JPH05504331A

JPH05504331A - 交差防護サルモネラワクチン類

Info

Publication number: JPH05504331A
Application number: JP2515888A
Authority: JP
Inventors: カーティス，ロイ，ザ　サード; マンソン，メアリーアン
Original assignee: ワシントンユニバーシティ
Priority date: 1989-11-03
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 1993-07-08
Also published as: ATE167061T1; DE69032408D1; WO1991006317A1; DE69032408T2; EP0500699A1; CA2072633A1; EP0500699B1; AU6737190A; EP0500699A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】差　８サルモネラワクチン箆１シ辷旺本発明は、グラム陰性菌による感染症から防護するために個体を免疫化する物質および方法に関し、更に詳しくは、非病原性のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）細菌を含有し、相同および非相同のサルモネラ種に免疫性を誘発できるだけでなく、他のグラム陰性腸内細菌に交差防護免疫性を誘発することができるワクチン組成物に関する。

に　する　献Ａｒｎｏｖ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　１１８巻、５３１頁、１９３７年；ＣｈａｒｔおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１３１巻。

１５０３頁、１９８５年；ＣｕｒｔｉｓｓおよびＫｅｌｌｙ、Ｉｎｆｅｃｔ、１ｍｍ、、　５５巻、　３３０５頁、　１９８７年；Ｅｒｎ５ｔら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｌ、、　１３５頁５９２８頁、　１９７１１年；Ｆｉｎｌａｙら、　５ｃｉｅｎｃｅ、２４３巻、１０５９頁、１９８９年；Ｇａ１ａｎおよびＣｕｒｔｉｓｓ　ｍ、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ。

８６巻、　６３８３頁、　１９８９年；Ｇａ１ａｎおよびＣｕｒｔｉｓｓ　ｍ　、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ、　６巻、４３３頁、１９８９年；ＧｅｒｍａｎｉｅｒおよびＦｕｒｅｒ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、４巻、６６３頁。

１９７１　；ＧｕｌｉｇおよびＣｕｒｔｉｓｓ　ｍ、１ｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、　５５巻、　２＋１９１頁。

１９８７年；Ｌｉｅｆｓｏｎ、　Ａ＋、Ｊ、　Ｈｙｇ、、　２４巻、４２３頁、１９３６年；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、１１６巻、５０５４頁。

１９８９年；Ｍｕｌ　ｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５５巻、３３５頁。

１９８７年；ＴａｎｏｍｏｔｏおよびＨｏｍｍａ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９１巻、７４１頁、１９ｇ２年Ｔｓａ　ｉおよびＦｒａｓｃｈ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１９巻、１１５頁、　１９８３年。

尺１ソ虹基０抗原及びＨ抗原によって定義される５つの主要な抗原群およびさらに多数の抗原群と結合するＳａｌｍｏｎｅｌｌａには１８００以上の血清型がある。それにもかかわらずＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属には３つの種、すなわちＳ、ｕ刃■、Ｓ、ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、　Ｓ、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓだけが存在し、これらの中で最後の種が非常に多数の血清型をもっていると考えられている。Σ、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ血清型（本願では種として列挙しである）のほとんどは、宿主特異性力（比較的低いので、ヒトを含むさまざまの動物種にて感染することができる。ヒトのＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ感染症は、非常（こ若０個体、高年齢の個体及び免疫不全の個体が顕著にかかり、（よとんどの症例では、汚染した家禽類の食品が原因で起こる。Ｉ［Ｏ５ｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　Ｐｒｏｇｒａ＋ｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ＩｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎｓのＳａｌ＋＊ｏｎｅｌｌａ症に関する専Ｆ’５家委員会は、ヒトのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ症は、食品が起こす疾患の全報告症例の６０〜８０％に相当するという世界的な問題であると１９８７年に結論したことは注目すべきである。現在家禽類から単離され、ヒトの疾患に関連する７種の最も広（流行している７種のＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａの種は、Ｓ、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、　Ｓ江公」ｌ工」、互、■皿蛙ニュ、ジ、　１ｎｆａｎｔｉｓ、Σ、■工巳、Σ、■皿江旦旦および盈、肛皿ｔｅｖｉｄｅｏである。これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種の大部分は、ヒトに胃腸炎を起こし、執ように下痢が続くことがある。しかし、米国では、これらのＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ＠染症の１％以下が報告され正確に診断されているに過ぎないと推定されている。

はとんどのＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、解体作業中に屠体が糞便によって汚染することによる食物連鎖で伝播される。

この問題の重要性を調査するために行った研究で、家禽の屠体の１〜５０％が汚染されていることが判明した。ごく最近の事件は、卵を通じて直接消貧者に蚤、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓが伝播したことに関するものであるが、おそら（、その理由は、Σ１担１ｒｉｔｉｄｉｓのいくつかの菌株は、卵を生む雌ニワトリの卵巣に永続的に感染できるからである。このことは、米国の北東部と大西洋岸中部の諸州でますます流行し、多数の感染症をもたらしていいるのみならず、いく人かの死者がでている。それ故に、家畜の永続的な感染と肉や卵の汚染によるヒトへのｎ１＋ＩＩｏｎｅｌｌａの伝播が重大な公衆衛生の問題になっていることは明らかである。さらに面倒な問題は、ヒトの症例の２０〜２５％の原因を占めている薬剤耐性のＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａの単離が増大していることである。動物試料中の抗生物質の補助治療的な量が、最終的に、ヒトに感染する耐性菌を選び出し、そのことが公衆衛生問題を悪化させていると考えられる。

気嚢症、肺炎および敗血症を起こす家禽の呼吸器官のＥ、　ｅ。

旦惑染症は、家禽産業に大きな損失をもたらしている。旦、姐旦が誘導した家畜の全てのコリ敗血症の大部分は３つのＯ抗原：０１．０２および０７８の内の１つを有するＥ、ｃｏｌｉ菌株によって起こされる。

フリ敗血症は、糞便で汚染した粉じんを吸い込むことによって起こると考えられる。巳、ニが呼吸器官内に沈積し疾病を起こす正確な位置は知られていない。鳥の呼吸器官に定着菌株が発現する毒性特性に非常に似ている一組の毒性特性をもっている。従って、コリシンＶ（ＣＯＩＶ）プラスミドが、ニワトリ中でコリ敗血症を起こす菌株およびヒトに髄膜炎を起こす菌株に大きな比率で存在することが見いだされた。Ｃｏｌ　ＶプラスミドをＥ−、Ｃｏ±−に対して転移させて、マウスに腹腔内注射しおよびヒヨコに静脈注射すると、そのＬＤ５０が減少し、Ｃａ１Ｖプラスミドを病原菌から除去すると、その毒性が減少する。

フリ７ン■の合成は死亡率の上昇には関連がなかった。このＣｏｌ　Ｖプラスミドの存在と死亡率との相関関係は、Ｃｏｌ　Ｖプラスミドの特性決定を一層急がせた。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　２４■１菰上堕、Ｂに感染した患者の糞便から単離した菌株のｊ、、ｃｏｌｉ　Ｋ９４中に存在するプラスミドであるＣａｌ　Ｖ　ｌ−に９４は、補体の末端コンプレックスの作用をブロックするが、該フンプレックスの生成はブロックしない遺伝子ｉＳＳを含宵していることが見いだされた。

毒性に役割を演じると考えられている効率的な鉄キレート化系であるエアロバクチン遺伝子の存在と発現とが、ニワトリの病原性旦、刈旦菌株の、毒性ならびに敗血症、腎孟腎炎および下部尿路の感染症からのヒトの臨床上の単離物と高い相関関係を有することを示した。上記のエアロバクチン遺伝子は、ニワトリとヒトの病原性単離物の両者のＣｏｌ　Ｖプラスミドに存在していることが分かった。

ヒトの腸外旦、阻ユ単離物の毒性に役割を演じることが分かった別のものは、莢膜抗原Ｘ１である。新生の髄膜炎を起こす旦、−の約８０％はに１を発現し、尿路感染症を起こす旦、姐且のかなりの比率がやはりｘｌをもっている。このに１抗原は、細胞が補体を活性化するのを阻害すると考えられる。ニワトリの菌株中における毒性因子としてのに１の役割は研究されていないが、コリ敗血症を起こす菌株のかなりの比率が０１：に１と０２：に１である。０７８ｍ株で見いだされたに８（ｌきょう膜は、ｋｌに類似の毒性促進竹性をもっているのかもしれない。

腺毛（ｐｉｌｉ）が、旦６匹且の宿主組織に対する粘着性と、続いて生成する病因に重要な役割を演じることが分かった。このことは、精製された綿毛で構成されたワクチンは、ヒヨコをその後の攻撃から防護ｌ、得る点で、フリ敗血症を起こす旦１匹■については真実のようである。家禽にコリ敗血症を起こし、ヒトに腸性感染症を起こす３．　ｃｏｌ　ｉ菌株間で類似の毒性因子に加えて、これらの疾病に関連する血清型には、オーバーラツプがある。さきに述べたように、ニワトリのコリ敗血症は、０血清型の菌株である０１．０２および０７８によって通常起こる。

ｋ１抗原は通常０１と０２の菌株と関連しているので、０１　：に１と０２：に１の血清型はニワトリのコリ敗血症の大きな比率を占めている。またこれらの血清型は、新生の髄膜炎と尿路感染症のようなヒトの疾患と関連がある。新生の髄膜炎・尿路感染症およびニワトリのコリ敗血症から単離した０２：に１！１１株のクローン分析の結果は、これらの菌株は外膜のタンパク質のプロフィルと、酵素の電気泳動移動度の点から非常に類似してることを示す。さらにこれらの菌株は、尿路感染症、敗血症および新生髄膜炎から単離された０１：に１と密接に関連している。

それ故に、家禽産業にとって不経済な結果をもたらすコリ敗血症が原因の大きな疾病率と死亡率に加えて、ヒトに腸性感染症を起こし得るＥ、ｅｏｌｉ菌株が、食物連鎖を通じて伝播する際の貯蔵所を、家禽類が形成する可能性があることは明らかである。もしそうであれば、家禽類のこれらの感染を防止すればこの推定上の（まだ証明されていない）ヒトの公衆衛生上の問題は解消するであろう。

Ｓａｌ＋ａｏｎｅｌｌａによる感染と定着は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａで汚染した物質を経口摂取した結果である。繰り返し０側鎖を有する野生盟すポ多ｍ　（ＬＰＳ）は、初期定着に対しては必須のもののようである。その理由は、０側鎖もしくはコアの一部を欠いているラフ型の菌株（ｒｏｕｇｈ　５ｔｒａｉｎｓ）は、腸壁を覆うムチンおよびグリコ力リノクスを通過できず、腸管を通じて通過する。腺毛、ペン毛および各種のマンノース耐性の付着因子によって、隔壁をライニングしている細胞に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを接着させることは全く可能であるが、変異によってこれらのどれか１つがなくても疾病の腸内定着と発病には影響がないようである。

Ｓゴム」ｌ１Ｕの細胞の腸粘膜への侵入は、４種の遺伝子の活性に依存し、その中の３種はオペロンを構成し、侵入の機構を特定する。互、−助Ｄｌ二岨１ｎｖ −変異体は、培養中の細胞に侵入する性能は１００倍減少しているが、経口経路で感染した場合、野生型菌株よりも、腸粘膜の細胞への侵入は少なくしかもＬＤ５０は６０倍から１００倍も高い。肋ヱ遺伝子は他の経路による感染には必要でない。なぜなら、野生型とＩｎＶ−変異体のＬＤ５０は腹腔的接種については同じであるからである。Σ、江ゴム肛」は最初に、消化管に関連するリンパ系組織（ＧＡＬＴまたはバイアー斑）に結合し、侵入し滞留し、次いで腸間膜のリンパ節、肝臓および膵臓のようなより深部の組織に到達する。これら深部の組織への有効な定着は、ある種の侵入性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａの種の中の毒性プラスミドの存在と、染色体遺伝子の数によって決まる。血清型の、Ｓ、、　江助」田１ｕ、　Ｓ、、　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、　Ｓ−、ｄｕ−１Ｓ、ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、　Ｓ、ＬＬＬ２工ｎａｒｕｍおよび互、肝よ送Ｌ１だけが、感染が経口経路で開始される場合に、毒性を支配する毒性プラスミドを与えられることが多い。この毒性を欠いている菌株はやはり腸管に定着できるが、肝臓と膵臓に到着および／または定着しにくいということかい（つもの研究でわかっている。特に９８ｋＤａのプラスミドがコードするタンパク質は、大いに、Ｓ、止肋」１１已におけるこの表現型に応答し得る。この２８ｋＤａのプラスミドがフードするタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、上記のすべて侵入性Ｓａ１ｍｏｎｅｌ　ｌａの種由来の毒性プラスミド中の同じ配列とハイブリダイズする。それ故に、その２８ｋＤａのタンパク質がこれらの全ての侵入性の種において同じ役割を演じ得る。

インビボでのＬＰＳの連続的な産生も、５ａｌａ＋ｏｎｅｌ　Ｉｇの侵入性疾患を起こす性質に必須である。その理由は、ＬＰＳがないと、Σａ１ｍｏｎｅｌｌａが非特異的な宿主の自衛機構の作用を受け易くなるからである。他の遺伝子の全般的な調節に関与しているいくつかの遺伝子が、Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａが効率良く厚い組織に定着して疾病を起こすのに必要である。従って、ＣｕｒｔｉｓｓおよびＫｅｌｌｙは、アデニル酸シクラーゼとそのサイクリックＡＭＰのレセプターを合成できないＳ、江皿ｊ且■匹菌株は、無毒性でかつ免疫原性であることを例証した。ごく最近に、肱旺遺伝子（この遺伝子はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ［！１をマクロファージ中で生存させる遺伝子を調節する）に変異を宵するΣすａコニＬ」菌株が全く無毒性であるだけでなく、免疫原性であることが分かった。

日！灸に変異を有する菌株（Ｍｉｌｌｅｒらの１９８９の文献）は日立已における変異と同じ表現型をもっている。肋立二もしくは助旦灸に変異を有する菌株は以後、総合して出工変異体という。

コ１７杆ｍ症を起こすことができる影ｃｏｌｉ菌株に関連する公知の属性は上記のとおりである。しかし気嚢症を起こすこれらの旦、競旦は、敗血症がないときに心膜炎が起こることがあるので、５ａｌｎ＋ｏｎｅｌｌａと同様におそらく気嚢および／または肺の膜を通過して侵入する機構をもっていることは明らかである。外膜タンパク質は、気嚢および肺が５ａｌｎ＋ｏｎｅｌｌａｌｌおよびＹｅｒｓｉｎｉａに侵入されている時、この侵入に関与しているようである。上記のように、肺血症を起こす旦、ｅｏｌ　ｉｎ１株に必須の特性は、鉄の封鎖に非常に有効な手段である。血清中に見られる約１０−”Ｍという鉄の低い７１１度は、細菌が増殖するのに必要な濃度よりはるかに低い。鉄が欠乏すると、低分子量の鉄キレータ−と外膜タンパク質の合成によって細胞の代謝に変化を誘発することが分かった。これらの外膜タンパク質は、第二鉄ヘモジブリン貧食細胞複合体に対するレセプターであり、区、−の高親和性鉄獲得系の一部を形成する。この点については、これらの鉄で調節される外膜タンパク質（ＯＭＰ）の一つに対する抗体は、コリ杆ｍ症から七面鳥を保護し得ることができることに注目するべきである。また、旦、姐旦の第二鉄エンテロケリン（ｅｎｔｅｒｏｃｈｅｌ　ｉｎ）レセプターに対する血清がエンテロケリンレセブターと交差反応し、いくつかの高分子量のタンパク質が、鉄に侵騙された’＝−比昼細胞によって生成されたことに注目しなければならない。

マウスとヒト（及びおそらくは他のを推動物）には、共通の粘膜免疫網が存在し、抗原がＧＡＬＴに与えられると、体内のすべての分泌組織と分泌腺に対する免疫委任Ｂ細胞の増殖と放散とが開始され、分泌１ｇＡ（ｓｌｇＡ）が最終的に産生される。粘膜面上に定着および／または粘着面上を通過する病原体の特異的表面抗原に対するｓｌｇＡは、それらの定着と侵入をブロックする作用がある。抗原特異的ｓ１ｇＡが腸管上皮上の食細胞と膜特性によって仲介される抗体依存細胞毒性を促進するかもしれないということを明かに示唆している。分泌免疫応答は、侵入性病原体による感染を完全にブロックするのに不十分であるが、疾病を起こすのに必要な微生物の量を増加させない。

その結果、その誘発によって、Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａのような病原体の感染の可能性と接触伝染の拡がりが減少するはずである。

足、■公おりユ匹の無毒性変異体で、毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａの感染にその結果、これらの無毒性変異体の多くがＧＡＬＴに結合し、侵入して滞留する能力を保持していることが分かった。ＣｙａとＣｒｐの遺伝子それぞれの中の欠失（δ ）変異体のために、アデニル酸シクラーゼを合成することができずサイクリックＡＭＰレセプターのタンパク質を欠いている５ａｌｎ＋ｏｎｅｌｌａｌ！変異体は、マウスの経口免疫化に用いた場合、完全に無毒性で、高度に免疫原性であるということが報告されている。δ−工とδ−二のΣ、■助］！二岨菌株はブタとヒツジには無毒性で、δ−シ１とδ−二のΣ、　ｃｈｏｅｒａｅｓｕｉｓは、マウスに対して無毒性でかつ免疫原性であることも明らかにされている。

主、ｕ肋］！１巳で免疫されたマウスは、免疫化後１ケ月程度の間に、非相同の細菌菌株を投与すると非特異的な耐性を示すことが多（、その免疫化後、免疫性は、Σ江ロオ巨旺■または同じグループの抗原を有する他の種に対して特異的になる。

応答の非特異的相において、ＬＰＳは活性化されたマクロファージの産生を刺激する原因であるようであるが、ＬＰＳの毒性に対しては少なくとも非感受性であるヒヨコの場合には当てはまらないかもしれない。Ｔ非依存０抗原決定基に対する免疫応答は、個々のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ菌群に対して比較的特異的であるが、異なる０抗原グループ中の表面タンパク質に関連し、すなわちすべてのＳａｌｍｏｎｅｌｌａに共通の脂質Ａ−ＬＰ　Ｓファ抗原に対するより免疫的な交差反応性が存在するようである。この点において、共有されている表面タンパク質抗原とＬＰＳコアエピトープの存在によって起こる非相同Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａにより、交差防護的な粘膜と体液との免疫性が誘発される可能性があることについてはほとんど注意が払われていない。

ニットＩＪの免疫系の特性を決定する多くの研究が、１０年以上前に報告された。ヒヨコはＧＡＬＴとＢＡＬＴおよびハルダー腺をもっており、このハルダー腺は眼球に対して下方後部に位置し、抗体分泌細胞を含有し、そして上部気道に対しては分泌抗体を産生ずるのに重要な役割を果たしている。このハルダー腺の抗体分泌細胞が、ＧＡＬＴもしくはＢＡＬＴの抗原刺激によって生じるのか、またはハルダー腺自体の抗原刺激によって生じるのかは知られていない。トリに共通の粘膜免疫系が存在していることについての情報が一般に不足している。

良豆ユ２玉本発明は、個体を免疫化して交差防護免疫性を誘発して、相同および非相同のＳａｌｍ。ｎｅｌｌａ血清型および他のグラム陰性腸細菌による感染と定着とを減少させるために用いられる無毒性サルモ不う生ワクチンを提供する。

従って本発明の１面は、相同および非相同のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ血清型および他のグラム陰性腸細菌に対して免疫性を誘発できる生きた無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａで構成された、グラム陰性菌による感染症の個体を治療するために用いるワクチンであって、前記無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａが他の遺伝子を全般的に調節する遺伝子中に少なくとも一つの変異を有し、また可逆的にラフ型の表現型をもたらすリボ多糖の合成時の酵素をコードする遺伝子中に変異を有し、前記の生細胞の量が、グラム陰性腸細菌による感染に対する個体の耐性を改善するのに十分な量であり、該Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ細胞が薬学的に受容可能なキャリアーに存在するワクチンである。

本発明の他の面は、相同および非相同のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ血清豐および他のプラム陰性腸細菌に対して免疫性を誘発できる生きた無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａからなる、グラム陰性菌による感染症の個体を治療するために用いるワクチンであって、前記無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａが他の遺伝子を全般的に調節する遺伝子中に少なくとも一つの変異を有し、また鉄で調節される外膜タンパク質（ＯＭＰ）の合成を調節する遺伝子中に変異を宵し、その結果その変異が鉄で調節されるＯＭＰの構成性発現をもたらし、前記の生細胞の量が、グラム陰性腸細菌の感染に対する個体の耐性を改善するのに十分な量であり、該５ａｌＩＩｌｏｎｅｌｌａ細胞が薬学的に受容可能なキャリアーに存在しているワクチンである。

本発明のさらに他の面は、上記ワクチンの一つを、グラム陰性腸細菌による感染に対する個体の耐性を改善するために十分な量で、前記個体に投与することからなる、グラム陰性園による感染症に対して個体を免疫化する方法である。

また、本発明のさらに別の面は、相同および非相同のｎ」ｏｎｅｌｌａ血清型および他のグラム陰性腸細菌に対して免疫性を誘発し得る、単離された無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌ　ｌａ菌株であって、その菌株が、他の遺伝子を全般的に調節する遺伝子中に少なくとも１つの変異を有し、また可逆的にラフ型表現型が得られるリボ多糖の合成時に酵素をコードする遺伝子に変異を有するＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ菌株である。

この発明のさらに他の面は、相同もしくは非相同のＳａ１ｍｏｎ白の血清型および他のグラム陰性腸細菌に免疫性を誘発し得る、単離された無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｌｌ株であって、その菌株は、全般的に池の遺伝子を調節する遺伝子に少なくとも一つの変異を有し、およびまた鉄で調節される外膜タンパク質（ＯＭＰ）の合成を調節する遺伝子中に変異を有し、その結果、その変異が鉄で調節されるＯＭＰの構成性発現をもたらす、単離された無毒性Ｓａ　１ｍｏｎｅ　ｌ　ｌａｍ株である。

Ａｍ−恋！！呈五里図１はΣ江貼工阻■■のリボ多糖（ＬＰＳ）の構造を示す概略図である。

図２は、生存可能なＣｈｉ３３０６細胞で免疫化したラット由来の血清でプローブした全細菌抽出物のウェスターンイムノプロットの写真複写物である。この細菌抽出物は、Ｅ、ｃｏｌｉとＳａｌｍｏｎｅｌｌａｌｌとの各種の菌株由来のものである。

図３は、生存可能なＣｈｉ３９８５細胞で免疫化されたトリ、および免疫化されていない対、唄のトリから得た血清でプローブした全細胞抽出物のウェスターンイムノプロットの写真複写物である。上記抽出物は、旦、ｃｏｌｉ　Ｃｈｉ　７１２２およびΣ、公１１ｊ旦口。

ｕｍ　Ｃｈｉ　３９８５の抽出物であり、両菌株とともにブロス中で増殖させた。

図４は、ブロス中で増殖させた旦、刈且菌株Ｃｈｉ　７１２２で免疫化したウサギから得た血清でプローブした全細菌抽出物のウェスターンイムノプロットの写真複写物である。細菌抽出物は、高濃度および低濃度の鉄の存在下で増殖させたＳ、江匝」ｕｒｉｕｍおよびＥ、ｃｏｌｉの抽出物である。

図５は、旦、≦菌株Ｃｈｉ　７１２２の外膜タンパク賀製剤で免疫化したウサギから得た血清でプローブした全細菌抽出物のウェスターンイムノプロットの写真複写物である。細菌抽出物は、低濃度と高濃度の鉄の存在下で増殖させたΣ、ユ吐ｎ肛ｎ色の野生型とヱ変異体の抽出物である。

水ａを　るＡ、Ｌ致「組み換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」などの微生物を意味する泪語は交換可能に用いられ、組み換えベクターまたは他の転移されるＤＮＡの受容体として使用可能あるいは使用されている細胞を意味し、移入された元の細胞の子孫も含まれる。単一の親細胞の子孫は、偶然もしくは故意の変異のために、ゲノムもしくは全ＤＮＡの補体が元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいと考えられる。親に十分類似し、関連する特性、例えば本願に記載の変異によって与えられる表現型、例えばδ−辺もしくはδ１■のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ変異体が、炭水化！であるマルトース、マンニトール、ソルビトール、メルビオース、クエン酸塩およびグリセリン上では発酵もしくは増殖できない特性が特徴である親細胞に十分類似の、親細胞の子孫は、これらのすべての炭水化物を醗酵させるかおよび／または使用できるすべての野生型Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａと対比して、１％の適当な炭水化物を補充したＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天のような適切な醗酵支持培地上にプレートするか、または０．５％の炭水化物を補充した無機塩最小培地上での増殖ができないことによって、明らかになる。

「グラム陰性菌」には、球菌、非腸桿菌、腸桿菌および螺旋菌が含まれる。グラム陰性園の属には、例えばＮｅ１ｓｓｅｒｉａ。

山、ＲｉｃｋｅｔｔｓｉａＳＬ」工至１％江立」±ＵおよびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒ　ｉ■が含まれる。

「ダラム陽性園」には、球菌、非胞子形成性桿菌、および胞子形成性桿菌が含まれる。ダラム陽性菌の属には、例えばび５ｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓが含まれる。

「ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅＪは、総合して腸内菌として知られ含まれる。

「マイツバクチリア」は、その特有の染色性によって定義される。すなわちこれからは、長連鎖（約６０の炭素）のミコール酸の存在下、酸性有機溶剤による脱色に耐性がある。

本明細書で用いられている変異菌株に対する遺伝子の記号は、Ｂａｃｈ＋＊ａｎｎ　（１９８７年）および５ａｎｄｅｒｓｏｎおよびＲｏｔｈ　（１９８７年）が報告したものである。トランスポゾン類、特にＴｎｌＯに用いる記号はＢｕｋｈａｒｉらの報告（１９７７年）に記載された取決めに従っている。

本明細書に用いられている「可逆的にラフ型の表現型」とは、その菌株がそれに対して栄養要求性である淡水化物が供給されると、その菌株が完全なリボ多糖種を生成し、炭水化物が制限されているかもしくは存在しない場合には、不完全なリポ多糖のコートを産生じ、その結果、リポ多糖のコアが暴露されるということを意味する。「ラフ」型のコートの検出方法は当該技術分野では公知であり、可逆的にラフ型の表現型で変異体を検出する例は、後に開示する。

本明細書に用いられている用語の「構成性発現」は、発現が正常に抑制される場合の条件下でのポリペプチドの発現を意味する。構成性発現の検出方法は当該技術分野では公知であり、いくつかの方法の例を後で述べる。

本発明のワクチンで治療される「個体」には、すべてのを推動物、例えば家禽とヒトを含む哺乳類、家畜、特に農業上重要な家畜を含む色々な種のトリが含まれると本明細書では定義する。さらに、軟体動物およびある種の他の無を推動物は原始的な免疫系を有し、「個体」に含まれる。

用語「処理」は、防護免疫応答を生じる個体にワクチンを投与することを意味し、予防および／または治療が含まれる。

本明細書で用いられている用語「形質転換」は、挿入に用いる方法にかかわらず、宿主細胞に外因性のポリヌクレオチドを挿入することを意味し、例えば直接取り込み、形質導入、もしくは接合がある。外因性のポリヌクレオチドはプラスミドとして保持してもよく、あるいは、宿主のゲノム内に組み込んでもよい。

本明細書で用いられている「病原性微生物」という用語は、その病原体に通常付随する疾病の徴候を生じる微生物を意味する。

「無毒性微生物」は、感染した個体内で定着し複製する性能を有しているが、同じ種の微生物の毒性菌株に通常付随する疾病の徴候を起こさせない微生物である。無毒性とは、その属もしく種の微生物が病原体としていつも機能できないということではなくて、使用される特定の微生物が、処理される特定の個体に対して無毒性であることを意味する。その微生物は、通常は病原菌である属もしくは種に属し得る、無毒性の菌株に属していなければならない。無毒性菌株は、その毒性病原体の対応物に通常付随する疾病の徴候はすべて誘発することができない。

微生物の無毒性菌株は、毒性菌株の突然変異によって誘導される。

本明細書で用いられる「微生物」という用語には、細菌、原生動物および単細胞の真菌が含まれる。

「抗原」という用語は、宿主の免疫系を刺激して、分泌、体液性、および／または細胞性抗原特異的応答を行う１つ以上のエピトープを含有する分子を意味する。またこの用語は「免疫原」という用語と相互に交換して使用される。

「ハブテン」とは、それ自体は宿主の免疫系を刺激して分泌、体液性もしくは細胞性応答をしない１つ以上のエピトープを含有する分子のことである。

「エピトープ」という用語は、抗原もしくはノ１ブテン上の部位であって、その部位に対して特異的な抗体もしくは細胞レセプターが結合することを意味する。

エピトープは、そのエピトープに独特の立体配置に３つのアミノ酸を含有し得る。

一般にエピトープは少なくとも５つのこのようなアミノ酸で構成され、より一般的に少なくとも８〜１ｏのこのようなアミノ酸で構成されている。またこの用語は「抗原決定基」もしくは「抗原決定部位」という用語と相互に交換して使用し得る。

抗原で構成された組成物もしくはワクチンに対する「免疫応答」とは対象の組成物もしくはワクチンに対する細胞性および／または抗体性の免疫応答が宿主内に発生することである。通常、このような応答は、対象の組織物もしくはワクチンに含有されている単一もしくは複数の抗原に対して特異的な抗体を、主体であるＢ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞毒性Ｔ細胞が産生ずることである。

「ワクチン組成物」または「ワクチン」は、個体の免疫系を刺激して、現在の損傷を軽減し、または将来の損°傷に対する防護を行うのに使用される薬剤を意味する。

「免疫化」という用語は、生物が予め暴露された抗原に対して、連続的に高レベルの抗体および／または細胞免疫応答を誘発するプロセスを意味する。

Ｂ、二豆豆」この発明を実施するには、特にことわりのない限り、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を利用するが、これらの方法は当該分野の技術の範囲内にある。　これらの方法は、文献に充分に説明されている。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＳａ＋ａｂｒｏｏｋ、　ＭＯＬＥＣＵＬＡ！１　ＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＩＪＡＬ（１９８２年＞：　ＤＩＪＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、Ｉおよび目巻（Ｄ、　Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ編稟、１９１１５年）；　０ＬＩＣＯＮＩＪＣＬＥＯＴＩＩ）Ｅ　５ＹＮＴｌ’ＩＥＳＩＳ　（Ｍ、　Ｊ、Ｇａ１ｔｉｉ集、　１９８４年）＋ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ、　Ｄ、　ＨａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈ４ｇｇｉｎｓＪｉｉｉ集、１９８４年）：Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　ＰＩＩＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥ　Ｔｏ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　（１９８４年）：双書、ＭＥＴＩｌｌＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）＋　ＶＥＣＴＯＲＳ：　Ａ　５ＵＲＶＥＹ　ＯＦ　ＭＱＬＥＣＩＪＬＡＲＣｔ、０ＮＩＮＧ　ＶＥＣＴＯＲＳ　Ａ）ｉＤ　Ｔｌ（ＥＩＲｔｌｓＥｓ　（Ｉｌｌ、Ｌ、　Ｒｏｄｒ　ｉｇｕｅｚおよびり、　Ｔ、　Ｄｅｎｈａｒｄｔ＆ｉ集、１９８７年、Ｂｕｔｔｅｒｖｏｒｔｈｓ）；ならびにＪ、　Ｈ，Ｍｉ＋ｌｅｒ、ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＧＥＮＥＴＩＣＳ　（１９７２年、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、およびＨＡＮＤＢｏｏＫ　ＯＦＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、　１−Ｉｖ巻（１）、　ｌｄ、ＷｅｉｒおよびＣ９Ｃ，Ｂｌａｃｋｖａｔ１編集、１９８６年、ＢｌａｃｋｗｅＬＩ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ参照）。

本出願に挙げたすべての特許、特許出願および公告は、上記したもの下記したものにかかわらず、本出願に参照として組み入れるものとする。

本発明のワクチンは、免疫化された個体の腸管に定着する性能が増強され、また異種のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ菌株が定着して残留する可能性を小さくし、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細菌、例えば。

［≧ユが起こす侵入性疾患を防止する免疫応答を個体中に誘ワクチンに使用される菌株が構築されるＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａｆ！Ｉ株は、「病原性の全体的な調節」を行う１つ以上の遺伝子の変異によって一般に無毒性である。すなわちこれらの遺伝子は、バクテリアの毒性因子をコードする遺伝子を含む多数の遺伝子を対等に調節している。これらの「全体的な変異体」の菌株の例は、変異を有し、好ましくは欠失（オーブントライアングル）変異のδ−工およびδ−二を有する菌株であり、その変異によって、アデニル酸シクラーゼ（Ａ　Ｔ　Ｐビロリン酸リアーゼ（環化）ＥＣ４，６，１，１）およびＡＭＰレセプタータンパク質（ＣＲＰ）の各々を合成する性能が除去されている。　これらの菌株の調製方法は、当該分野では公知である（例えば、Ｃｕｒｔ　ｉｓｓおよびＫｅｌｌｙの１９８７年の文献参照）。　これら変異体の菌株、Ｃｈｉ４０６４およびＣｈｉ４０５２は、ｔｈｅ　Ａｏ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、それぞれ受託番号５３，６４８号と５３，６４７号が割り当てられている。「全体的な変異体」の例としては、二遺伝子中の変異体く好ましくは欠失変異体）もまた含まれる。　Σ、江貼士阻■Ｕのビ変異体はＧａ１ａｎおよびＣｕｒｔｉｓｓの１９８９年の文献に記載されており、菌株Ｃｈｉ３６８７とＣｈｉ３６８９がそれぞれ受託番号５３．８６４と５３．３５６号でｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託されている。ＴｎｌＯがビ遺伝子に挿入されているヒ：・丁ｎｌｏ変異を有する他の菌株は、Ｃｈｉ４１２６と命名され、受託番号でＡＴＣＣに寄託されている。

（坪、千＃、白）４０を越える種を代表し、さまざまの感染した動物の種から得たＳａｌ＊ｏｒ＋ｅｌ　Ｉａの数百の野生１ｍ株を使用のために入手できる。これらの菌株の多くは家禽から鳳離された。また入手できる菌株のいくつか、特にスペイン、英国および米国からのＳ　ｅｎｔｅｒｄｉｔｉｓｌｆ！株は、家禽から伝染し、ヒトの疾病を起こすことが知られている。これら菌株の１つ以上を使用して「全体的な変異体」の菌株を構築することができる。

Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ、特にＬ二山王ニーは広範囲の動物種に感染することが知られているが、様々な動物種に感染し、疾病を起こす個々の菌株の能力には差がある。遺伝的に修飾して無毒性の生ワクチンの菌株にしたＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ！Ｉ株は、高度に毒性を有する菌株の系統を引く菌株であって、免疫化されるべき個体の種もしくは免疫学的に関連するモデルの種内で継代培養される。

例えば、ヒョ＝用のワクチンとして、遺伝子が修飾された無毒性の生ワクチン菌株はＳ、　ｔｖｏｈｉｍｕｒｉｕｍ園株ＡＲＫＩＯＩ　（菌株ｉ３７６１とも呼称する）古来の菌株であり、この菌株ＡＲＫＩＯＩはヒヨコ内で継代培養されたものであり、その経口ＬＤ５０は約２ｘｌＯ’ＣＦＵである。Ｃｈｉ３７６１はＡＲＫｌｏｏ　（Ｃｈｉ３６６３とも呼称する）のヒヨコ内で継代培養された誘導体である。Ｃｈｉ３７６１のδ−二■δ−二誘導体すなわちＡＲＫ１０６　（Ｃｈｉ３９８５とも呼称する）は、悪い作用なしでｌｘ　１０’ＣＦ　Ｕまでの投与量が許容される。ｃｈｉ３９８ｓは、マウスを免疫化するのに用いると、その親のＣｈ　ｉ　３７６１のｌｘ　１０”ＣＦ　Ｕまでのチャレンジに対して高レベルの防護免疫性を誘発する。Ｌ■ロｉｍｕｒｉｕｍｃｈｉ４０６４は、δ− 辺δ−＝】誘導体（ＣｕｒｔｉｓｓおよびＫ　ｅ　ｌ　ｌ’ｙの１９８７年の文献）であり、マウスに対して高度に毒性であるが、経口ルートの接種では１日齢のヒヨコを殺す事ができない。実施例に示すように、この菌株は、０７８・Ｋ２ＯＥ、　Ｃｏ１１の尾方気嚢への攻チャレンジに対して交差防護免疫性を誘発する。他の菌株Ｃｈｉ３９８５も、コリ桿菌症を誘発できるＥ、　Ｃｏ１１菌株による攻撃に対して交差防護免疫性を誘発する。毒性の親菌株の他の例はＡＲＫ２Ｇｌ　（Ｃｈｉ３８５Ｑとも呼称する）であるが、これは卵から伝染された感染症としてこの菌を受けたヒトから単離したものである。

本発明の他の実施態様では、Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａの「全体的変異体」菌株は、交差防護免疫性を誘発する性能を増強するためにさらに修飾される。１つの修飾によって次のような表現型が発生する。すなわちその表現型では、細胞が培養中または感染した個体内にあるにかかわらず、菌株は、適切な炭水化物が添加された培地中で培養されると、多数の０抗原リピートを有する野生型ＬＰＳを産生ずる性能をもっているが、動物の細胞に感染した際には正常なＬＰＳを産生できない。したがってこれらの変異体は、ワクチンの製造に使われる場合、適切な炭水化物が添加された培地中でも成長して野生型ＬＰＳを産生ずるのでなめらかな表現型をもっており、また腸およびＧＡＬＴもしくはＢＡＬＴに定着するのに十分な程度侵入性である。しかしそれらは、個体を免疫化して適切な部位に定着するのに用いられた後、徐々にラフ型になり、暴露された膜タンパク質とＬＰＳコアに対する強化された免疫応答を引き出す。さらにそれらは、ラフ状態で、非特異的な宿主防御を受けやすい。さらに排出される細胞は、無毒性で非免疫原性でなければならず、野生型レベルのＬＰｓを宵するなめらかな江ｎ旺虹凰以上に天然に生存する可能性は少ないはずである。２つの遺伝子註」もしくは匡のいずれの変異も、Ｓａｌ＋＊ｏｎｅｌ　ｌａの上記表現型を与える可能性を持っている。

■二遺伝子はＵＤＰガラクトースエピメラーゼをコードし、このエピメラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトースをＵＤＰ−グルコースと交換して細胞をグルコース上で成長させ、江胆旺杜凰のＬＰＳコアと〇−抗原側鎖の両者の前駆物質であるＵＤＰ−ガラクトースを作る。註旦遺伝子に変異を有する菌株は、グルコースを含有する培地内で増殖させた場合、ＵＤＰ−ガラクトースを合成できない。それ故にこれらの菌株はＬＰＳを合成することができず、ラフ型で全く無毒性であり、（ＧｅｒｍａｎｉｅｒとＦｕｒｅｒの１９７１年の文献）腸管をライニングしているムチンとグリコカリンクスを通過して侵入することができず非特異的な宿主の防御機構の作用を非常に受け易い。己亥異体だけが、外因性のガラクトースを供給されるとＵＤＰ−ガラクトースを作る。しかし哺乳類の細胞中では、はとんどのガラクトースは修飾された形態（例えばリン酸化された形態）のようである。

それ故に哺乳類もしくはニワトリの細胞内では、註」変異体はガラクトースが不足するため正常なＬＰＳを作らないだろうと予想される。

ざらに己変異体内の残りのコアは全腸管内のコアと非常に似ているので、コアのこの成分に対する抗体反応は、完全なコアに対する抗体反応より非Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ腸管内園に対して一層交差防護的である。

匡遺伝子はホスホマンノースイソメラーゼをコードし、このイソメラーゼは、フルクトース−６−リン酸をマンノース−６−リン酸と交換する。マンノースの存在下での１変異体の増殖によって、Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａの０抗原側鎖の正常な合成が行われるが、グルコースもしくは他の炭水化物を含有する培地で培養するとＯ抗原側鎖がなくなり正常なコア多糖類が生成する。

Ｓ、、江堕］工工ｕｎ＋のリポ多糖類の概略構造を図１に示す。破線ＡとＢは、次の変異体；（Ａ）ＵＤＰ−ガラクトース欠乏の変異体（ＵＤＰ−４−ガラクトース−エピメラーゼネガティブ）：（Ｂ）ＧＤＰ−マンノース欠乏の変異体（ホスホマンノースイソメラーゼ）におけるＬＰＳ合成の終結点を示す。

「全体的変異体」の菌株への■」変異もしくは匡変異の導入は、当該分野で公知の方法で実施することができる。例えば転移法が含まれる。　Ｌｕ８］且ｒｉｕ＋ｗにおいては転移は、已もしくは匡に密接に連結されたＴｎｌＱ　トランスポゾン２例えば菌株Ｃｈｉ３６３０　（ＴｎｌＯがｎａｄＡに挿入され註」に連結された菌株）およびＣｈｉ４１４９　（Ｔｎｌｏ２が匡に連結された菌株）を用いて実行できる。普遍化された形質導入ファージは、ＫＬＵ、もしくは圧変異体を、所望のサルモネラ菌株、例えば上記の全般的な変異を有し、フザリン酸耐性に対する選択によってＴｎｌｏを脱離させた菌株に形質導入するのに使用できる。得られた菌株は、増殖培地がガラクトースまたはマンノースを含有してＬＰＳコアおよび／または側鎖を合成できるか否かによって可逆的にラフ型になるはずである。δ−工６−ｃｍ　Ｓ、　ｔ」立匡ｕｒｉｕｍ菌株はガラスドースおよびとマンノース上で増殖しこれらを発酵させてＬＰＳの通常の合成を行い得る。したがって、＆己および工の誘導体は、それぞれ、ガラスドースおよびマンノース上で増殖できなかったり、またはこれらを発酵させることができないことによって容易に検出することができる。

本発明の他の実施態様において、サルモネラ菌の「全般的変異体」菌株とその誘導体は、遺伝子上の変異（好ましくは欠失）によってさらに修飾される。二遺伝子は、レブレ・ノサーの合成を支配し、培地中に鉄が豊富に含有されている場合、いくつかの外膜タンパク質（ＯＭＰ）をコードする遺伝子を含むいくつかの遺伝子の発現を妨げる（Ｅｒｎｓｔら１９７８年の文献）。鉄が存在しない場合、ニ遺伝子のレプレッサーは、この鉄で調節される遺伝子の転写をブロックしないので、鉄で調節されるＯＭＰの全部に構成性発現をさせる。微生物が腸管およびＧＡＬＴ内にある場合、多分適当な鉄の利用ができるので、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる効率的な鉄のキレート化は恐らく決定的に重要ではないであろう。これらの条件下では、野生型菌株は恐らくごく低レベルの鉄で調節されるＯＭＰ　Ｌか合成しない。そのためこれらのタンパク質は恐らく、免疫応答するのに支配的な抗原として作用できないであろう。Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａの皿の変異を利用すると鉄で調節されるＯＭＰに対する免疫応答を促進することができる。

鉄の封鎖は、敗血症を起こしうるＥ−、ｃｏｌｉ［１１株の重大な毒性である。抗体応答を鉄で調節されるＯＭＰに対して誘発させるとＬ　ｃｏｌｉに対する交差防護免疫性のレベルを強化することができる。その理由は、旦、ニおよびＳ、　ｎ８Ｄ凹１■の鉄で調節される外膜タンパク質の間に十分な免疫学的な交差反応が存在することが知られているからである。（ＣｈａｒｔおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓの１９８５年の文献参照）。

皿遺伝子への変異の導入は１例えば転位法を含む当該分野で公知の方法で実施することができる。１変異体の検出法は当該分野で知られている。例えばΣ、　Ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍのＦｕｒ−表現型はＡｒｎｏｗ検定法（１９３７年）で検出される。ｆｕｒ：　：ＴｎｌＯ２変異を作る方法は下記の実例で述べている。ｆｕｒ：：ＴｎｌＯ変異は、Ｐ２２ＨＴ−性形質導入法によってさまざまなワクチン菌株に導入することができる。受容体菌株には２例えばδ−”１Ａ６−”Ｊ− 変異および／またはδ−ビ変異および／またはそれ以上の変異、例えば匡および／または■」の変異が含まれる。針ｎ吐口虹士組の１変異体は、鉄で調節される外膜タンパク質の全体に構成性発現性を行わせる。これらのタン、ｆり質には、ヒヨコに辻、姐ユが起こすコリ杆菌症に対する受動防護免疫疫性を誘発できる已、竺旦外膜タンパク質に相同のものが含まれる。

また、無毒性のＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ生ワクチンが、他の病原体由来の、組換え定着の発見および／または毒性の抗原を発現させるベクターとして作用する組換え菌株はこの発明の適用範囲内に入り得る。好ましい態様では、この組換え抗原をコードする遺伝子は、　ｅｈｉ４０Ｔ２　（ＡＴＣＣ受託番号ＳＴ、　５３８）またはｃｈｉ３９８７　（ｃｈｆ３９８５の６−ａｓｄ誘導体）のようなδ −ｍδ−ｍδ−ａｓｄ　Ｓ、Ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｎ＋ｆ！１株に導入されるＡｓｄ−ベクターに、クローン化遺伝子が挿入される平衡致死宿主ベクター系で発見される。組換えＡｓｄ−ベクターを含有する平衡致死系は、　１０／８９０−３２４１号に記載されている。工もしくは註止の変異は、上記の方法によってｃｈｉ４０７２またはｃｈｉ３９８７に導入することができる。これらの菌株は、他の病原体由来の組換え定着および／または毒性抗原が無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ！ｆ！細胞の表面に暴露されたときにこの抗原を発現させるのに特に有用である。したがって上記の組換えワクチン菌株は、マンノースもしくはガラクトースの存在下で増殖して正常のＬＳＰを合成することができ。

その結果免疫化させる動物に経口投与すると、腸管とＧＡＬＴに定着し侵入してその表面からＬＰＳを徐々に失い２発現された定着および／または毒性抗原を免疫監視網に暴露して高められた免疫応答を強化する。

本発明のこれらの実施態様における各用語を下記の考察の項で説明する。

ワクチンという用語は、生きている生物の免疫系を刺激し。

将来の損傷に対しては防護するために用いる薬剤を意味する。

免疫化とは、抗体および／または細胞免疫応答を連続的に高いレベルで誘発し、生物内で、Ｔリンパ球が病原体を殺すことができおよび／または他の細胞（例えば食細胞）を活性化して病原体を殺すことができるプロセスを意味し、このプロセスは生物が先に暴露された病原体もしくは抗原に対抗するプロセスである。′ 免疫系”という慣用句には、異物の存在に対する単細胞生物の応答、例えばインターフェロンの産生を含めることができるが、本願ではこの用語は、多細胞生物が、その生物の細胞もしくはその生物の細胞外液流に侵入する抗原物質に応答する解剖学的な特性と機構に限定する。このようにして産生される抗体は、免疫グロブリンＡ、　Ｄ、　Ｅ、　Ｇ、またはＭのような免疫学的種類のいずれかに属している。免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は温血動物の分泌系が産生ずる基本免疫グロブリンであるので、この免疫グロブリンＡの産生を刺激するワクチンが特に重要であるのが、本発明のワクチンはＩｇＡの産生を刺激するワクチンに限定されるものではない。例えば、本出願に記載されている種類のワクチンは、ＩｇＡの生成に加えて、例えば細胞性免疫と体液性免疫のような広範囲の他の免疫応答を行い得る。抗原に対する免疫応答は十分に研究され、広く報告されている。免疫学の概論は、Ｂａｒｒｅｔｔ、　Ｊａｍｅｓ　Ｔ、著、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　ｎシ肚旦肛：第４版、Ｃ，Ｖ、　Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、　、米国、ミズーリ州、セントルイス、１９８３年に記載されている。

を椎動物は、を椎動物門の亜門すなわちを椎動物門の主要間の一員であり、魚類、両性動物類、爬虫類、鳥類、および哺乳類が含まれ、これらはすべて、区分された骨もしくは軟骨のを柱をもっていることが特徴である。を椎動物はすべて機能性免疫系をもっており、抗体を産生ずることによって抗原に応答する。したがってすべてのを椎動物はワクチンに応答できる。ワクチンはヒトもしくはイヌ（狂犬病ワクチン）のような哺乳類に投与するのが最も一般的であるが、他の種類の商業的に飼育されているを椎動物、例えば本出願に記載されている種類の魚類と鳥類も本発明の適用範囲に入る。

本発明の一つの実施態様として、病原体またはアレルゲンに対する抗体反応を刺激するのに用いられる遺伝子産物の担体としてＧＡＬＴまたはＢＡＬＴに付着し侵入し残留する、病原微生物の無毒生誘導体の使用がある。

無毒生とは、その属もしくは橿の微生物が病原体として全く機能できないということではなくて、使用される特定の微生物が処置される特定の動物に対して無毒生であるということを意味する。その微生物は、通常は病原性である属あるいは種にさえ属し得るが無毒性の菌株に属していなければならない。病原性という用語は、疾病を起こすかまたは正常な生理機能を損なうことができることを意味する。無毒性菌株は、その毒性病原性の対応物に通常付随する疾患の全徴候を誘発できない。本発明で使用される微生物には、細菌、原生動物および単細胞真菌が含まれる。

遺伝物質を、第一生物から、通常は遺伝物質を第１生物と交換しない第二生物に転移させる方法は、組換えＤＮＡ技術が急速に発展してきているため近年広く利用できるようになった。

本出願では、第一生物から第二生物に転移させる遺伝物質であって、第二生物の再生によって同じ遺伝物質を含有する孫を生成する遺伝物質は組換え遺伝子と呼ばれる。遺伝子という用語は、本出願ではその最も広い意味で用いられ、遺伝の生物学的単位を意味する。組換え遺伝子は、高分子物、例えば機能性ポリペプチドを産生じ、その産生を調節できた、親生物中に存在するのと同様な完全遺伝子である必要はない。

組換え遺伝子は、抗原産物の産生の案内者として用いられる鋳型として動けることだけが必要である。その産物は親生物中にはその正確な形態では見いだされない場合がある。例えば、１００のアミノ酸残基を含有するポリペプチド抗原をフードする機能性遺伝子の一部分が、担体の微生物に転移され、わずか７５さらには１０のアミノ酸残基のみを含有するペプチドが宿主細胞の細胞浅溝によって産生されることがある。しかし、この遺伝子産物が親生物中に存在する類似の抗原に対する抗体の生成を引き起こす抗原である場合、この遺伝子は本発明で定義される遺伝子という用語の範囲内にあると見なされる。

あるいは、特定の抗原もしくはその断片のアミノ酸配列が公知の場合は、そのＤＡＮ断片もしくはその類似体を自動遺伝子合成器などによって化学的に合成し、前記ＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに導入することができる。スペクトルの他端は、いくつかの遺伝子産物すなわち抗原性になり得る１つもしくはずべての遺伝子産物をコードする長いセクションのＤＮＡである。

したがって本願で定義されクレームされる遺伝子は、抗原を産生できるあらゆる遺伝単位である。この遺伝子は、染色体、プラスミドもしくはウィルスが起源になり得る。

上記遺伝子が免疫応答を誘発するのに有効であるため↓こは、その遺伝子は発現されなければならない。遺伝子の発現と（ま、遺伝子の構造（ＤＮＡ塩基の配列）に固有の情報力（、遺伝子力５位置している細胞の生化学的機構によって、ＲＮＡ分子、ポＩＪペプチドもしくは他の生物学的分子の形態で生体産物（こ形質転換されることを意味する。このように産生された生物学的分子は遺伝子産物と呼称する。本出願で用し）る遺伝子産物と（λう用語は、遺伝子の制御下で起こる生化学反応の結果、生成する単一もしくは複数の生物学的産物を意味する。この遺伝子産物は、例えばＲＮＡ分子、ペプチド、また（±酵素あるｕＸｉよ遺伝子の初期産物すなわち代謝産物などの分子の制御下で産生できる産物であり得る。例えば遺伝子は、第１１こ、１ノボ・ノームの作用によって、その遺伝子が見い出された元の細胞の外側の環境におけるグリカンの生成を制御する酵素（こ翻訳されるＲＮＡ分子の合成を制御する分子の合成を制御する上記ＲＮＡ分子、酵素及びグリカンは、その用語が本出願で用１．Ｍられる場合、すべて遺伝子産物である。これらは池の種類の多くの遺伝子産物、例えば糖タンノくり質及び多糖類と同様、すべて動物の免疫系に導入されると抗原として作用する。糖タンノくり質及びリポタンパク質を含む、タンノ（り質の遺伝子産物（よ、ワクチンの抗原として使用するのに好まいＡ遺伝子産物である。

ワクチンが個体を免疫化するのに有効であるため１こ（ま、予防接種された動物の免疫系が活動を開始できるよう（こ抗原物質が放出されなければならない。それ故に、生きた無毒性微生物が動物に導入されなければならない。先に述べたように、ＧＡＬＴもしくはＢＡＬＴの細胞の好ましい応答を刺激するために、例えば経口投与、胃内挿管法もしくはエーロゾルの形態で、微生物もしくは遺伝子の産物を腸管もしくは気管支に直接導入することが好ましいが、ワクチンの池の投与法、例えば静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、乳腺内投与、腹腔内投与もしくは膣投与も可能である。

組換えＤＮＡ法は、現在、充分に知られ広く普及しており日常の方法とみなすことができる。非常に一般的で広い意味において、この方法は、ある生物の遺伝物質もしくはより一般的にはその遺伝子物質の一部を第２の生物に転移させて、その転移された遺伝子物質を、それが転移された生物の遺伝子物質の永久的部分にする（再結合させる）ことからなる方法である。この方法は通常、まず親生物由来のＤＮＡの小片をプラスミドもしくは親の染色体から得ることからなる。プラスミド（染色体外要素とも呼ばれる）は細胞の染色体とは物理的に分離した遺伝単位である。そのＤＮＡは、いずれの大きさであってもよく、ＤＮＡ分子を特定の塩基対の部位で分割する作用を行う制限エンドヌクレアーゼ酵素の作用で得られることが多い。

プラスミドを、ファージもしくはコスミドベクターに連結して組換え分子を形成させた後、この組換え分子を、例えば形質転換法（外界から裸のＤＮＡを取込む方法、これは、各種の化学薬剤、例えばカルシウムイオンの存在によって人工的に誘発することができる）のような各種の方法で細胞内に転移させることができる。形質導入法のような他の方法も適している。この方法では、組換えＤＮＡが、形質導入ファージのようなファージ、またはコスミドベクター内にパッケージされる。

プラスミドＤＮＡをＳａｌｍｏｎｅｌｌａに導入するさらなる方法はエレクトロポレーション法である。ＤＮＡを細菌細胞にエレクトロポレーション法で導入する方法は当該分野では公知であり、その一つの方法を実施例で説明する。組換えＤＮＡがキャリヤー細胞中に一旦入ると、分離した断片として存在し続けるか（一般に完全に伝達されたプラスミドに当てはまる）。または宿主細胞の染色体に挿入されて細胞分裂中に染色体によって再生され得る。

無毒性微生物の誘導体もまた本発明の適用範囲内に含まれる。誘導体とは、無毒性菌株の有性的もしくは無性的に誘導される子孫、および単一もしくは多数の塩基の置換、欠失、挿入もしくは反転を含む無毒性菌株の多量体であって、天然産の毒性プラスミドにより、またはこのプラスミドなしで、機能性アデニル酸ンクラーゼとｃＡＭＰ受容体タンノ４り賀を産生できない性能を保持するものを意味する。例えばＣｈｉ４０６２とＣ。

ｈｉ４０６４のような菌株は、本発明において便利な標識として使用されるナリジキシン酸耐性を与える江旦変異をもっている。

しかし薬剤耐性は、ワクチンとして使用される菌株にとって望ましい特性ではない。したがって、伍ｙ（ナリジキシン酸に対する感受性を与える）遺伝子を、隣接して連結されたＴｎｌｏ（７）遺伝について選択することによって、菌株に形質導入し、次いでフザリン酸耐性について選択し、その後ＴｎｌＯをフザリン酸耐性に対する選択により除去することによって、旺ユ変異は容易に除去することができる。

防護免疫応答を誘発するのに必要な組換光もしくは非組換えの無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ生ワクチンの投与量は、５ａｌＩｌｏｎｅｌｌａ遺伝子産物もしくはクローン化された組み換え遺伝子の産物の抗原性によって変化し、既存のワクチンの典型的な免疫応答を誘発するのに充分な投与量だけを２要とする。日常の実験によって必要な投与量を容易に規定することができる。ワクチンの代表的な初回投与量は、免疫化される個体の大きさと年齢によって１×１０７〜ＬＸ　１０ ”　ＣＦ　Ｕであり得る。多重投与も、所望のレベルの防護免疫を与えるために必要に応じて用いることができる。

ワクチンは、溶媒もしくは固体の医薬担体中に懸濁されるか、または、接種される動物に非毒性で、担体、生物もしくは抗原遺伝子産物と相溶性の物質内に入れてカプセルにされる。適切な医薬担体には、生理的濃度もしくはこの濃度に近い濃度の通常の食塩水および他の非毒性塩の溶液のような液状担体、およびヒトのみならず家畜の飼料にも用いられるタルクもしくはスクロースのような固体担体が含まれる。所望により抗原性を増大するためにアジュバントを添加しテモヨい。ワクチンは気管支を通じて投与して使用する場合、エーロゾルの形態で投与することが好ましい。

病原体から誘導された遺伝子産物による免疫化もまた、病原体由来の組換え遺伝子によって特定される遺伝子産物を発現するための担体とて作用する病原性微生物の無毒性誘導体による従来の免疫化法とともに使用することができる。このような非経口免疫化法は、病原体由来の遺伝子産物に対する分泌免疫系が病原体由来の遺伝子産物を発現する担体微生物による免疫化でプライムされてＧＡＬＴもしくはＢＡＬＴのリンパ系細胞を一旦刺激した後に、該分泌免疫応答の発現を増強する追加免疫法として働き得る。この増強された応答は、東二次の追加免疫または既往の応答として知られ、この応答によっての免疫防護が延長される。追加免疫法は何回でも繰返して」遺匡ソＬ丘下記菌株の生物学的な純品を、米国、メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ　１２３０１、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託した。指定の受託番号は、生死判別試験に合格した後に割り当てられた番号であり、必要手数料は支払い済みである。前記培養物利用の許可は、本願は、３７ＣＦＲ１，１４および３５ＵＳＣ１２２に基づいて、長官が利用する権利があると決定した人に対してなされる。前記培養物の利用の公衆に対する制限は、本願に基づいた特許が付与されたときに最終的に廃棄される。さらに指定寄託物は、寄託日から３０年間または寄託物に対する最後の請求から５年後までまたは該米国特許の実施可能な期間の内いずれかの長い方の期間、保存される。万一培養物が生育不能になったか、または不注意で破壊されたか、またはプラスミドを含有する菌株の場合にソノプラスミドを放出した場合、同じ分類学的種類の製造可能な培養物が取り替えられる。

１迭　１匝旦　ｕ匹ｌ旦Ｃｈｉ３７６１　１９８９年１１月３日Ｃｈｉ３９８５　１９８９年１１月３日Ｃｈｔ４１２６　１９１１９年１１月３ＥＩＣｈｉ４１３７　１９８９年１１月３日Ｃｈｉ４１５２　１９ｇ９年１１月３日これらの寄託物は、便宜上のものであり、本発明を実施するのに必要であると解すべきではない。

以下に本発明の実施例を記載するが、これは例示だけを目的とするもので本発明の適用範囲を限定するものではない。

この開示によって、当業者ならば請求の範囲の適用範囲内の多くの実施態様が分かるであろう。

実施例実１ル− Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ　δ−ｅｒ　δ−Ｃａの≧ＬＭ図１１野生型毒性Ｓ、　ｕ貼士はＬｕ６株を、ＣｕｒｔｉｓｓおよびＫｅｌｌｙ１９ｇ７年の文献に記載の方法で遺伝的に修飾した。この方法は、欠失部のそばにトランスポゾンＴｎｌｌを配置することによってそれぞれ（ｃＪｉに連結された山：二Ｔｎｕおよび幻１連結された出：：Ｔｎｌｉ）　、Ｓ、　ｕ１頂１註ｕＳＬ１３４４　Ｃｈｉ３３３９中で分離され特性が決定された■および山の遺伝子の欠失部を動負し、次いでその連結した特性を、テトラサイクリン耐性およびマンノース−頁表現型について選択して、高度に毒性の互、江■口肛ｊ菌株Ｃｈｉ３７６１に形質導入することからなる方法である。ｃｈｉ３７６１は、１日齢のヒヨコに経口感染させて３日後に肺臓から単離した。Ｃｈｉ３７６１は、１日齢のヒヨコに対する経口ＬＤＳＧ＋は３ｘ１０３ＣＦＵテアツた。トランスポゾンが付随する遺伝子欠失部（テトラサイクロン耐性をコードする）の形質導入は、まず高力価のバクテリオファージＰ２２ＨＴ出溶解物を作ることによって容易にした。この溶解物は、δ−虹辷且山：：丁ｎ■もしくはδ−ｃｘ＝Ｕ　出：　：　Ｔ　ｎ　ｕ変異を形質導入粒子にノイプケージする。

次に得られたＰ２２ＨＴＬＩＩＬ！溶解物を用いて、感染多重度ＯＪで他の受容体録ｊ並旦ムに遺伝特性を感染させて形質導入した。次に得られたファージ−細菌感染混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、次に、１００μｌの飼料を、１２．５μ１ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補充した１％マルトース（最終濃度）を含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（Ｄｆｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国、ミシガン州、デトロイト）上に広げた。Ｃｈｉ３７７３上に増殖させたＰ２２ＨＴｉｎｔ　（δ−虹Ｌ１１　山：　：　Ｔ　ｎ　Ｉ、９）を、毒性菌株Ｃｈｉ３７６１にＭａｌ−Ｔｅｔ’を形質導入するのに使用した。３７℃で約１８時間インキュベートした後、形質導入体を取出し、同じ培地で精製した。得られた菌株はＣｈｉ３８２ｇと命名したが、遺伝子盟δ−ｄ　ｚｈｂ：　：ＴＩＩＬＯをもっている。Ｃｈｉ３ｇ２ｇの培養物を、ゼラチン入り緩衝食塩水（ＢＳＧ）で１＝１０に希釈し、１００μｌをフザリン酸含有培地（ＭａｌａｙおよびＮｕｎｎの１９８１年の文献）上に広げ、３７℃で約３６時間インキコベートシた。フザリン酸耐性のコロニーを採取し同じ培地上で精製し、Ｔｎｌｉ（テトラサイクリン感受性）　、ｐ２２ＨＴｉ旦感受性および原栄養性の損失をチェックし、新しい菌株を、遺伝子型δ−旺ヒ■　δ−［山：：Ｔｎｌｊｉ］を冑するＣｈｉ３９５４と命名した。

次にＣｈｉ３９５４の培養物に、Ｃｈｉ３６７０上に増殖させた９２２ＨＴ出を形質導入してプラスミドｐｓＤ１１０を導入した。このプラスミドは旦９皿由来の野生型」゛遺伝子およびアンピシリン耐性をもっている。選択を１％マルトースおよび１００μｇ／曹ｌのアンピシリンを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上で行った。アンピシリン耐性のＭａｌ°コロニーを採取し、同じ培地で精製し、Ｐ２２感受性にツイテ検査し、遺伝子型δ−虹ト且δ−［ｚｈｂ：：ＴｎｌＯ］　ｐｓＤ１１０＋を有するＣｈｉ３９６１と命名した。次に、Ｃｈｉ３９６１の培養物ζこＣｈｉ３フ１２上に増殖させたＰＺ２ＲＴｉ＋■２を形質導入してδ −虹と■およびｚｉｄ：：Ｔｎｕの変異を導入した。選択を、１％マルトース、１００μｇ／簡ｌのアンビンリン、および１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上で行った。アンピンリン耐性でテトラサイクリン耐性のＭａｌ−コロニーを採取し同じ培地上で精製し、Ｐ２２Ｖ１．受性について検査し、遺伝子型６−扛二ュδ−［出：：ＴｎｌＯ］　り５Ｄ１１０＋６−肛虹■ｚｉｄ：：ｔｎｌｆｉを有するＣｈｉ３９６２と命名した。１００ μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するレブロス内で増殖させたＣｈｉ３９６２の培養物をＢＳＧで１：１０に希釈し、１００μｌの試料をフザリン酸含有培地上に広げ３７℃で約３６時間培養した。フザリン酸耐性のコロニーを採取し、同じ培地上で精製し、ＴｎｌＯ（テトラサイクリン耐性）　、Ｐ２２ＨＴｉｎｔ感受性および原栄養性の損失につｌ、Ｘで検査した。選択された１０個のコロニーの内の２つ番よ、ｐｓＤ１１０゛プラスミドを失っており、１つを遺伝子型δ−肛二■６−　（Ｚｈｂ：　：ＴｎｌＯ）δ−扛虹Ｈδ−［ｚｊ４：　：ＴｎｌＯ］　δ−江辷■δ−［出：：Ｔｎ１０］をもっているＣｈｉ３９８５と命名した。菌株Ｃｈｉ３９８５１；！、次の表現型特性によって野生型の親と区別し得る。すなわち炭素源のマルトース、マンニトール、ソルビトールース、クエン酸塩、グリセリン上では発酵もしく（よ増殖できず、Ｈ２Ｓの産生が減少し運動性が減少した。

車上ｌシｌされた　および　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　の性ｎ定辺および／または瓜おける変異による、野生型Ｓａ１ｍｏｎｅｌＬ！菌株のヒヨコ内での毒性の減弱化を測定した。弱毒化菌株の製造方法は、実施例１に記載の方法に類似の方法であった（但し、指定の菌株を実施例１の野生型菌株の代わりに用いた）。使用した野生型菌株は、Ｓ．　ｕ助力す１ｕＣｈｉ３３０６、ｃｈｉ３６６３、Ｃｈｉ３７６１およびＣｈｉ３７３９ならびにＳ．　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ　Ｃｈｉ３７００である。Ｃｈｉ３７６１は、３０前にＣｈｉ３５６３を経口接種したヒヨコの肺臓から単離し、高度に毒性のＳ．　ｔｈｉＩｌｕ′ ｕＩｌｅｌｉ株は感染させたウマから単離した。３８６０Ｃを起源とするＣｈｉ３７３９はＧｕｅ　ｌｐｈ大学のＲｏｂｅｒｔ　Ｃ．Ｃｌａｒｋｅから入手した。

接種に用いる細菌は、シブロス中、３７℃で一夜静置して培養した。これらの培養物を予め暖めたレブロスにて１＝２０の比率で希釈し、６００ｎｍｌこおける吸光度が約０．８〜１．０に到達するまで、３７℃で２〜３時間通気した。得られた細胞を、ａｏｏａｘ　ｇで１０分間室温にて遠心分離にかけることによって２０倍に濃縮し、次にゼラチン含有緩衝食塩水（ＢＳＧ）中に懸濁させた。ＦｅｒｔｉｌｅＷｈｉｔｅ　Ｌｅｇｈｏｒｎの卵（米国、イリノイ州、ロアノークＳＰＡＦＡＳ社）ヲａｕ■ｉｄａｉｒｅイン＋ｘベーターバッチャ−ティンキュベートして卵をかえらせた。新しくかえったヒヨコに、飼料および水を与える前にマイクロビベブトチノブを用いて、Ｓａ１ｍｏｎ曲の適当な希釈液１００μｍを与えた。感染させてから３０分後に飼料および水を与えた。疫病の徴候（すなわち下痢、衰弱状態、食欲の低下、体重減少、感受性の低下および死亡）を毎日監視した。感染したトリを、フィルターボン不・ノドトップとワイヤの床を宵する改変モルモットのケージ内に収容した。。そして、動物室の温度はサーモスタｙ）で調節されて、Ｐ２の封じ込めレベルにしである。この動物室から出るすべての物質はオートクレーブにかけてからさらに処理するかあるいは食器洗浄器にかけた。試験結果を表１に示したが、Ｌ１■肛ｍｕｒｉｕｍおよびＬ並３Ｌ工泣」の多数のδー伍δー辺変異体が１日齢のヒヨコに対して無毒性であることを示して０る。

経口接種された１日齢のヒヨコに対するＳａｌＩＩｌｏｎｅｌｌａ野生盟および弱毒化された変異体の毒性菌株　遺伝子型　起源　ＬＤｓｓ（ＣＦＵ）Ａ。

Ｓ−江此二胛江ＵＸ３３０６　旺仏ｕ■ＳＲ−１１　〉ＬＸ　１０９Ｘ４０６４　δー虹ｌユ δーヨ旺ユ１１１１６　Ｘ３３０６　＞ＬＸ　１０’Ｘ３６６３　野生型　３ＧＢ’７Ｓ　２Ｘ　１Ｇ’Ｘ３７７９　６−虹り旦Ｘ３６６３　＞２ｘ　１０’Ｘ３７６１　野生型　Ｘ３６６３　３Ｘ　１０３Ｘ３７８４　６−虹ト皿Ｘ３７６１　＞ｓｘ　ｔｏ８Ｘ３９Ｓ４　６−虹トユＸ３７６１　＞２Ｘ　１０８Ｘ３９６２　６−旺虹ユＸ３７６１　＞３Ｘ　１０８Ｘ３９８５　δー虹１ーｕ６ー江虹且Ｘ３５９４　＞４Ｘ　１０９Ｘ３７３９　野生型　３８６０Ｃ　２ｘ　１０５Ｘ３７３０　δ−虹と旦　Ｘ３７３９　＞ｌｘ　１０’Ｂ。

Σ、ｅｔｅｔｉｄｉＳＸ３７００　野生型　４９３７　ＬＸ　１０７Ｘ３７７９　６−虹り旦Ｘ３７３９　＞ＩＸ　１０９（以下余白）失ＪＬＩｈｏＰ：：ＴｎｌＯＳ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株ｃｈｉ４１２６の　築Ｓ　二重」工１ｕのビ遺伝子は、少なくとも１つの非特異的な酸性ホスファターゼおよびいくつかの他の遺伝子を調節するが、これらの遺伝子の１つ以上は毒性が大きい。二、：Ｔ　ｎ　１．　Ｏ−菌株を構築した。

Ｃｈｉ３６８ｇは、吐虻■の点変異を有し、この点変異には匹」Ｔｎｌｏが９０％同時形質導入可能なΣ　■助り！Ｌ匹ＳＬ１３４４ｍ株である。Ｐ２２ＨＴｉｎｔ溶解物をこの菌株上で作り、Σ　９エヱ」１口。

ｕｍ　ＬＴ２−Ｚ菌株Ｃｈｉ３０００に該溶解物によってテトラサイクリン耐性を形質導入させた。この形質導入体を以下の方法でｐｈｏＰ”についてスクリーニングした。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールリン酸（Ｘ−Ｐ）を切断する性能についてスクリーニングした。

すなわち、Ｘ−Ｐプレート上の白いコロニーはＰｈｏＰ−変異体を示す。またｘ −ｐ陽性コロニーは、Ｇａ　１ａｎｅおよびＣｕｒｔ　ｉｓｓの１９８９年の文献の方法によって非特異的酸性ホスファターゼの産生についてスクリーニングした。すなわちオレンジ色のコロニーかないことはこれらのホスファターゼすなわちＰｈｏＰ−かないことを示す。Ｃｈｉ４１２３と呼ふＰｈｏＰ’　Ｌ」：：ＴｎｌＯｎｌ溝入体は、さらに、Ｐ２２略受性およびプリン類たけ補充した最小培地で増殖する性能について特性を決定した。欠失（δ）変異を、フザリン酸耐性をすなわちテトラサイクリン感受性、およびＰｈｏＰ゛を選択することによって作り、Ｃｈｉ４１２４と命名した。密接に択されたテトラサイクリンを含有する最小培地上でＰｕｒＢ”について同時に選択することによってΣ　立計Ｊ巨ＬｕＴ　ｎ　１０５イブラリイ上で、Ｐ２２ＨＴｉｎｔによるＣｈｉ４１２４の形質導入を増殖させた。

これらをＰｈｏＰ−およびｐｏｇ受性についてＸ−Ｐ最小培地上でスクリーニングして、吐旺：：ＴｎｌＯ１ｉ株Ｃｈｉ４１２５を得た。Ｐ２２ＨＴｉｎｔ溶解物をＣｈｉ４１２Ｓ上で調製し、野生型毒性Σ、Ｕ舶Ｊ閉工岨菌株Ｃｈｉ３７６１に、該溶解物によってテトラサイクリン耐性およびＰｈｏＰ−を形質導入した。このヒ：：ＴｎｌＯ菌株はＣｈｉ４１２６と命名した。フザリン酸耐性上を選択することによって、上記の菌株上に欠失（δ）変異を行なわせ得る。

１五立土Ｓ、　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍのδ−Ｃａδ−Ｃｒパ　へのａｌＥ′　の普遍形質導入ファージＰ２２ＨＴｉｎｔをＣｈｉ３６３０　（註」に連結したＴｎ烈）上で増殖させて、δ−工６−ｃｍ　Ｓ−、ユ盆Ｊ凹ユＵ菌株Ｃｈｉ３９８５に形質導入するために使用した。この場合、ＴｎｌＯの取り込みのための選択はテトラサイクリン耐性によって行われた。■」１旺変異の存在は、高濃度のガラクトースに対する細胞の感受性（註■変異を有する菌株の性質）、およびグルコースを含有する培地上で増殖させた場合のバクテリオファージＰ２２に対する耐性（ＬＰＳを作れない表現型）によって証明した。得られた菌株のＣｈｉ４１３６を０．０５％のガラクトースを含有する培地で増殖させて正常なＬＰＳ合成を行わせ、次に、Ｓ−江■ｉ１ｕｒｉｕｍ　ＬＴ−２原栄養菌株Ｃｈｉ３０００上に増殖させたＰ２２旧ｉｎｔ溶解物で形質導入させた。形質導入混合物を０５％グルコース含有の最小寒天培地上にプレートシ２、ＮａｄＡ”形質導入体を選択し一〇。

得られた菌株Ｃｈｉ４１３７は、ガラクトースに対し感受性でラフ型であり、ガラクトースなして増殖させるとＰ２２ｉ性であることが証明された。またこの菌株は、００５％のガラクトース含有の培地で増殖させるとスムーズでＰ２２に対し感受性であり、や（より６−伍δ−＝工変異をもってｔλた。

夫立一旦Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍのδ−Ｃａδ−ｄ　体（こ・するＩｉ１′・異の導とＣｈｉ３９８５と誘導菌株を、Ｃｈｉ４１４９上で増殖させたＰ２２ＨＴ旦（工に、！したＴｎｌＯ）をＣｈｉ３９８５に形質導入すること（こよって構築した。形質導入体を、１％マン／−スを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地上でテトラサイクリン耐性につ０て選択して、マンノースを醗酵させることができな（八どユ同時形質導入体をスクリーニングした。得られた菌株Ｃｈｉ４１５１に、フザリン酸耐性について選択してＣｈｉ３０００上で増殖させたＰ２２ＨＴｉｎｔ　（テトラサイクリン感受性誘導体）を用いて形質導入を行った。得られた菌株Ｃｈｉ４１５２は、工変異を有し、テトラサイクリン感受性で、δ−陣ユδ− 二変異をもち続けて０ること力ｆ証明された。

天ｉｆ町ｉＳ、　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍのδ−Ｃａδ−Ｃｒパ　体に・するｆｕｒパ６のムＣｂ１３６５７中の工変異は、匡遺伝子に密接（こ連結して（ＸるＴＣｈｉ３６２７はｎａｄＡ５４０：　：ＴｎｌＯ挿入断片を有し、Ｃｈｉ３６２７上で増殖さ質導入させて菌株Ｃｈｉ４１３０を得た。匡およびこのＴｎｌＯ間の同時形質導入の頻度は約１０％である。ユ遺伝子の他方の側へのれた。この菌株はｆｕｒの左側にＴｎ　１０を宵し、ｆｕｒによって１０％の頻度で同時形質導入を行い得る。Ｐ２２ＨＴｉｎｔは、Ｃｈｉ４１３０もしくはＣｈｉ４１３１のどちらても増殖させ得、すべてのＳ、　ｍ二一り匹ワクチン菌株にテトラサイクリン耐性ニを形質導入するのに使用し得るか、挿入したＴｎｌＯは、形質導入またはフザリン酸耐性について選択することによって除去された。

ＴｎｌＯの挿入によって匡遺伝子を不活性化させることによってユ変異を生成させる別の方法を関連する方法で完成した。

Ｃｈｉ３６２７のフザリン酸耐性誘導体は、ＴｎｌＯを除き坦旦遺伝子中の側面にある配列を欠失させるために選択された。Ｃｈｉ４１３２菌株は、δ−ｎａｄＡ変異を持っている。０．５％のグルコースおよびテトラサイクリンを含有する最小寒天培地上でＮａｄＡ’の選択を同時に行って、Σ　江舶Ｊ凹二ｕＴｎｌＯライブラリィ上に増殖させの例では、ＴｎｌＯは連結された厘遺伝子に挿入され、その遺伝子を不活性化した。

至江助二ユニ已厘変異体のＦｕｒ−表現型はＡｒｎｏｖア、セイ（＾ｒｎｏｖの１９３７年の文献）を用いて明かにし得る。このアッセイでは細胞は１０μｌｌ１ｏｌのＦｅＣｌ３および０．５％のグルコースを含有する無機塩最小培地で培養される。細胞を沈降させ、次に培養物の上Ｉｌｉ液０．５ｍｌに、次のものを続けて添加する（添加しながら混合する）。すなわち、Ｏ，１ｍｌの５Ｍ　ＨＣＩ、０．５＋Ｏ１の硝酸モリブデン試薬（Ｉｇのモリブデン酸ナトリウムを、１ｇの硝酸ナトリウム含有の５ｍｌの脱イオン蒸留水に添加して調製）および０１ｍ１のＩＯＮ　ＮａＯＨを順に添加する。１変異体による構成ヘモジブリン貧食細胞合成法を用い、５１５　ｎｍにおける吸光度を読み取って定量した。

ＩＪＬ匹二中に　するａｌＥもしくはｍビのＳ、　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ生匹」ヨム至月匝二」巨り舶エゴ」１１３ノリ創巳Ｓ　ユ幽エニ」のいくつかの菌株は、世代時間が３〜４時間のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で培養する。ＣＨＯ細胞を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のラン胎児血／１１（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００１１／ｍｌ）およびストレプトマイノン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したイーグルの最小必須培地で増殖させ、ハンクスの平衡塩類液（）ＩＢｓｓ）中の細菌で感染させる。これらの培地には、ガラクトースまたはマンノースが添加されていない。従って、■二もしくはとじ変異体によるＬＰＳの合成に２・要なガラクトースもしくはマンノースは、ＣＨＯ細胞によるこれら基質の内因性合成か得られるはずである。

ｃｈヱ４１３７　（計重）またはＣｈｉ４１５２　（凹迎の誘導体の変異体は、グルコースを欠いているが、０．０５％のガラクトースもしくは０５％のマンノースおよび３００　ｍＭのＮａＣ１を含有するＬグロス培地で培養される。この培地はΣ　ｎ助二■二已±遺伝子の発現を促進し、その遺伝子の調節はモル浸透圧濃度に依存する。

ＣＨＯ細胞の単層の感染は、１細胞当り１ｏの細菌の感染多重度でｉ　ｆｉ工Ｕ細胞を該単層に接種することによって行う。

ＨＢＳ中に２時間おいた後、上記単層をＨＢＳＳ中で洗浄し、次いでゲンタマイシン（１００μｇ／ｍりを含有するイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）でインキュベートして細胞外細菌を除去した。対照試験を、野生型Ｃｈｉ３７６１菌株、ならびにＣｈｉ３７６１のとおよび（己の誘導体を用いて行った。ＣＨＯ細胞の試料は、付着および侵入を行った後、連続した期間に採取した。０．１％のデオキシコール酸ナトリウムを含有するＰＢＳを添加して上記ＣＨＯ細胞を溶解し、水で冷却し、二　江＄已細胞を、Ｆｉｎｌａｙらの１９８９年の文献に記載の方法で回収した。回収した細胞を計数し、タンパク質の量を測定し、ＬＰＳの画分を、Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（ＴａｎａｍｏｔｏおよびＨｏ＋ｉｍａの１９８２年の文献）およびゲル電気泳動させた後、銀で染色したＬＰＳ画分のテン／トメトリー（ＴｓａｉおよびＦｒａｓｃｈの１９８３年の文献）によって定量した。ウェスタン免疫プロ、ティング法も非常に鋭敏なアッセイであり、このアッセイによって、ＬＰＳコアおよびＬＰＳ側鎖の合成の微分反応速度を区別し得る。

ガラクトースおよびマンノースがＣＨＯ細胞中に限定されている場合、全ＬＰＳの側鎖はほとんど増加を示さず、一方昆　皿ｉｍｕｒｉｕｍのタンパク質およびＬＰＳコアの量は有意に増加するはずである（２４時間に約８倍〜約３２倍）。

爽亘匹盈相同および非相ＦのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　／ｗ型による一着に対する、亦差　忙　のａｌＥおよびｍｌの′・１　による　全比較されるワクチン菌株は、δ− 工δ−工変異を有するＣｈｉ３９８５およびト佳変異を有するＣｈｉ３９８５の誘導体（すなわちｃｈｉ４１５２）あるいは匹変異を有するＣｈｉ３９８５の誘導体（すなわちＣｈｉ４１３７）である。ヒヨコを１日齢および３日齢の日に上記の菌株で免疫化し、次いて２週間後と４週間後に、リファンピシン耐性に変異（■旦Ｂ１９１１）を有するＣｈｉ３７６１の誘導体、または野生型″Ｓ−，ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓファージ型４菌株の誘導体すなわちＣｈｉ３８５０　（これは二ョユ■対立遺伝子も持っている）でチャＬ／７ノした００と１ユ９１１変異は互　肛堕！！■坦またはΣ　ｅｎｔｅｒｉｄｉ　を鳳の毒性に対して影響はない。Ｃｈｉ３７６１ならびに、註且および工の変異を有するその誘導体は抗生物質に対して感受性であるから、Ｔｎｍｉｍｉ−ｔｅｔ標識を、Ｃｈｉ３４５６上に増殖させたバタテリオファージＰ２２ＨＴｉｎｔで形質導入することによって毒性プラスミドに挿入する（標識をプラスミドに挿入する方法については、ＱｕｌｉｇおよびＣｕｒｔｉｓｓの１９８７年の文献を参唄）。この標職によって、音便中らしくは検死時にワクチンおよびチャレンジ菌株の示差定Ｉを行い得る。

ヒヨコを、１日齢および３日齢の日に、＋ｘ　１０９ＣＦＵのＣｈｉ３７６１もしくはＣｈｉ４１５２　（０，５％のマンノースを含有するしブロス中で増殖させた）もしくはＣｈｉ４１３７　（０，０５％のガラクトースを含有するしブロス中で増殖させた）を経口投与して免疫化した。経口免疫化してから２週間後および４週間後に、５羽ずつのトリからなる群に、Ｓ−江舶工！１■Ｃｈｉ３７６１のリファンピシン耐性（Ｒｉｆ’）誘導体もしくはＳ、ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ　Ｃｈｉ３８５０のＲ４ｆ’誘導体をｌＸｌ０２ＣＦＵもしく　ハＩ　Ｘ　１０３ｃＦＵもしくはＩ　Ｘ　１０’ＣＦＵ経口接種する。音便の試料を接種したトリから毎日接種し、計り分けて、試料中に存在する望　江盆二ｌ工■もしくはＳ、　ｅｎｔｅｒｉｄｉｔ皿のチャレノン菌株を定量するのに使用した。定量は、１％（最終濃度）のラクトースおよび５０μｇ／ｍｌのりファンビシンを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地にプレートして行った。

力価がこれらの手段で検出するのに低すぎる場合は、チャレンジ菌株の存在・不存在は、５０μｇｅｍ　ｌのリファンビンンを含有するセレナイトブロス（Ｌｉｅｆｓｏｎの１９３６年の文献）に入れた音便の部分を３７°Ｃで一夜インキユベートし、次にＲｉｆ’　Ｃｈｉ３７６１もしくはＲ４ｆ’　Ｃｈｉ３８５０の細胞の存在を測定することによって検出し得る。ワクチン菌株の存在は、１％マルトースおよび１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＤｉｆｃｏ　ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地（米国、ミシガン州、デトロイト、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にプレートして検出する。免疫化していないヒヨコを対照として使用し、定着、持続感染および発散を起こすＲｉｆ’ｃｈｉ３７５１およびＲｉｆ’　Ｃｈｉ３８５ｏノ最小力価を測定する。

野生型菌株でチャレンジしてから２週間後および４週間後に、トリを殺し、牌城中ならびに小腸、盲腸および大腸の内容物中の、チャレン／した野生型菌株およびワクチン菌株を、１％のラクトースおよびリファンビンンを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地もしくは１％マルトースおよびテトラサイクリンを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地上に試料の一部をプレートすることによって定量する。Ｒｉｆ’チャレンジ菌株（Ｍａｔ”　Ｔｃ’　Ｌａｃ−Ｒｉｆ’）は第１の培地でだけ増殖し、ワクチン菌株（Ｍａｌ−ＴｃゝＬａｃ“Ｒｉｆ’）は第２の培地上でのみ増殖する。

（以下余白）叉ｍ哺乳類の細　内での　確に対する、Ｓ、　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍによる鉄で一部されるＯＭＰの　成性発　の影ムユ、Ｔｎ匹変異を有する、互、■助］巨旺■Ｃｈｉ３７６１およびＣｈｉ３９８ｓの誘導体をこれらの試験に使用する。試験の対照はＣｈｉ３７６１およびＣｈｉ３９８５の親細胞である。Ｃ１（Ｏ細胞は、ム匡変異体菌株の侵入性および生存度を測定する際のを椎動物のモデルとしての働きをする。ＣＨＯ細胞の増殖は上記のようにして行う。

Ｓ■Ｄ」！Ｌ■は０．１％のグルコースおよび３００　ｍＭ　ＮａＣ１を含有するしブロス中で増殖させる。沈降させて緩衝食塩水中に再懸濁させた後、その細胞を、上記のようにして、培養中のＣＨＯ細胞に結合させて、侵入させるのに使う。定期的に細胞を再懸濁し、溶解し、ＣＨＯ細胞内の盈　ユ助！巨り肥細胞の数を測定する。

のグルコースおよび３００　ｍＭ　ＮａＣ１を含有するしブロス中で先に記載したようにして増殖させる。１日齢のヒヨコに、緩衝食塩水による細菌懸濁液１００μｌを経口接種する。マイクロピペットを使って、Ｌ日齢のヒヨコ５羽ずつの群に、Ｉｘｌｏ３ｃＦＵ、５×１０３　ＣＦＩＩもしくは２．５Ｘ　１０’　ＣＦＵを接種する。死亡したヒヨコは、Σ　ゴロ二！二已が起こした敗血症で死亡したことを証明するのにボストする。

菌株でチャレンジしてから３〜４週間生存しているトリから血清を集めて、鉄で調節されるタンパク質に対する抗体の力価を測定し得る。抗体の適定は、Ｆｕｒ −Σ　Ｕ堕］且ｒｉｕｍ菌株が産生ずるタンパク質について、ＥＬＩＳＡ法および／またはウェスタンプロ、ト分析法で行う。血清ならびに、鉄中および鉄の制限下で増殖させた０７８：に８０旦　ｃｏｌｉ菌株Ｃｈｉ７１２２の外膜タンパク質画分との反応性を定量し得る。ウェスタンプロ、ト内での抗体に対する活性度はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓのデンシトメーターを用いて定量される。

犬１０１ユ」− 相５および非相同のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ菌　型による　イに対する六差　二　２性のｆｕｒ：　：ＴｎｌＯ・　体による　発これらの試験は、已および圧変異体でなされたのと類似の試験である（但し誘導体菌株は、鉄で調節されるＯＭＰ　ｓの構成性発現をさせるｆｑｒ：：ＴｎｌＯ変異を持っていることを除く）。

ｆｕｒ：丁ｎｌＯ変異を、Ｐ２２ＨＴｉｎｔ形質導入法によって、毒性および無毒性の両方の親の菌株に導入する。免疫化されたトリのそれぞれの群内の、野生型Ｒｉｆ’　Ｓ、　ｑ堕コ巨し■およびΣ　肛旦よび交差反応性を試験した。図４は、全細胞抽出物を７，５％ＳＤＳボワアクｌ／ルアミドゲル上に展開し、ニドＣセルロースに移し、トリプンソイブロス中で増殖させてホルマリンで殺し？＝０７８：ＫＩＩＩＯＥ−、ｃｏｌｉ菌株Ｃｈｉ７１２２で免疫化したウサギ由来の血清でプローブしてウェスタンプロット法に付した結果を示す。

次のレーンが含まれている。レーンミニ予め染色しておいた分子量の標識；レーンｂ：高い鉄分（１０μＭのＦｅＣ１３）を含有するトリプシンソイブロス中で増殖させたＣｈｊ７１２２；　レーンＣ：低鉄分を含有するトリプシンソイブロス中（３００α、α°−ジピリジル）；　レーンｄ：高鉄分を含有するトリプシンソイブロス中で増殖させたΣ　ゴロ」画工ｕｍ　Ｃｈｉ４０６４；およびレーンｅ：低鉄分のトリプシンソイブロス内で増殖させたＣｈｉ４０６４である。

図５は、全細菌抽出物を７．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に展開し、ニトロセルロースに移し、次に、低鉄分（３００μｍｏｌのα、α°ジピリジル）含有のトリプシンソイブロス内で増殖させた０７８：に８０　Ｅ−、ｃｏｌｉ菌株Ｃｈｉ７１２２由来の外膜製剤で２回免疫化したウサギから得たウサギ抗血清でプローブを行う、ウェスタン免疫プロ、Ｉ−法の結果を示す。レーンの内容は次のとおりである。レーンミニ予め染色した分子量標識；　レーンｂ：高鉄分を有するトリプシンソイブロス中で増殖させたＣｈｉ７１２２：　レーンＣ：低鉄分のトリプシンソイブロス中で増殖させたＣｈｉ７１２２；　レー／ｄ：高鉄分含有のトリプンソイブロス中テ増殖させたΣ６江堕コ几工ｕｍ　ＲＢＬ８すなわち１変異体；　レーンｅ：低鉄分を含有するトリプシンソイブロス中で増殖させた）ｌＢ１８　；　レーンｆ：高鉄分を含有するトリプシンソイブロス中で増殖させたＳ−ｕ匹二且り已ＬＴ−２Ｃｈｉ３０００；およびＬ／−７ｇ：低鉄分のドリブンノンイブロス中で増殖させたＣｈｉ３０００である。

矢印は、レーンｃ、　ｄ、　ｅおよびｇに明かな、鉄で調節される外膜タンパク質のゲル中の位置を示す実Ｊ１乳上≦− δ−ｃａδ−ｃｒ　Ｓ、　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍｍ株によるヒヨコの経ロイ：毒性野生型Ｓ、　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株による定着化に対する１ユ里この試験では、免疫化用菌株およびチャレンジ菌株を対数増殖期まで増殖させ、沈降させ、ゼラチン含有の緩衝食塩水中に懸濁させる。ｊ　Ｕ社！巨り巳菌株の１００μｌの試料を経口接種する。

３日齢のヒヨコを、ｌＸｌ０９細胞数のＳ−、■勧」且Ｌｕｍｔｉ株ｃｈｉ３９８５で免疫化する。この菌株はδ−工δ−工変異体である。

免疫化したヒヨコおよび免疫化していないヒヨコの両者に対し、５週齢の日に、ｌＸｌ０’細胞数の毒性菌株Ｃｈｉ３７６１を経口チャレンジする。排出された細胞の力価を、ブリリアントグリーン寒天培地（ｌ　Ｘ　１０２／ｃｃを検定し得る）にプレートすることによって定量する。発散がないことは、Ｃｈｉ３７６１細胞は濃厚セレナイトブロスでＣｈｉ３７６１細胞を検出する性能によって監視される。結果を表２に示すか、δ−勉」、δ−コニワクチン菌株よる免疫化によ・て、侵入性で毒柱のチャレンジ菌株の初期の定着、存続期間および持続性が有意に減少したことかわかる。

表主１１互工ＦＳ、Ｌ　？ｌ１ｍＵｒｌｋ１ｍによる一着に対して　−する、δ〜Ｃａδ−ｃｒ　Ｓ、ｔ　ｏｈｉｍｕｒｉｕｍ［Ｗ株によるヒココの経口　イ３ｇ＋９　１２　峙ｒＡ　６　／　６３９Ｂ４　’、Ｊ（ｆＡ　２．’６　０．３３ｅ８　５匡ｒ哨　１／６　ｏ二１日齢のヒヨコにジ　ュ肋ｉｍｕｒｉｕｍ菌株Ｃｈｉ４１２６を経口接種する。

この菌株はビ　Ｔｎ　１０変異体菌株である。２週間後、生存例に０７８：に８０毒性旦　坦二閤株Ｃｈｉ７１２２をチャレンジする。チャレンジは、右後部の気嚢に７Ｊｘ　１０５ＣＦＵを注射することにょって行う。野生型の親のＣｈｉ４１２６に対する、１日齢のヒヨコの経口ＬＤ５１Ｉは３Ｘ　１０’ＣＦＵである。２週齢のヒヨコのＣｈｉ７１２２に対するＬＤ５．は５Ｘ　ｌｏ’ｃＦＵである。試験結果を表３に示すが、二・ＴｎユΣ、江励Ｊ匹旺Ｕ菌株の相対無毒性および、この菌株による免疫化は、毒性上　二の感染に対して防護する性能をもっていることを例征している。

艮主経口　されたｈｏＰＴｎｌＯＳ、　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ”一体の無毒性および毒性Ｅ、　ｃｏｌｉによるチャレンジに対する六Ｌｔ″″　性〕４且（壊濾り１１五」２種の６−虹旦δ−工Σ　江ｌＪ且り旦菌株Ｃｂｉ４０６４およびＣｈｉ３９８５　（ともにヒヨコに対して無毒性であることが分かった）を、別々のグループの１日齢のヒヨコを１０９の細菌で経口免疫化するのに利用した。ヒヨコの免疫化した群および対照群にＥ、　ｃｏｌｉ　０７１１：に８０：Ｈ９菌株Ｃｈｉ７１２２をチャレンジする。この菌株は気嚢症、肺炎および敗血症を起こし、ＬＤｓｉｌは、２週齢のヒョコては４Ｘ　１０’　ＣＦＵであり、４週齢のヒヨコでは７Ｘ　１０５ＣＦＵである。チャレンジは、Ｅ−、ｃｏｌｉを右後部気嚢に注射して行う。

結果を表４に示す。表４は、いずれかの菌株で免疫化してから２週間後、トリは１．Ｄｓｓについて１０倍〜１００倍防護されたことを示している。免疫化して４週間後、トリはＬＤｓａについて１００倍防護された。免疫化されていない対照の約１／２がＬＤ５＠の１倍量のチャレンジで生存したが、これらの対照は、これより高いチャレンジ投与量では全く生存しなかった。後部気嚢に接種されたＣｈｉ７１２２のＬＤｓ＋＋は、２週問および４週間のヒヨコについてそれぞれ４ｘ　１０’　ＣＦＵおよび７ｘ　ｔｏ５ＣＦｕである。表４中の記号（＊）は、ヒヨコが３日齢のときに経口免疫化されたことを示す。

（メ千宛１）１土Ｓ、　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍδ−Ｃ１６−ｃｒワクチン菌株で経口　イされたヒヨコの、性Ｅ、　ｃｏｌｉによるチャレンジｔニーｔ６１Ｍ”−後部気嚢へ接種してから１時間以内にＣｈｉ７１２２が血液中に検出可能になる。ＩＢ齢のヒヨコを６−ヨユδ−ニジ、止吐ユ肛皿匹ワクチン菌株Ｃｈｉ３９８５で免疫化した場合、狡、ニが循環系に入り、および／または生存する能力が低下しているかを試験するために、６．４Ｘ　１０９ＣＦＵのＳ江肋Ｊ且旺ｕＣｈｉ３９８５に（対照のヒヨコは免疫化しない）で経口免疫化した１日齢のヒヨコを用いて試験を行った。２週間後、両グループに１０ＬＤｓａ量の毒性旦　竺旦菌株Ｃｈｉ７１２２を後部気嚢に注射てチャレンジした。

各時点で１００μｍの血液を静脈穿刺法でウィングベイン（ｗｉｎｇｖｅｉｎ）に取り出して、細菌の数を数えた。表５のデータは、１日齢のヒヨコのＣｈｉ３９８５による免疫化によって菌血症が著しく緩和し、２週間後にチャレンジしたとき敗血症が排除されることを示している。表５において、記号（ｂ）は、２羽のトリが４日口までに死亡したことを示す。この場合の菌の平均数は残りの２羽の菌の数の平均値である。

（以下余白）表１免疫化したトリおよび免疫化していないトリ６の後部気嚢に毒む１Ｇ　０．３１．５５，３１５．８３５．５４２．５　３．３　儲薇ｂ／２− 先、廟しし’ｌｕが、ＩＯ，３１，ｏ　ｉ：、Ｂ　５１．０１１τ３　５９００　６２０　２しΣ　江励二画工ｕワクチン菌株Ｃｈｉ４０６２は、活性化された呼吸器食細胞の迅速な産生を誘発して、免疫化後、短時間でＬ旦Ｏ１ｌ感染に対する非特異的な抵抗手段を提供し得る。しかし、Ｃｈｉ４０６４もしくはＣｈｉ３９８５で経口免疫化を行ってから２〜４週間後に旦　姐ユＣｈｉ７１２２を後部気嚢にチャレンジした際に生き残るということは恐らく異なる機構によるものであろう。それ故に、Ｓ−堕妨二工■」ワクチン菌株が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅ、　ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａの各種の種に対して交差防護免疫性を誘発するという性能に根拠があるか否かを決定するために、タンパク質抗原をＳＤＳゲル上で分離し、ウサギ内にもたらされされた抗血清と吸収されていない抗血清とを反応させた。結果を図２に示したか、これは全細菌の抽出物のウェスタン免疫ブｏノ１−であり、該抽出物は、７５％ＳＤＳポリアクリルアミドケル上で展開し、ニトロセルロースニ移シ、１０６（７）　Ｃｈｉ３３０６の生細胞１０６をラットに腹腔的注射し、Ｃｈｉ３３Ｑ６の生細胞１ｏ７で２回（４週後および６週後）追加免疫注射をし、最後の免疫化をしてから２週間後に採血して得た血清でプローブした。血清は＝２０℃で５０％のグリセリノ中に貯蔵した。図２におけるレーンの内容は次のとおりである。レーンａ：　Ｃｈｉ７０２７　Ｅ、　ｃｏｌｉ　０２ａ：　Ｋ−：Ｈ５（七面鳥）　；　レ −／ｂ：　Ｃｈｉ７０１０　Ｅ、ｃｏｌｉ　０３６：Ｋ　（七面鴎）；　レーンｃ：　Ｃｈｉ７０１１旦　二０１４３：　Ｋ−：Ｈ２７（七面鳥）；レーン壮Ｃｈｉ７１１２旦、姐旦０１：Ｋｌ：Ｈ７（ヒト敗血症）；　レーンｅ　：　Ｃｈｉ７１１０　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｏｌ：Ｋｌ　（ヒトＵＴＩ）　；　レ−７ｆ　：　Ｃｈｉ７１２２Ｅ−、ｃｏｌｉ　０７８：に８０：Ｈ９（ヒ：Ｉ　：＋）　；　ｌ／−７ｇ：　Ｃｈｉ３６６３　Ｓ−、皿ｉｍｕｒｉｕｍ　（ウマ）；　レーンｈ：　Ｃｈｉ３７００　Ｓ、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ　（ヒト）；　Ｌ／　−ンｉ　：　Ｃｈｉ３２０２　Ｓ−〔上ト１（ヒト）　；　Ｌ／−ンｊ：　Ｃｈｉ３２１４Ｓ−、１ｎｆａｎｔｉｓ　（ヒト）；　レーンに：　Ｃｈｉ３２１０　” ｑ、ｈａｄａｒ　（ヒト）；　Ｌ／　−：／　ｌ　；　Ｃｈｉ３７４９　Ｓ■二桓」二匡（ヒ：Ｉ：＋）　；　Ｌ／−７１１：　Ｃｈｉ３７５０　Ｓ−■工胆（ヒヨコ）およびレーンｎ：予め染色した分子量標識である。

図２の結果は、ラット中にもたらされたΣ　江ａ二！二」に対する抗体は、哺乳類および鳥類を含む各種の種の個体の各種疾病状態の原因として作用するさまざまなＳａｌｍｏｎｅｌ　ｔａｍの種および各種のＥ−、ｃｏｌｉの中に存在する多数のタンパク質と反ｃｏｔ　１ｍ株由来のタンパク質と反応し、また各種のサルモネラ園の種に対しても同様である。したがって上記の結果は、Σｕ勧二！巨 ■ワクチン菌株がＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科中野各種の種に対して交差防護免疫性を誘発する性能の根拠を確証している。

Ｓａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ菌株による免疫化の交差防護作用が該菌株の免疫原性からもたらされるということを確証するために、Ｃｈｉ３９８５で免疫化されたトリ由来の血清中の循環抗体の力価を試験した。なおこの循環抗体は旦、竺二のＣｈｉ７１２２およびワクチン菌株Ｃｈｉ３９８５の両者の表面タンパク質と反応する。図３は、７５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に展開され、ニトロセルロースに移し、免疫化しているかまたは免疫化していない（すなわち対照）３周齢のヒヨコ由来の血清でプローブされた菌細胞抽出物のウェスタン免疫プロットを示す。プロットの１．２および３は、３羽の免疫化されていないヒヨコ由来の血清でプローブされている。プロットの４．５および６は１日齢の日に免疫化された３羽のトリ由来の血清でプローブされている。免疫化は、ＬＸ　１０９ＣＦＵのδ−工δ−チェΣｔｈ１ｍｕｒｌｕｍ菌株Ｃｈｉ３９８５て経口で行った。それらプロットにおいて、レーンａは予め染色された分子ｔＷ識を含有し；　レーンｂはブロス中で増殖させた狡　ヨＣｈｉ７１２２　（０７８：に８０：Ｈ９）を含有し；およびレーンＣはブロス中で増殖させた旦　■励！！ＬｕＣｈ　ｉ　３９８５を含有している。

図３の結果は、Ｃｈｉ３９８５で免疫化したトリ由来の血清は高力価の循環抗体を含有（５、この循環抗体は、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃｈｉ７１２２とワクチン菌株Ｃｈｉ３９８５の両者の表面タンパク質と反応することを例証している。これらの抗体は、免疫化されていないトリ由来の血清には検出されなか・った。

１１丘上１Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍδ−Ｃａδ−ｃｒ菌株を　いる経口　進による、１性０７８：に８０　Ｅ、　ｃｏｌｉを用いるチャレンジに・する防ｒにお（する、　ａｌｆｊ・８もしくはｍｉ・・異もしくはｆｕｒ・・異の評価Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍδ−工δ−二菌株の１　ｘ　１０９ＣＦＵで１日齢のヒヨコを免疫化したところ、０７８：に８０　Ｅ、　ｃｏｌｉ菌株による後部気嚢へのチャレンジに対する免疫性増大が誘発されたということは実施例１４で例証した。上記の誘発された免疫性に対する、計理もしくは工変異もしくは０工の変異を包含されたことの影響を以下のように試験する。

１日齢と３日齢のＷｈｉｔｅ　Ｌｅｇｈｏｒｎのヒヨコを、０．１％のグルコース含有のしブロス、０，０５％のガラクトース（註且菌株用）含有のしグロスおよび０１％のマンノース（ＰＬ！！ＬＬ菌株用）と３００ｍＭＮａｃｌ含有のしブロス中で増殖させたワクチン菌株の１×１０９の細胞で経口免疫化する。５ｐｉのワクチン菌株を比較する。

これらのワクチン菌株は、δ−工６−二Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍワクチン菌株Ｃｈｉ３９８５、ならびに４種のＣｈｉ３９８５の誘導体：と変異を有するＣｈｉ３９８５の誘導体くすなわちＣｈ　ｉ　４１５２）、工変異と包り変異を有するＣｈｉ３９８５の誘導体、註」変異を有するＣｈｉ３９８５の誘導体（すなわちＣｈｉ４１３７＞および己亥異と二変異を有するＣｈｉ３９８５の誘導体である。

５羽つつのトリからなるグループを１ｘ　１０９ＣＦＵの各ワクチン菌株で免疫化する。これらのワクチン菌株は、適当な炭水化物を３００ｍＭ　ＮａＣ１で補充したレブロスで増殖させ、収穫後、セラチン含有の緩衝食塩水に再懸濁させる。免疫化したトリのグループに対して、免疫化してから２週間後と４週間後に、Ｃｈｉ７００７　Ｅ、　ｃｏｌｉ　０７８：に８０のｌＸｌ０’　ＣＦＵ、ｌＸｌ０”　ＣＦＵおよび１Ｘ１０’ｃＦＵをチャレンジする。チャレンジの前に、チャレンジ菌株は、トリブ／ノソイブロス中で増殖させて収穫しリノ酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させる。

チャレンジは、１００μｍの上記懸濁液をトリの後部気嚢に接種して行う。免疫化していないトリのグループを対照として使用する。死亡したトリは、Ｅ、　ｃｏｌｉ　感染症で死亡したということを確認するためにボストする。その確認は、気嚢炎、心膜炎、肺炎などの特徴である典型的な繊維状沈積物で行う。

支ｉ丘エエエレクトロボレー／ジンによる、Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ菌へのブラスミヱ旦仝ノ己填１人Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｔａｉｌへのプラスミドＤ　Ｎ　Ａを導入する手段はエレクトロボレー／ジンである。Ｌｕ」工五二■受容体菌株のしブロス培養物Ｉｏｎ　ｌを対数増殖期（すなわち６００ｎｍの吸収光度が０．５−０．８）まで増殖させる。細胞を氷上で１５−３０分間冷却し、４°Ｃにて１５分間５０００Ｘｇで遠心分離して沈降させる。得られたペレットを、水で冷却したｌ　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）緩衝液１０ｗｌ中に懸濁させる。ＨＥＰＥＳ中ての遠心分離と再懸濁を繰り返した後、細胞を沈降させ１０％グリセリン液中に懸濁させる。細胞を遠心分離でさらに濃縮し、最終的に、約３　ｘ　１０　”ＣＦＵ／＋１の細胞濃度て１２５μｍの１０％グリセリン液１．２５ｍ１中に懸濁させる。

トリス−ＥＤＴＡ　ｐＨ１ｌｌ緩衝液にＤＮＡ’Ｅ−混合水上で約１分静置して得たＤＮＡ緩衝液の５−１０μｍを、氷上の細胞液４０ｍ１と混合する。Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓａｒ装置を、２００ｑにてパルス制御器で２５マイクロＦと２．５ＫＶに設定する。上記の細胞−ＤＮＡ混合物を冷却した０、　２ｃ＋＋のエレクトロポレーションキュベントに移す。その懸濁液をキュへ、トの底で振とうし、そのキニベノトをチャンバーのベースに入れる。／ングルパルスを４．５−５ｍ５ｅｃ間与えた後キュベツトをチャンバーから取り出し、ｌ＋ｅｌのＳＯＣ培地（２％のバクトートリブトン、０５％のバクトー酵母、ｌｏｍＭ　Ｎａｃｌ、２．５ｍＭ　ＫＣＩ、ｌ０ｍＭＭｇ５Ｏａおよび２０ｍＭグルコースを含有）をキュベツトに添加し、パスツールピペットを使って細胞を迅速に懸濁させる。得られた細胞懸濁液をガラス試験管に移し、急速通気をしなから、３７°Ｃで１時間インキュベートした。ｌ：１０希釈の試料１００μｌと希釈していない試料１００μｌを、１％のマルトース＋１００μｇ／ｌのアンピシリンを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地のような適当な選択培地上にプレートして、ｃＬＰＬ４プラスミドｐｓＤ１１０をδ−二変異を有する菌株に導入する。

Ｋ皿Δ土二イされたヒヨコによって　イされる未　イＣａｅ■ａｔ長茎工ＪＬＬＬ旦Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍワクチン菌株のδ−ｍ６−Ｃ１と江オヨヒ　６皿６− ｍ　ｄは、可逆的にラフ型であり、マンノースもしくはガラクトースを外部から供給されると、それぞれＬＰＳコアと側鎖だけを合成することができる。これらの糖は、腸内容物中に豊富には存在していないようである。それ故に、ｒＬ！！ＬＬ変異もしくは計理変異を宵するし二公エユＬ匹菌株は、その野生型親菌株よりも短期間で腸に定着するはずであるから、無毒性でかつ非免疫原性であるべきラフ型で排出されるはずである。

ワクチン菌株Ｃｈｉ３９８５　（δ−ｕ　６−”ｌ’）とその凪誘導体もしくは計重誘導体すなわちＣｈｉ４１５２とＣｈｉ４１３７をそれぞれ、浸入性を促進する３００ｍＭ　Ｎａｃｌの存在下、ＬＰＳを合成させる適当な炭水化物を含有するしブロス中て増殖させる。得られた細胞を、緩衝食塩水−セラチン中に懸濁させ、１日齢のヒヨコに経口接種するのに使用する。各菌株で免疫化したヒフ３５羽つつの各グループを、免疫化していないヒフ３５羽づつのグループとともに収容する。トリは、個々にデータを集めるためにウィングバンドをつけた。排せつくう腔スワブを使って、排出ルベルと期間を定量し、免疫化されていないトリが定着されていないが否かを決定する。４週齢時に、すべてのトリは採血され、ＳａｌｍｏｎｅＪ　１ａＬＰｓに対する抗体および外膜タンパク質抗原の力価をＥＬ　Ｉ　ＺＡ法で測定する。

Ｌ１！立夏土立相同および非相同のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ血清型ならびに他のグラム陰性腸内細菌に対して免疫性を誘発し得るＳａｌｍｏｎｅｌ　１ａｆｉの無毒性菌株を含有するワクチンは、哺乳類と部類を処理して、これらのグラム陰性細菌の毒性菌株に暴露された集団における疾病の作用を改善するのに有用である。この集団に含まれる哺乳類、特に部類は、これらの病原細菌に感染することが多いたけでな（、ヒトに伝染させる連鎖になっている。

上記の無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌ　１ａｆｌの菌株は、他の遺伝子を全般的に調節する遺伝子中に少なくとも１つの変異を有し、その上に次のタイプの少なくとも１つの他の変異を有する。すなわちリポ多糖の合成にかかわる酵素をコードする遺伝子（可逆的にラフ型の表現型をもたらす）または鉄で調節されるＯＭＰ　ｓの合成を調節する遺伝子に少なくとも１つの変異を有する。

その結果これらの変異はこれらのタンパク質の構成性発現をもたらす。これらの菌株は前記ワクチンを製造するのに有用である。

ａｂｃ　ｄ＠ｆｇｈ　１ｊ　ｋｌｍｎＦＩＧ、２４８．５− ３６．５−−＋＋−＋７−−−・−閣一蟲ＦＩＧ、３ａｂｅｄ　・ａｂｃｄ＊ｆｇＦＩＧ、　５国際調査報告１＋ｌ呻＃Ｄｅ＋ｌｓｌ＾”””−”　”　ＤＩ−Ｔ　７１１（Ｏ１’ｌ　Ｉ＋ ’％（Ｍ特表平５−５０４３３１　（２１）ミズーリ　６３１１２　セントルイス、ナンバー　４０リート　６０５

Claims

【特許請求の範囲】

１．相同および非相同のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型ならびに他のグラム陰性腸内細菌に対して免疫性を誘発するし得る生きた無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌株を含有する、グラム陰性細菌による感染症に備えて個体を処理するワクチンであって、該Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌が、他の遺伝子を全般的に調節する遺伝子に少なくとも１つの変異を有し、および可逆的にラフ型の表現型をもたらすリポ多糖の合成にかかわる酵素をコードする遺伝子にも変異を有し、前記生細胞の量が、グラム陰性腸内細菌による感染症に対して個体の抵抗性を改善するのに充分な量であり、該Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌の細胞が薬学的に受容な担体中に存在しているワクチン。
２．前記無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌が、アデニル酸シクラーゼ（ｃｙａ）およびサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質（ｃｒｐ）をコードする遺伝子に変異を有する請求項１に記載のワクチン。
３．前記無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌がｇａｌＥ中に変異を有する請求項２に記載のワクチン。
４．前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌がｐｍｉに変異を有する請求項２に記載のワクチン。
５．前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌がＰｈｏＰ−表現型を有する変異体である請求項１に記載のワクチン。
６．前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌がｇａｌＥに変異を有する請求項５に記載のワクチン。
７．前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌がｐｍｉに変異を有する請求項５に記載のワクチン。
８．相同および非相同のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌血清型ならびに他のグラム陰性腸内細菌に対して免疫性を誘発し得る生きた無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌株を含有する、グラム陰性細菌による感染症に備えて個体を処理するワクチンであって、該Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌が、他の遺伝子を全般的に調節する遺伝子に少なくとも１つの変異を有し、および鉄で調節される外膜タンパク質（ＯＭＰ）の合成を調節する遺伝子にも変異を有し、その結果その変異が鉄で調節されるＯＭＰｓの構成性発現をもたらし、前記生細胞の量が、グラム陰性腸内細菌による感染症に対する個体の抵抗性を改善するのに充分な量であり、該Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌の細胞が薬学的に受容な担体中に存在しているワクチン。
９．前記無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌が、アデニル酸シクラーゼ（ｃｙａ）およびサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質（ｃｒｐ）をコードする遺伝子に変異を有する請求項８に記載のワクチン。
１０．前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌がＰｈｏＰ−表現型を有する変異体である請求項１に記載のワクチン。
１１．前記グラム陰性腸内細菌による感染症に対する該個体の抵抗性を改善するのに充分な量で、請求項１のワクチンを、該個体に投与することを含有する、グラム陰性細菌による感染症に備えて個体を免疫化する方法。
１２．前記グラム陰性腸内細菌による感染症に対する該個体の抵抗性を改善するのに充分な量で、請求項８のワクチンを、該個体に投与することからなる、グラム陰性腸内細菌による感染症に備えて個体を免疫化する方法。
１３．相同および非相同のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ菌血清型ならびに他のグラム陰性腸内細菌に対して免疫性を誘発し得る単離された無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌株であって、該菌株が他の遺伝子を全般的に調節する遺伝子に少なくとも１つの変異を有し、および可逆的にラフ型の表現型をもたらすリポ多糖の合成にかかわる酵素をコードする遺伝子にも変異を有する、単離された無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌株。
１４．相同および非相同のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌血清型ならびに他のグラム陰性腸内細菌に対して免疫性を誘発し得る単離された無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌株であって、該菌株が他の遺伝子を全般的に調節する遺伝子に少なくとも１つの変異を有し、および鉄で調節される外膜タンパク質（ＯＭＰ）の合成を調節する遺伝子にも変異を有し、その結果、その変異が鉄で調節されるＯＭＰｓの構成性発現をもたらす、単離された無毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌株。
１５．Ｃｈｉ３７６１，Ｃｈｉ３９８５，Ｃｈｉ４１２６，Ｃｈｉ４１３７およびＣｈｉ４１５２からなる群から選択される請求項１４に記載の単離されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌。