

5.如权利要求1所述的鱼类免疫试剂，其特征在于，所述促肠道吸收组分包括皂角苷、水杨酸钠、十二醇硫酸钠、油酸、亚油酸、胆汁盐类、油酸甘油酯、卡波姆、卵磷脂、溶血卵磷脂、山梨糖醇酐和磷脂类中的一种或两种以上。

6.如权利要求1所述的鱼类免疫试剂，其特征在于，所述疫苗抗原为无乳链球菌、海豚链球菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、爱德华氏菌、点状假单胞菌、荧光假单胞菌、柱状纤维菌、草鱼出血热病毒和锦鲤疱疹病毒中的任意一种或几种；所述疫苗抗原的所处状态为灭活抗原、亚单位抗原或减毒活疫苗抗原中的任意一种或两种以上。