JPH06505383A - 改良されたワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

改良されたワクチン 本発明はワクチンに関する。 発明の背景 本発明は米国政府の支援による研究の中で行われたものであり、本発明の真のな 権利は米国政府が有する。 湯熱及び下痢性疾患（例えば、腸チフス及びコレラ）は、発展途上国における罹 病率及び死亡率の主たる原因となっている（Ｈｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８ ０．　Ｉｎ　Ｈａｒｒｌｓｏｎｏｓ　Ｐｒ１ｎｃｐｌｅｓ　ｏｒＩｎｔｅｒｎａ ｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　９ｔｈ　Ｅｄ、、　８４１−８４８．　ＭｃＧｒａｖ 　ＨｌｌｌA　Ｎｅｗ　Ｙ。 ｒｋ）。細菌病に対するワクチン開発の伝統的なアプローチには、精製された成 分または死滅菌体の非経口投与が含まれる。調製に高い技術水準が要求される、 このような経口投与ワクチンは相対的に高価であり、また、針による注入が嫌わ れて患者に拒絶されることが多い。生経ロワクチン株は、非経口ワクチンよりも 安価で、投与しやすく、調製が容易など、幾つかの点で有利である。 生ワクチンの開発は、標的疾患の病理学の分子レベルでの解明が不十分であるこ とにより、制限されることが多い。生ワクチン候補株は、その菌株の毒性に影響 するがその免疫応答の誘導には影響しない復帰不能な遺伝的変異を有する必要が ある。ｎ１ｒｊｏ　ｌｅｔθ／〃１θの毒素生産能の機構を明確化する研究によ り、毒素遺伝子の削除に基づく生ワクチン株の生産が可能になった（Ｍｅｋａｌ ａｎｏｓ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８２、Ｎａｔｕｒｅ　３０８：５５５１．　Ｌ ｅｖｌｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１１．　Ｉｎｆｅｃｔ、１ｍ５ｕｎ、５６： １６Ｌ　）　B 近年、ｊ；’、ｇ／ｌｏＩθ／／７１Ｈｐｉｌｊｚｗｊｔｔｉマクロファージの 生存及び毒性の分子生物学を明確化する研究が始まった（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａｌ１６・５０５４．本発明の参考文献に取り入れられている）。正の調節レギ ユロン（ｒｅｇｕｌｏｎ　）　ｔｙ力０１における変異を有する。！；ｉ／ｚｏ ｎｅ／／ｉ　ｔｙｔｙ／Ｖｚｔｔｎｔｔａ株は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに対する毒 性が著しく減弱する。β力０ｐレギユロン（ｒｅｇｕｌｏｎ　）は、一つのオペ ロン中に存在する二つの遺伝子、βカθｐ′＆びｐ力０Ｑから成っている。ｐ力 ｏ１及びｐ力ＯＱの遺伝子産物は、細菌性２因子転写レギユレータの他のメンバ ー（環境由来の刺激に反応し、多くの他の遺伝子の発現を制御する）と非常に類 似している。これらｐカＱ１調節領域調節遺伝子の一つ１．ｉｆ（’のおける変 異により、毒性が低下する。βｌ　ｆ　ＩｓβＪＩ！ｏ！’またはβ／！０Ｑの おける変異を有する株は、野生型、５’、ｔｙｐＭｚｗん−こよる抗原投与に対 して部分的な防御をもたらす。 Ｓｔ／＃７θ／／１は、湯熱及び急性胃腸炎を含む臨床的疾患のスペクトル（病 原菌）となり得る（Ｈｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８０．５ｔｙ）ｙｒｉ）　 ｏ免疫が抑制された人は１．９．ｇ／＃７ｅ／／ｉ種による感染をより受けやす い（Ｃｅｌｕｍ　ｅｔ　ａｌ、、　１９１１７．　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ ｓ、　１５６：９９８、）。腸チフスの原因となる細菌、９．珈Ｍ、ヒトにのみ 感染する（Ｈｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９１１０．５ｔｔｐ〜。５．珈β宿主 特異性が狭いことにより、マウスの５．１９／７／θｒｈｉｌｌ’ｓ　ＤｙｙＭ ｚｔｔｒｊｔｔｉ感染が、腸チフスの実験モデルとして広く使用される（Ｃａｒ ｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、ユ３９：１１８ ９　）　、　、９．　ｌｙｐＭｚｔｎゾＪは、より広範囲な宿主に感染し、ヒト において急性胃腸炎を、また、マウス及びウシにおいて腸チフスにｆｆｇＬだ疾 患を引き起こす。 ｊ；ａ／１０１１θ／／６染は経口摂取により侵入する。細菌は胃を通過し、小 腸において複製する（Ｈｏｒｎｌｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７０．　Ｎ、　Ｅｎ ｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　２８３：Ｂ１１ｅ）　ｏ　、９ｉ／ｐｏｍｐ／^Ａｔ腸 の粘膜細胞を侵すことができ１，５’、　ｔｙｐＭよこの粘膜バリアを通過し、 バイアー斑を経由して固有層（Ｉｕ■ｉｎａ　ｐｒｏｐｒｉａ）及びリンパ節に 広がる。次いで、菌血症発生後、宿主の網内細胞におけるコロニー形成が起こる 。、５’、　珈ｎ、ヒト網内システムの細胞中で生存し複製する能力は、その病 原性に不可欠である（Ｈｏｏｋ　ａｔａｌ、、　１９８０．５ｔｔｐｒｉ　Ｈｏ ｒｎｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７０．５ｔｔｐｒｓ、及びＣａｒｔｅｒ　ｅｔ 　ａｔ、、　１９W４　ｓ Ｕ〜。 、９ｉ／＃７７θ／／７　ｔｙｔｙ／ｕｌこ対する免疫には体液性免疫及び細胞 媒介性免疫が含まれ（Ｍｕｒｐｈｙ　ａｔ　ａｔ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｉｎ ｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１５６：１００５　）　、この免疫はワクチン接種によ り獲得することができる（Ｅｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９１１８．　Ｒ ｅｖ、　ｌｎｆ、　Ｄｌｓ、　ｇ：３２４）。近年、ヒトを対象にした試験によ り、部分的に精製されたｖｉ抗原を用いた筋肉内ワクチンが接種されると、５． 珈厚染に対して大きな防御的効果を示すことが実証された（Ｌａｎａｔａ　ｅｔ 　ａｔ、、　１９８３．　Ｌａｎｃｅｔ　鉦４４Ｌ　）　ｏ　、Ｓ’、　ｔｙｐ ｌｉ＆ワクチンを接種された人において、Ｔ細胞による。５’、　ｌｙｐ／ｌｌ の殺生が抗体に依存して強化されることが実証され、これにより、宿主が細胞媒 介性免疫応答を生じさせるたＩｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７９：８Ｈ）。この免疫 応答を誘導しない死菌ワクチンはヒトを保護するものではないため、チフス免疫 においては細胞媒介性免疫応答が重要である（Ｃｏｆｆｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、 １９７２．　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、４１ニア４２　）　。 発明の要旨 一般的に、本発明はワクチン、好ましくは、２因子調節機構の制御下にある遺伝 子の構成的発現により毒性が減弱している生ワクチン（細菌細胞、好ましくはＳ ｔ／ｚｏｔｙｅ／／ｒｄｍ胞、例えば、５’、　１ｙｐｉｌＡ　ｓ、ｅｉｔｅｒ Ｍｊｔｊｓ　ｔ、ｒ）ｙｌｌｚｔｔｒ／ｌｓ、まｔ−ハｓ@ｃｏ。 ／ｍθ−５ｔｔｊＵ胞、を含む）であることを特徴とする。好適な実施例におい て、構成的な発現は、２因子調節機構の１因子における突然変異の結果起こる。 好適な実施例において、細菌細胞は、その毒性が減弱する第二の突然変異を有す る。 ワクチンの他の好適な実施例において、２因子調節機構は、ｐｈｏＰＷＲ節領域 である。そして、２因子機構の制御下にある遺伝子は、ｐｈｏＰｉ１節領域に制 御された遺伝子、例えば１ｅｆｔまたはｐｄｌ遺伝子（例えば、ｔｙｉｉｃ）で ある。 好適な実施例において、構成的発現は、調節遺伝子若しくはｐｈｏＰｇ節領域の プロモータ内の改変または突然変異（復帰不可能なものが好ましい）、例えば、 ｐｒｈｏＱ若しくはｐ力０Ｐ遺伝子における変異（例えば、ｐ力ｏＰＣ変異）の 結果生じる。 ワクチンの好適な実施例において、Ｓｓ／ｌｏｊθ／ｈ細胞は、例えば、ｐ力ｏ Ｐ：Ａ節領域の遺伝子内の突然変異（ｐ力ＯＰＣ等のｐ力ｏＱ若しくは）ｙｈｏ Ｐ遺伝子遺伝突内変異またはｐｈｏＰＱ節領域に副領域れた遺伝子内の突然変異 のような毒性を減弱させる第一の変異、及び、例えば、ｉｒｏ遺伝子等の芳香族 アミノ酸合成遺伝子内の突然変異、ｐｈｏＰ２節領域に制御された遺伝子内の突 然変異（ｐｉｚｃ突然変異等のｐｆ！またはｐａｒ領域内の突然変異）のような 毒性を減弱させる第二の変異を有する。 他の好適な実施例において、細菌細胞は、ｐｈｏＰ調節領域遺伝子における第一 の変異、及び芳香族アミノ酸合成遺伝子（例えば、ｊｆＯ遺伝子）における第二 の変異を有する。 他の態様において、本発明は細菌細胞（この細菌細胞の毒性は、２因子機構の制 御下にある遺伝子の変異により弱まっている）を含むワクチン（好ましくは生ワ クチン）に関する。好適な実施例において、細菌細胞は、例えば、芳香族アミノ 酸合成遺伝子（例えば、ｚｒｏ遺伝子）などの第二の遺伝子内に毒性を低下させ る変異を有する。 ワクチンの他の好適な実施例において、細菌細胞はＳｓ／ｌｏｎθ／ｈ細胞であ り、２因子調節機構はｐｈｏＰＨＢ領域であり、ｐｈｏＰ調節領域にＭｉｌｌさ れた遺伝子、例えば、βｒｉまたはρｉｔ遺伝子（例えば、ｔｙｚｉｃ）である 。 他の態様において、本発明はＳｔ／ｌｏｐθ／ｈ細胞（例えば、Ｓ、　１ｙｉｊ ！、　又ｍｔθｒＭ／ｌ＃　ｌｙｐＭｚｔｔｒｊｔｘ、または工〃θ／ｌｖｗ− ｓｔｔｈ細胞）を含むワクチン（好ましくは生ワクチン）に関し、これら細菌細 胞は、芳香族アミノ酸生合成遺伝子（例えば、ｒｌｆＯｌ低Ｏ）における、毒性 を低下させる第一の変異、及びｐｈｏＰｍ節領域遺低領域遺伝子、毒性を低下さ せる第二の変Ｊｉｍ（例えば、！ＡｏＰ−変異）を有する。 他の態様において、本発明は細菌細胞（好ましくは１．９ｉ／ｐｏｒｔθ／ｈ細 胞、例えば、ｌｌ別仏工ｇｓｊｔｙｒｊ／１１かＭ％縮戚またはヱ〃θ／ｍθ旭 〃媚胞）、またはこの細菌細胞から精製された調製物に関し、この細胞は、２因 子調節機構の制御下にある遺伝子を構成的に発現し、また、２因子調節機構の制 御下にある遺伝子の構成的発現を引き起こさない変異であって毒性を低下させる 変異を有する。 好適な実施例において、この細菌細胞は、２因子調節機構の因子の一つに変異を 有する。 好適な実施例において、細菌細胞は、ｐ力θＰ調節領域にｉ４御される遺伝子を 構成的に発現する（構成的発現は変異、好ましくは復帰しない変異、例えば、ｐ ｈｏＰＱ節領域に副領域欠失、例えば、ｐ力ｏＰＣ等のｐ力。Ｑまたはｐカ。Ｐ 遺伝子における変異により起こることが好ましい）力／ｌｏｎθ／ｈ細胞であり 、同時に、この細菌細胞は、毒性を低下させる変異、好ましくは欠失等の復帰し ない変異、好ましくは芳香族アミノ酸合成遺伝子（例えば、ＪｆＯ遺伝子）中、 またはｐｈｏＰ調節領域に制御された遺伝子（例えば、ｐｈｏＰ調節領域に制御 された遺伝子の構成的発現は引き起こされない）ｙｉｚｃ等のｔｙｒｉまたはβ ｔｌｆ遺伝子）中に存する。 他の態様において、本発明は細菌細胞（好ましくは１，５’Ｊ／ＩＩＭθ／ｈ細 胞、例えば、、５’、　ｆｐＪｊミＳ、　ｅｉｔｅｒＭｊｔｊｓ　ｌｙｉｙＭｚ ｔｔｒｊｔｓ、またはＳ、　ｃｉｌｏ／１ｔｙｅ−ｓｔｔｊ、ｓ１ｍ胞）Aまた はこの細菌細胞から精製された調製物に関し、この細胞は、２因子調節機構の制 御下にある遺伝子を構成的に発現し、また、２因子調節機構に制御された遺伝子 中に、毒性を低下させる変異を有する。好適な実施例において、毒性を低下させ る変異はｐ　ｈ　ｏ　Ｐｍｍ領領域制御された遺伝子（Ｎえば、ｐｌｉｃ等のｆ ｉｒｆまたはｐ１１７遺伝子）中に存在する。 好適な実施例において、細菌細胞は、例えば、１ｒＯ遺伝子等の芳香族アミノ酸 合成遺伝子中、ｐｈｏＰ＠節領域（ＰＩえば、β力θＱまたはρ力θＰ遺伝子） 中、ｐｈｏＰ調節領域に制御された遺伝子（例えば、ｐＪ　ｊ’ｃ等のｐｒ！ま たはｐｉｇ遺伝子）中に第二の変異を有する。この第二の変異により毒性は低下 するが、ｐｈｏＰ調節領域に制御された遺伝子の構成的発現は引き起こされない 。 本発明は、例えば、５．ｌ〃払Ｓ、　ｅｔｙｒｅｒＭＩｌｋ１層１１Ｍヴ鳳若し くは５６ｄθ／Ｌ９＃θゴｄ媚胞等の生存Ｓ、ｔ／ｌｏＩθ／ｈ細胞、またはこ れらの細菌細胞から実質的にｍ製された調製物に関し、この細胞の毒素遺伝子（ 例えば、ｐｈｏＰ調節領域、またはｐ　ｈ　ｏ　Ｐａ３節領域に制御された遺伝 子、例えば、Ｉ）　Ｊ　ｚｃ等の１ｙｒｔまたはｐｉｔ遺伝子）には、異種蛋白 質をコードする遺伝子またはその調節因子が挿入されている。 好適な実施例において、生存Ｓｔ／ｐｏｌθ／ｈ細胞は第二の変異（例えば、１ ｒｏＡ変異、１ｒｏＡ″″または、ｒｒｏＡＤＥＬ（０７等のｚｔｏ変異）を有 し、この変異により毒性が低下する。 好適な実施例において、異種蛋白質をコードするＤＮＡは、環境に調節されるプ ロモータの制御を受けている。他の好適な実施例において、生存Ｓｓ／ｇｏｓθ ／ｈ細胞はさらに、環境に調節されるプロモータとＴ７転写感受性プロモータの 制御下にあるＴ７ボリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を有する。ここで、Ｔ７ 転写感受性プロモータは異種抗原の発現を制御する。 本発明は１．９Ｊ／ｌ０ＥＩＩ／／Ａの染色体に挿入することができる、以下の ＤＮＡ配列を有するベクターにも関する：異種蛋白質をコードする第一のＤＮＡ ；マーカー（例えば、選択マーカー、例えば、重金属に対する抵抗性をもたらす 遺伝子、またはその遺伝子により形質転換される株が有するａｕｒｏｔｒｏｐｈ ｌｃ変異を相補する遺伝子）をコードする第二のＤＮＡ配列（任意）；毒性に必 要な生産物をコードする第三のＤＮＡ配列（例えばｐ／ｙｏＰレギニロンをコー ドする遺伝子、例えばｐ！！若しくはｔｙｚｒ遺伝子座、例えば、）ｙｉｚｃ＞ 、ここで第三のＤＮＡ配列は変異により不活性化されている。 他の好適な実施例において二第−のＤＮＡ配列は、第三のＤＮＡ配列を不活性化 するようベクター上に配置されている；ベクターは野生型、９ｉ／ｚｏｉｙθ／ ／淋中で複製されない、異種蛋白質は、環境に調節されるプロモータの制御を受 ける；ベクターは、環境に調節されるプロモータとＴ７転写感受性プロモータの 制御下にあるＴ７ポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列も有する（ここで、Ｔ７ 転写感受性プロモータは異種抗原の発現を制御する）。 他の！！様において本発明は、細菌〔例えば１．９ｉ／ｚｔｙｐθ）層に起因す る疾、轡に対して、動物（例えば、哺乳類、例えば、ヒト）にワクチン接種する 方法（本発明のワクチンの投与も含む）も含む。 本発明は、）ｙｉ７ｃ遺伝子産物をコードするＤＮＡを有するベクター；このベ クターにより形質転換された細胞；形質転換された細胞の培養、及び細胞または 培地からのｐｉｚｃ遺伝子産物の精製を含む）ｙｉｚｃ遺伝子産物の生産方法； 及びＨ７Ｃ遺伝子産物の精製調製物をも含む。 他の態様において本発明は、ｐｉｚｃをフードするＤＮＡへの試料の接触、及び 試料中の核酸への１ｙｉｚｃをコードするＤＮＡのハイブリダイゼーションの検 出を含む、試料中におけるカｈのθ／ｈの存在の検出方法を含む。 本発明の他の態様において本発明は、細菌の毒性を低下させる方法を含む。ここ で細胞は、２因子調節機構ををし、２因子調節機構の制御下にある遺伝子を構成 的に発現する。好適な実施例において、細胞は、９．ｔｌｚｏｔｙθ／／＾　（ 例えば、、５’、　ｔｙｐｊ人工ｍｌｔｙｒＭｊｌ／ｓ　ｌｙｐＭｚｔｔｒ／ｕ ｓ、または又ｃＪｏｌｔｖｗ−ｓｔｔ／ｌｒであり、２因子調節機構はｐｈｏＰ 調節領域である。 ここで使用する“２因子調節機構°は、環境の信号に応答した複数の蛋白質の発 現を制御する細菌の調節機構を指す。この用語における２因子とは、センサー（ 例えば、環境のパラメータを感知し、これに応答して活性化を促進する、例えば 、第二因子であるアクチベータのリン酸化を促進する等のセンサー）を指す。 アクチベータは、２因子機構の制御下にある遺伝子の発現に影響を及ぼす。２因 子機構には、例えば、ヒスチジンプロティンキナーゼ及びリン酸化応答レギュレ ータ（グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の両方に見られる）が含まれる。例え ば大腸菌においては、１０Ｆｉのキナーゼ及び１１種の応答レギュレータが同定 されている。これらは、化学走性、窒素調節、リン酸調節、浸透圧調節、胞子形 成、及び他の多くの細胞機能を制御している（Ｓｔｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８９　Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、　Ｒｅｖ。 ５３：４５０−４９０．本発明の参考文献に取り入れられている）。２因子間節 機構は、Ｉｔｒｏｌｔｍ：ｔｅｒｊｗ　ｌｙｇ／”ｔｔｓｔＪｅｚ、ｌＤ植物腫 瘍形成も制御する（Ｌｅｒｏｕｘ　ｅｔ　ａｔ、、　ＥＭＢＯＪ６：８４９−８ ５６．本発明の参考文献に取り入れられている）。類似の毒性レギュレータは１ ｏｎｌｏｌｅ／／ｉ　ｐｅｒｒｔｔｓｓｌｓ　（Ａｒｌｃｏ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９１１９．　Ｐｒｃｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓモ堰A　ＵＳＡ 取り入れられている）の毒性に含まれる。 ここで使用する“環境に制御される”とは、細胞中の遺伝子の発現が、その細胞 が存在している環境のある種の特徴または成分のレベルに依存している発現様式 を指す。この例には、特定の一つまたは複数の成分のレベルによって活性化した り不活性化したりする、生合成経路のプロモータ（例えば鉄、温度応答性プロモ ータ）、または特異的な細胞部分く例えば、マクロファージ中または液胞中）で 、より活発に発現するプロモータが含まれる。 ここで使用する“ワクチン“とは、適切な担体との組み合わせで望ましい生物学 的応答（例えば、免疫応答）を喚起する物質を含む調製物を指す。ワクチンには 、生存菌体（この場合、通常経口投与される）、または死滅菌体またはその成分 （この場合、通常ｐｅｒｉｎｔｅｒａｌ　Ｉｙ投与される）が含まれる。本発明 のワクチンに使用される細胞は、生存しており、このため接種された動物の腸に コロニー形成できることが好ましい。 ここで使用する“変異゛とは、菌体のＤＮＡ配列におけるいかなる変化（適切な 親株と比較して）をも指す。このような変化は、例えば、自然発生的に、化学物 質、エネルギー（例えば、Ｘ線）または他の形の変異導入により、遺伝子工学的 に、またはｍａｔｉｎｇまたはその他の形の遺伝情報の交換の結果として起こり 得る。 変異には、例えば、塩基変換、欠失、挿入、逆位、転座または重複が含まれる。 変異の結果として、変異細胞の毒性レベルが親株におけるレベルと比較して低下 した場合、変異は毒性を低下させる。このような毒性レベルの低下は、（ａ）親 株と比較した場合の、変異株における顕著な（例えば、最低５０％）毒性の低下 、または（ｂ）親株と比較した場合の、変異株における顕著な（例えば、最低５ ０％）毒性因子として同定されるポリペプチド量の低下、により測定する。 ここで使用する“復りｙ不能な変異″とは、１塩基対の置換により復帰すること のできない変異（例えば、欠失または挿入変異、及び１つ以上の障害を含む変異 （例えば、２つの別個のポイント変異から成る変異）を指す。 ここで使用する°ｐ　ｈ　ｏ　Ｐ”ｌ１節領域°とは、ｐＨ及びｌ）ｌ！遺伝子 の発現を制御する２因子間節機構を指す。これには、ｐｈｏＰ遺伝子座及びｐｈ ｏＱ遺伝子座が含まれる。 ここで使用する“ｐｈｏＰｒＡ節領域に制御される遺伝子“とは、β＝、及びｐ ｉｔ遺伝子を指す。 ここで使用する“βＩｌ＃とは、ｐｈｏＰレギユロンにより正の制御を受ける遺 伝子を指す。 ここで使用するｔｙｒ、ｒ″とは、ｐｈｏＰレギユロンにより負の制御を受ける 遺伝子を指す。 ここで使用する“芳香族アミノ酸合成遺伝子”とは、芳香族アミノ酸の合成にお ける過程を触媒する酵素をコードする遺伝子を指す。ｚｒｏＡ、１ｒｏｃ、Ｊｒ ｏＤは、このような遺伝子の、５１々〃θ／Ｕこおける例である。これらの遺伝 子における変異は、免疫抗原性を総じて失うことな（、毒性を低下することがで きる。 ここで使用する“異常な発現”とは、野生型において見られるよりも高いが、ま たは低い発現を意味する。 ここで使用する“異種蛋白質”とは、野生型において発現しないか、または異な る染色体部位から発現する蛋白質を指す。例えば、異種蛋白質は、第二の遺伝子 に挿入された遺伝子にコードされている。 ここで使用する“毒素遺伝子″とは、ｓ、ｚｉｚｏｔｔｅｉん細胞において、そ の遺伝子が不活性化されることにより細胞の毒性が、その遺伝子が不活性化され ていない、同様のＳｓ／ｚｏｔｙθ／／、細胞の毒性と比較して、低下するよう な遺伝子を指す。この遺伝子の例にはｐｈｏＰ及びｐｉｇｃなどがある。 ここで使用する“マーカー”とは、その存在が容易に検出できる遺伝子産物を指 す（例えば、重金属に対する抵抗性を付与する遺伝子産物または所定の条件下で の増殖ができるようにしたり増殖を阻害したりする遺伝子産物）。 ここで使用する“精製されたｍ！１２物″とは、蛋白質、脂肪、及び他の混在物 質から精製された調製物（例えば、蛋白質）を指す。調製物は、最低２〜１０倍 精製されていることが好ましい。 ここで使用する“構成的な発現°とは、適当なコントロール株（例えば、親株ま たは野生型株）における同一の遺伝子の発現と比較して、発現量が低いレベルに 調整または調節されている遺伝子発現を指す。例えば、遺伝子が通常第一の条件 下で抑制を受け、第二の条件下で抑制が解除される場合、構成的な発現では、発 現量が、例えば、抑制されたレベル、抑制解除されたレベル、または中間レベル で同じレベルである。部分的な構成的発現は、構成的発現の定義に含まれ、これ は、２つのレベルの発現の差が、適当なコントロール株（例えば、野生型株また は親株）において見られるものと比較して減少している場合に起こる。 細菌細胞の、十分に精製された調製物とは、望まれる変異の遺伝子型を有しない 混入細胞の構成比が、調製物中の総画体数の１０％以下、好ましくは１％以下、 さらに好ましくは１１％以下である細胞調製物である。 本発明では、２因子間節機構及び／またはこれらの機構に調節される遺伝子にお ける変異により、細菌の毒性、及び細菌を含むワクチン（特に、生存菌体を含む ワクチン）の毒性が低下する。本発明のワクチンは、毒性が顕著に低下している が免疫抗原性は保持しているため、安全かつ効果的である。　本発明のベクター により、異種蛋白質（例えば、抗原）をコードするＤＮＡを有する株を迅速に構 築することができる。異種蛋白質をコードするＤＮＡは、染色体中に挿入され、 このため、抗生物質に対する抵抗性または安定性のための他の選択圧力に依存す るプラスミドシステムと異なり、安定である。異種蛋白質の発現が環境応答型プ ロモータの制御を受けている、本発明の生存Ｓｓ／ｐ＃θ／ん細胞は、発現が望 まれていない時（例えば、培養時、ワクチン調製時、または保存中）には異種蛋 白質を発現しないで菌の生存能力を高め、ヒトまたは動物に投与する時にその蛋 白質を高発現する。ｊ；ｉ／＃７７θ／ｈ中における多くの異種蛋白質の高発現 は、その細菌に対する毒性に関連することがあるため、このような機構は望まし い。１コピーのみの挿入ＤＮＡ　（異種蛋白質をコードしている）を使用するこ とによっても、発現が望まれていない時の異種蛋白質の発現を最低限に抑えるこ とができる。毒素遺伝子（例えば、ｐｉｚｃ遺伝子）が異種蛋白質をコードする ＤＮＡの挿入のための部位を有する実施例においては、菌体の毒性は低下する。 本発明の他の特徴及び利点は、以下に述べる好適な実施例及び特許請求の範囲か ら明白である。 実施例 ４、

【図面の簡単な説明】

図面 図１は、マクロファージ中の５ａｔＩｏｎｅｌｌａ株の生存を示すグラフである 。 図２は、ｐｚｇｃ遺伝子座の制限酵素地図である。 図３は、ｐ、ｇｚｃ領域のＤＮＡ配列の地図である（配列番号＝１）。 菌株の寄託 ｐカｏＰＣ株Ｃ５０２２（上述）は＾ｍｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃｏｔ　１ｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｔｌｌｅ、　ＭＤ）に寄託され、Ａ ＴＣＣ寄託番号　を受けている。 ｐ力ｏＰ構成的対立遺伝子←Ｐ／１ｏ！　）、ｔｙ力０−２４により、ｔｙｉｉ 遺伝子座の抑制が解除される。ｊ；、　ｔｙｐ／Ｖｚｗ＃ｉＬ　Ｔ　−２のジエ チル硫酸変異により、＾ｍｅｓと共同研究者たちは、栄養培地中で酸性フォスフ ァターゼの構成的生産を誘発するｐ／：ｒｏＰ遺伝子座における変異（Ｋｌｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、＋　１９７９．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ユ封：１５５．本 発明の参考文献に取り入れられている）を有するＴＡ２３６７　β力θ−２４株 （この章のすべての株、材料及び方法は、以下に記述）を単離した。この、ｐ力 ｏＰに制御された酸性フォスファターゼは、ｐ力０ｈ遺伝子、Ｊ）１１７遺伝子 座によりコードされている（Ｋｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９７９．５ｕｐｒａ 、　Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．５ｕｐｒａ）。ｐ力ｏ−２４対 立遺伝子が他のｐｌ！遺伝子座の発現を増加させるかどうか解析するために、発 現にｐｈｏＰ及び）ｙｈｏＱを必要とする転写性融合蛋白質（例えば、ｐ　Ｊ　 ｚＡ及びｐｉｚＢ）及び翻訳性融合蛋白質（例えば、ｐｉｔｚｃ）　として近年 同定された他のｐｌｉ遺伝子座（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９１１９． ５ｕｐｒａ）の発現における、ｐ力Ｑ−２４対立遺伝子の影響を検討した。７２ ２♂遺伝子融合株（）ｙ／ｙｏ−２４対立遺伝子に対して以外は遺伝子的に同質 ）を構築し、融合蛋白質活性をアッセイした。ｐｔ、ｔ７Ａ：：Ｍｕ　ｄＪ及び １）ＪＡ’Ｂ　：　：Ｍｕｄ１株のＰｈｏＰＣ派生株の栄養培地におけるβ−ガ ラクトシダーゼ活性は、それぞれ４８０Ｕ及び９８０Ｕであり、野生型ｐ力０１ 遺伝子座を有する融合蛋白質の活性の９〜１０倍であった（表１参照）。 表１．菌株及び性質 菌株　遺伝子型　酵素活性　参考文献または由来（Ｕ）　ａ ＴＴｌ］２０１３　ｐｈｏＰ１０５：＝Ｔｎｌ（Ｍ　＜１０　（Ａ）　”−”： ””ａＡ、酸性フォスファターゼ；Ｂ、β−ガラクトシダーゼ；Ｃ１アルカ１ノ フォスファターゼ ｂＮｌｎｇ　ＺｈｕとＪｏｈｎ　Ｒｏｔｈから寄贈ｐｔｚｚｃ　：　：　Ｔｎｐ ／！ｏＡ遺伝子融合体のアルカリフォスファターゼ活性は３５０Ｕであり、Ｃ５ １１９株（β／１ｏ−２４変異に対して以外は遺伝子的に同ｙｔｔ＞（Ｍ目１ｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．５ｕｐｒａ）株における活性の３〜４倍であっ た。これらの結果は、Ｃ３０２２株にｐｔ０−２４対立遺伝子を導入した場合酸 性フォスファターゼ活性が９倍になることと同等である。このため、ｐＪ！遺伝 子の発現を検討することができるこれらのアッセイにより、ｐｈｏ−２４変異が １ｙ／ｘｏＡ／以外のｔｙｉｉ遺伝子座の構成的発現を誘発することが証明され る。 され得る蛋白質種の数を計ｎルた。特筆すべきことに、Ｐｈｏｎ’表現型を有す る株が生産した蛋白質を一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果、βｌ において減少した蛋白質は、ＰｈｏＰレギニレータにより抑制される遺伝子の産 物を示している可能性がある。ｐ力ｏ−２４対立遺伝子により減少する蛋白質を コードする遺伝子は、ｐ力ｏ　ｐ−ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ　ｇｅｎｅｓから、ｆｉ ｒ！遺伝子座と命名された。野生型、ＰｈｏＰ−１及びＰｈ０Ｃ変異株の蛋白質 を比較した結果、ＬＢ培地中３７℃での培養がｐＩｊ遺伝子産物にとって抑制的 な条件であり、ｐｉ♂遺伝子産物にとって抑制解除的な条件であることを示して いる。 潜在的なＰｈｏＰに制御される遺伝子産物の総数を計＃１するために、ＬＢ培地 で培養した野生型株及びＰｈｏｎ０変異株の菌体全蛋白質を、２次元ゲル電気泳 動により解析した。最低４０種の蛋白質の発現が、ｐ力ｏ−２４変異に応答して 変動した。 ＰｈｏＰ０株の毒性欠陥　特筆すべきことに、単一のｐ力ｏ−２４変異を有する 株の毒性は、マウスにおいて顕著に低下した（表２）。腹腔内（ｔ、ｐ、　）経 路で抗原投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの５０％を死亡させる（ＬＤ５ｏ）Ｐｈｏ Ｐ０菌体の菌体数（２Ｘ１０５）は、ＰｈｏＰ−細菌による場合の菌体数（６× １変異株におけるリポ糖多糖類の変化（毒性欠陥を説明することができるがもじ れない）についても試験した。Ｃ３Ｏ２２株はファージＰ２２に対して正常な感 受性を有し、０抗原に対する抗体への正常なグルー１８反応性を示し、また、ポ リアクリルアミドゲル電気泳動及び染色により決定したとおりリポ糖多糖類のプ ロファイルも親株のものと同一であった。 ＴＡ２３６７　、？力０−２４株は化学的変異により構築されており、その毒性 欠陥に関与する、他の関連した変異を有する可能性もあるため、βＡｏ−２４対 立遺伝子が、観察される毒性低下に関与しているかどうか検討するために、ｐｈ ｏＰ　の復帰突然変異株を単離した。表現型ＰｈｏＰ’復帰突然変異株（栄養培 地中で培養した時正常レベルの酸性フォスファターゼを生産することにより同定 ）を、Ｃ３０２２株により感染したマウスの肝臓から回収した細菌の中から単離 した。６個の異なる表現型復帰突然変異株（Ｃ５１２２からＣ５１２８と命名） は、最大−の毒性を有することが判明した（ＢＡＬＢ／ｃマウスに対するＬＤ５ ｏが２０菌体以下）。バクテリオファージＰ２２同時形質導入により毒性を試験 した６復帰突然変異株すべてについて復帰表現型に関与する遺伝子座のマツピン グを行なったところ、連鎖特性はｔ）ｈ　ｏｆ遺伝子座と一致していたＣ１ｙｕ ｒｌｌへの９０％以上の連鎖）。これらのデータは、これらの復帰変異が細胞外 サプレッサではなく、細胞内サプレッサまたはｐ力ｏ−２４変異の真の復帰突然 変異株であることを示唆している。このように、ＰｈｏＰＣ変異株の毒性欠損は 、）ｙＡｏＰ’遺伝子座における単一の復帰可能な変異の結果であり、変異導入 中に生じた第二の、関連性のない変異の結果ではない。 ＰｈｏＰ０表現型の復帰頻度　復帰によりその株のＬＤ５ｏが低下するか否かを 検ｔｔするために、Ｐ　ｈ　ｏ　ＰＣの、マウスにおけるＩｓ　ｙｊｙｏ復帰頻 度を調べた。Ｃａ ８０２２株の復帰突然変異株の存在は、８匹のマウスに、１０．１０４、及び１ ０２の抗原菌体を投与（ｍ腔注入）することにより試験した。７白目に、１１０ ６ＰｈＯＰＣ体を投与されたマウスが死亡した。その日、すべてのマウスの肝臓 及びひ臓を回収して、生理食塩水中にホモジエナイズした。適当に希釈した後、 組織の１０％を、色原体性のフォスファターゼ基質ＸＰを含有するＬＢプレート にまいた。ＰｈｏＰＣ細菌と比較して青色の薄くなったコロニーのものを復帰突 然変異株と同定し、定量的な酸性フォスファターゼアッセイにより確認した。３ 種の抗原投与用量について、それぞれ各器官につき１０７．１０５、及び１０３ と計算される菌体が回収された。復帰突然変異株は、抗原投与用量の最も大きい マウスにおいてのみ検出され、死亡時の出現率は０．５〜１％、または器官につ き１０５菌体であった。Ｃ３Ｏ２２株はマクロファージ中で十分に生存できない ため（下記参照）、復帰突然変異株は、このようなマクロファージを含有する器 官中でより効果的に増殖の競合を行なうと考えられる。しかし、１０５以下の菌 体による抗原投与を行なった場合、復帰突然変異株は同定されず、これは、復帰 頻度が約１０−５であることを示唆している。事実、ＬＢ培地中で培養されたＣ ８０２２細菌に対するＰ　ｈ　ｏ　Ｐ０表現型の復帰率は、同一のコロニー表現 型により計測した場合、６Ｘ１０’であった。死亡直前の動物から回収した復帰 突然変異株のパーセンテージにより、ＰｈｏＰＣ表現型の復帰突然変異株を選択 する圧力がｉｓ　ｙＪｙθにおいてかかっていることが示唆され、また、復帰不 能なＰｈｏＰＣ変異を有する株に見られる毒性欠陥は量的に、より大きいことが 暗示される。 Ｐｈ、ｏＰＣ株は、マクロファージ中で十分に生存できない　Ｓｓ／ｌｏｊθ／ ｈの毒性において、マクロファージ中での生存性が重要であるため（Ｆｔｅｌｄ ｓ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８６、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　１１３：５１８９．　本発明の参考文献に取り入れられている） 、ＰｈｏＰ０細菌の、マクロファージ中での生存特性を試験した。野生型の菌体 と比較して、Ｃ３０２２株は、マクロファージ中での増殖及び生存が不十分であ る（図１）。図１では、培養マクロファージ中でのＣ３Ｏ２２株（Ｐｈ。 ＰＣ）の生存率（三角）を、野生型、、Ｓ’、　１ｙｐｆｉｉ’ｍｎｔｙｚＡ　 Ｔ　ＣＣ１０４２８の生存率（丸）と比較した。示した実験は代表例である。こ れら２株の４時間及び２４時間における差は顕著である（ｐ＜Ｏ−０５）。Ｐｈ ｏＰ−細菌のマクロファージ生存性欠損は、ＰｈｏＰＣ細菌のものと質的には類 似しているが、同時に行なった実験では、ＰｈｏＰ−細菌は常に２〜３倍よ（生 存した。マクロファージを豊富に含有するマウス器官における、ＰｈｏｎＣ表現 型に復帰した菌体の回収量の増加は、ｉｓ　ｒ）ｌｒｄこおけるＰｈｏＰＣ変異 株のマクロファージ生存性の減少と一致している。 生ワクチンとしてのＰｈｏＰＣ株の使用　ＰｈｏＰ−株が、マウス腸チフスを予 防する生ワクチンとして有用であることは既に報告されている（Ｍｉｌｌｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．５ｕｐｒａ）。ＰｈｏＰＣを、毒性の低下した生ワ クチンとしてマウス中で使用した時の免疫抗原性をＰｈｏＰ−のものと比較した 。段階的用量の２Ｆ！ｉの生ワクチン株（Ｃ３Ｏ１５ＰｈｏＰ：　：Ｔｎｌｏｄ −Ｃａｍ及びＣ５０２２ｔｙ力０−２４、これらと同時に生理食塩水をコントロ ールとして使用した）によりあらかじめ免疫化したマウスにおいて、野生型株Ａ ＴＣＣ１０４２８を用いて１０７の野生型細菌（２００以上の経口野生型Ｌ　Ｄ 　５０）を経口的に抗原投与されたマウスを完全に防御した、（ｉ　ｔ　ｉ）こ れと比較して、ＰｈｏＰ−菌体を大川ｊ１（５Ｘ１０５）投与しても、同様の防 御は得られなかった。Ｃ３０２２株の復帰突然変異株（すなわち野生型細胞）は 免疫原性を増加させる可能性があるため、ＰｈｏＰＣ変異のｉｎ　ｖ＋ｖｏにお ける復帰は、これらの株をワクチンとして使用する場合の解析を多少複雑にする 。しかし、１０　またはそれ以下の菌体を投与されたマウス由来の、入手可能な ひ臓及び肝臓の１０％を調べたところ、復帰突然変異株は同定されなかった。 菌株、材料及び方法 上述の、ＰｈｏＰレギユロン実験に使用した菌株、材料及び方法は以下のとおり である。 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｔ　１ｅｃｔｊｏｎ　（Ａ Ｔ　ＣＣ）株１４０２８　（，５’、　ｔｙｐ／ｄｉｗｉＪのｓｍｏｏｔｈビル レント株）は、すべての毒性実験についての親株である。７７１３２０８株は、 Ｎａｎｇ　ＺｈｕとＪｏｈｎ　Ｒｏｔｈから寄贈された。ＴＡ２３６７株は、Ｇ ｉｇｉＳｔｏｒｔｚと３ｒｕｃｅ　Ａ■ｅｓから寄贈された（Ｋｌｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、＋　１９７９，５ｕｐｒａ）　ｏバクテリオファージＰ２２）（Ｔ　ｊｔ ｙｔは、！、＋０１遺伝子座の変異以外に対して遺伝子的に同質な株を構築する ための形質尋人的交差に使用した（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｌ９８０、　 Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ｐ、　７ｇ、　 ８７．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ盾窒≠狽盾窒凵B Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、本発明の参考文献に取り入れ られている）　６１ｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈは栄養培地として使用し、最少培地に はＭ９を使用した（Ｄａｖｌｓ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８０．５ｕｐｒａ　）。 色原体性のフォスファターゼ基質、５−ブロモ−４−クロロ−３インドリルリン 酸（ＸＰ）は、固体培地における酸性及びアルカリフォスファターゼの定性的評 価に使用した。 ｐ力ｏ−２４異を有する又１ｙｐｆｉ＃ｗｉｔｔｉＡ　Ｔ　ＣＣ１４０２８株派 生体は、Ｃ５０Ｏ３株Δｐ力ｏＰΔｐｕｒＥとのＰ２２形質形質的交差において 、ＴＡ２３６７株を）ｙｕｒＢ遺伝子供与体として用いることにより構築した（ Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔａｌ、、　１９８９．５ｕｐｒａ）。次いで、最少培地上で 生育できるコロニーを選択した。栄養培地中で１，７５０Ｕの酸性フォスファタ ーゼ（栄養培地における野生型レベルの９倍に増加している）を合成する形質導 入法（表現型はＰｈｏＰＣ，Ｃ３Ｏ２２と命名）を以降の実験に使用した。 Ｃ５０２２株及びＣ３Ｏ２３株　ｐ力ｏ−２４ｐ力ｏＮ２　ｚｚｘ：　：　６２ ５１Ｔｎ１０ｄ−Ｃａｍの派生体、及びＣ３Ｏ２２の酸性フォスファターゼ欠損 派生体は、Ｔｎ）ｙｈｏＡまたはＭｕｄＪにコードされたカナマイシン抵抗性に よる選択性を利用して、バクテリオファージＰ２２形質導人的交差により構築し た。これらの株について、ｐ力ｏｐ１θ５：：ＴｎｌＯｄまたはｐ／！ｏＰ１０ ２：：Ｔｎｌｏｄ−Ｃａｍ対立遺伝子の導入に伴う融合蛋白質活性の妥当な低下 を実証することにより、未変化のｐｌｔ遺伝子融合をチェックした。 酸性フォスファターゼ、アルカリフォスファターゼ、及びβ−ガラクトシダーゼ のアッセイは、既に報告されている方法（Ｍｌｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９ ｇ９．５ｕｐｒａ）で行ない、Ｍｉｌｌｅｒ、　１９７２．　Ｅｘｐｅｒｉｍｅ ｎｔｓ　Ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ｐ、　３５２−３５ ５、bｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ、　ＮＹ、（本発明の参考文献に取り入れられている）に 定義されているユニット数で表示した。 マウスの毒性及びワクチン接種実験においては、Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ中で一 晩培養した細菌を洗浄し、通常の生理食塩水を用いて希釈した。すべての生ワク チン抗原投与実験において、Ｃ３Ｏ２２（ＡＴＣＣ１０４２８）の野生型親株を 使用した。何も接種されていない成体ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する、この株の５ ０％致死量（Ｌ　Ｄ　５０）は、腹腔注入の場合２０菌体以下であり、Ｎ　ａ　 ＨＣＯ３中で経口投与された場合５Ｘ１０’である。マウスはＣｈａｒｌｅｓ　 Ｒｌｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＩｅｓ、　Ｉｎｃ、　（ｌ ｆｌｌｓｉｎｇｔｏｎ、　Ｍａｓｓ、）から購入し、初期抗１ｉ投与時は５〜６ Ｊｌであった。すべての腹腔接種は、すでに報告されている方法（Ｍｊｌｌｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９゜５ｕｐｒａ）で行なった。経口による抗原投与は 、ＬＢ培地中で培養し、遠心分離により濃縮した細菌を用いて行なった。胃酸を 中和するために細菌を０．１ＭのＮａ　ＨＣＯＢ中に再度懸濁し、麻酔をかけた 動物に０．５ｍｌ投与した。投与した菌体数を素早く評価するために、コロニー 数を計測した。すべての抗原投与実験は、腹腔接種の１力月後、または経口投与 の６週間後に行なった。ワクチン接種と同じ経路で抗原を投与した。すべての動 物の管理は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ及 びＨａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌの委員会において設定された 規定のガイドラインに従って行なった。 蛋白質の電気泳動は以下のとおり行なった。Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ中で一晩培 養した定常期の細胞から抽出した菌体全蛋白質の一次元量白質ゲル電気泳動は、 Ｌａｅｍａ　ｌ　ｉの方法（Ｌａｅ−■比１９７Ｇ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７： ６８０．本発明の参考文献に取り入れられている）により行なった。１０％酢酸 −１０％メタノール中のクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を用いて、ゲル を固定、染色した。同じ菌体全蛋白質の２次元電気泳動は、０°Ｐａｒｒｅｌ　 Ｉの方法（０’Ｆａｒｒｅ１１．１９７５．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｅｒ、 　２５０：４００７゜本発明の参考文献に取り入れられている）により行なった 。１．５％のｐＨ３゜５〜１０アンフオラインＣＬＫＢ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓ、　Ｂａｌｔｌｍｏｒｅ、　Ｍｄ）を用いた等電点電気泳動は、９，６００Ｖ 　ｈ　（７００Ｖで１３時間４５分）で行なった。最終チューブゲルｐＨ勾配は 、ｐＨ４，１からｐＨ８，１の範囲であった。これは、表面ｐＨ［極（Ｂ［ｏＲ ａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＲＩＣｈｌＯｎｄ、Ｃａ１ｉｆ、　）　、 及び隣接したチューブに流した、着色アセチル化チトクロームｐｌｖ−カー（Ｃ ａｌｂｌｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｌｎｇ。 Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｌｆ、）により測定した。スラブゲルは、銀染色し た（Ｍｅｒｒｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９１１４．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌ、胆虹４４１．本発明の参考文献に取り入れられている）。 マクロファージ生存性アッセイにおける実験は、Ｌｌｓｓｎｅｒ　ａｔ　ａｌ、 の方法（１９１１３れられている）により、既に報告されているとおり（Ｍｉｌ ｌｅｒ　ａｔ　ａｌ、、　１９１１９．５ｕｐｒａ）に行なった。定常期の細胞 を、正常なマウスの血清出で３０分間オプソニン作用を働かせた後、ＢＡＬＢ／ ｃマウスから回収した、培養骨髄由来のマクロファージに接触させた。感染の１ 時間後、硫酸ゲンタマイシン（８μｇ／ｍｌ）を添加して、細胞外細菌を死滅さ せた。すべての時点の操作は３連で行ない、別の時に３回行なった。 Ｐ　ｈ　ｏ　ＰＣ変異株は生ワクチンとして、より効果的であるＰｈｏＰＣ変異 株、５’、　ｔｙｐ／ｒｊｚｗｊｍ＊　、生ワクチンとしてマウスの腸チフスに 対して使用した場合非常に効果的であり、ＰｈｏＰ−細菌よりも優れている。腹 腔経路で接種したわずか１５ＰｈｏＰ　菌体は、野生型菌体の１０　ＬＤ５ｏ（ 致死量５０％）に対し、てマウスを防御した（表３）。これは、１ｙｉｉ遺伝子 産物が、マウス腸チフスに対する防御的免疫における重要な抗原であることを示 唆している。初期的な結果により、慢性腸チフスキャリアの血清に認識される抗 原が、５゜珈１．のｐカθ戸に制御されたある種の遺伝子産物を認識することが 実証された。もし、防御的抗原が宿主中でのみ発現するとすれば、栄養培地中で のみ培養された死滅ワクチンはこれらの蛋白質に対する免疫応答を誘導しない。 、７θルギュロン中に異なる変異を有する、異なる。５’、　ｌｙｐ／ｌ／ｚｔ ｔｒＪｗ死滅ワクチン調製物の使用を検討した。表３に示したとおり、死滅ワク チン調製物はすべて（ｐ力ＯＰ−及びｐ力ＱＰＣ細菌の混合物を含有するものも 含めて）、生菌体はど効果的ではない。これにより、生ワクチンには免疫原性を 増加させる別の特性があるか、またはこれらの調製物中には重要な、ＰｈｏＰに 制御されない抗原が存在しないことが示唆される。実験に供したすべての動物の うち、）ｙＡｏＰ０細菌を用いて免疫化したものに対する抗原投与が最少用量の 場合にのみ、防御が観察された。これによりさらに、ｐｈｏＰ活性遺伝子が重要 な防御抗原であることが示唆される。 ）訃 アミノ酸及びプリン経路中に栄養要求性変異を有する株を、生ワクチンとして使 比較して、より大きく低下する。このため、）ｙｈｏＰレギユロン変異（よ、８ １０人生ワクチンｕｒＪＩ物の安全性をより高くすると思われる。 、！；、ｇ／１ｏｔｙｔｙ／／ｉθｐ分゛　ｐ／！θＰレギニロンの変異Ｐ２２ バクテリオファージ形質形質的交差と同様、Ｓ、　ｔ）’／）／ｌｊ　ＤＮＡハ イブリダイゼーシ可ン実験において、１）ｈｏＰレギニロンが少なくとも部分的 に保存されていることから、）ｙ／ｌｏＰ、βカθＱ１及びβｌｌＣ遺伝子は１ ．９．励と工ｔｙｐ／ｌ＃ｔｔｒｉｗ変異株（５，ｌカψβこれらの遺伝子にお いて変異を有する）の間で良く保存されていることが実証された。 異種抗原の運搬機構としてのＳａｌｇｏｎｅｌ　Ｉａ生ワクチンワクチン運搬機 構に使用したベクターは、ｐＪＭ７０３．１の派生体である（Ｍｌｌｌｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９ｇＬ　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　ＬγＯ：２５７５．本発明の参考 文献に取り入れられている）。このベクターはβｊ’ｆ遺伝子中に欠失を有する Ｒ６に派生体である。 Ｒ６に派生体は、複製にｌ）ｌ’ｆ遺伝子の蛋白質産物と必要とする。ラムダバ クテリオファージ　プロファージとして存在するβｊ’ｆ遺伝子を存する大腸菌 は、このベクターの複製を行なわせることができる。ρｌ′ｒ遺伝子を有しない 細胞中では、このベクターをはプラスミドとして複製することができない。この ベクターはＲＰ４のｍ０々領域も有し、これにより、５Ｍｌ０ラムダ　ρｉｒ（ トランスにおける起動機能を供給する）のような大腸菌株から、交配により他の グラム陰性細菌への起動が行われる。 図２及び３に、ｏｉｚｃ領域を示す。図２は、）ｙｚｚｃ遺伝子座の制限酵素切 断地図を示す。太線はβＺＺＣコーディング配列を示す。Ｔｎｐ／ｌｏＡ挿入は 逆三角形で示す。転写方向は矢印で示し、図中では左から右の方向である。数字 （ｐｚｚ　Ｃの推定開始コドンを起点とした塩基対の数）は制限酵素部位の位置 を示し、正の数字は開始コドンの下流、負の数字は開始コドンの上流を示す。Ａ はＡ　ｃ　ｃ■、Ｂは１１ｆ／Ｅ、ＣはＣ／ｚｌ、ＤはＤｒｉｌ、ＥはＡ：’ｃ ｏＲＥ、Ｈはｉｐ、ｇｆＳＮはｊＶｒｕｒＳＰはｐｓｔｌ、Ｓは５ｚｐｌ、Ｔは ５ｔｕ１％Ｕは／　ｙ　ｔｔ　Ｉｒ、ｖはＥｃｏＲＶ、ＩＩはＥｆＢＩを示す。 図３はＤＮＡ配列（配列番号：１）及び）ｙｉｇｃ　：　：　ＴｎｐｈｏＡの翻 訳を示す。太い下線の配列は、潜在的なりボゾーム結合部位を示す。細い下線及 び細い二重下線は、ＲＮＡ解析のプライマー伸長における塩基に相補的なプライ マーを構築するのに用いた配列を示す。 星印は、おおよその転写開始点を示す。矢印は、転写方向を示す。四角で囲んだ 配列は、ポリメラーゼの結合及び認識において機能する領域を示す。逆三角形は 、配列決定されたＴｎｐｈｏＡ挿入連結部位を示す。矢印は、潜在的な一つの配 列切断（ｓｉｎｇｌｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｌｅａｖａｇｅ）部位を示す。 り　Ｊ　ｚ　Ｃ遺伝子を有する３キロベースのＤＮＡ（ｐＨｃｗ４訳開始点の５ ゛側１５００塩基のＰｓｔｌ切断部位から、ｐｔｒｚｃ翻訳終止点の下流１５８ ５塩基のＥｃｏＲＩ切断部位まで）を、上述のｐＪＭ７０３．１派生体に挿入し た。Ｃ１１Ｌ切断部位以降のβＪ／Ｃ配列（４９０塩基）を欠失させ、−か所ず つの制限酵素切断部位を有する合成オリゴヌクレオチドポリリンカーに置換した 。一つまたはそれ以上の異種蛋白質（例えば、抗原）をコードするＤＮＡをこの 部位に挿入することができる。これにより、り　１　ｆ　Ｃを取り囲むＤＮＡに 複数の外来遺伝子を挿入できるベクターを構築することができる。 交配または他のいかなる運搬機構（例えば、熱ショック、バクテリオファージ形 質導入またはエレクトロポレーション）によっても、このベクターを、ｆｉ／ｚ ｏｔｙθ／／沖に起動することができる。このベクターは複製ができないため１ ．５”ｉ／ｌｏｎθ／／７へのベクターの挿入は、双方のｐｚｚｃ遺伝子上の相 補的ＤＮＡにおける部位特異的組み換えによってのみ行なうことができる。これ により、元のｔｙｉｉｃ遺伝子座は破壊及び不活性化され、ベクター上の破壊さ れたｐｚｚｃＤＮＡと置換される。 このような組み換えは、外来ＤＮＡの１ｙｔｒｚｃ遺伝子座への挿入により生育 が促進される場合、マーカー交換及び選択培地により同定することができる。選 択のため抗生物質抵抗性遺伝子を挿入することはあまり望ましくない。なぜなら 、元の細菌集団の抗生物質抵抗性を増加させる恐れがあるからである。形質転換 株の同定には、抗生物質以外の物質、例えば、重金属または砒素（水銀抵抗性に 関しては、Ｎｕｃｉｆｏｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｂａｃｔ、 、　１７１：４２４１−４２４７、本発明の参考文献に取り入れられている、を 参照）に対する抵抗性を付与する遺伝子を使用することができる。その他の方法 として、代謝経路中に栄養要求性変異を有する受容体、！；ｉ／１ｒｏｔｙθ／ ／７　株、及びこの栄養要求性変異を相補するＤＮＡを有するベクターを用いて 選択を行なうこともできる。多くのＳｓ／ｌｏｊθ／／ｒ生ワクチンの原型は、 ヒスチジンまたはプリン経路中に変異を有するため、これらの代謝栄養要求性の 相補性を、挿入物の選択に使用することができる。（プリン変異は、ヒトにおい て使用する場合、毒性が低下し過ぎることが特異的に示されている。）マーカー 交換は、アンピシリン抵抗性（プラスミドの中心部分に含有されている）の欠損 またはプロットハイブリダイゼーション解析により、さらに証明することができ る。 選択に有用な遺伝子は、代謝栄養要求性を有するワクチン株の相補によりクロー ニングすることができる。特異的な例として、）ｙｕｒｌ！及び）ｙｈｏｐの両 方の遺伝子の機能を欠損した株を相補することによる、これら両方の遺伝子をコ ードするＤＮＡのクローニングなどがある。ｊ；ｉ／＃７θ／／ｌ遺伝子ライブ ラリーは、当業者に既知の方法で、ｐＬＡＦＲコスミドベクター（Ｐｒｌｎｄｂ ｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４゜Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｓ、　１３７： ２６Ｂ−２６７、本発明の参考文献に取り入れられティる）中で作製することが できる。ｐＬＡＦＲコスミドは広範囲の宿主に適応するプラスミドであり、大腸 菌から、９ｉ／＃Ｉ７θ／／７　に起動される。このような株のライブラリー全 体を、９ｉ１ｚｏｊθ／ｈワクチン株に起動し、栄養要求性欠損の相補性（例え ば、ｐｕｒｊの場合、アデニン非含有培地中での生育）により選択を行なうこと ができる。 次いで、この欠損を相補することのできるＤＮＡを同定し、抗原運搬ベクターに クローニングすることができる。 上述のとおり、ポリリンカー（ベクターのβｌｌＣ配列中に挿入されている）に 異種遺伝子を挿入することができる。これらの異種遺伝子を、環境に調節される 多くのプロモータ機構（宿主中で発現し、研究室内で遮断することができる）の 制御下に置くことができる。異種蛋白質、特に膜蛋白ｇ！（最も重要な抗原とし ての）は、細菌に対して毒性を有することが多いため、哺乳類組織中で高発現す るが研究室内で異種抗原を発現せずに菌体が生育できるような、環境に調節され るプロモータを使用することが大変望ましい。さらに、宿主組織中での抗原の高 発現により、菌体の代謝の栄養源が異種蛋白質の合成へと振り向けられるため、 菌体の毒性低下が助長されることもある。外来抗原が宿主の病理細胞中で特異的 に発現される場合、これらの細胞は抗原のプロセシングに関与する細胞であるた め、これら蛋白質に対する免疫応答が増加する可能性がある。 有用と思われるプロモータ機構には、栄養素により調節されるプロモータ機構（ このプロモータ機構に特異的な栄養素は哺乳類宿主中で細菌に供給されないこと が実証されている）が含まれる。プリン（Ｓｉｇｖａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８９．　Ｉｎｆｅｃｔ、　１ｍ５ｕｎ、、　５７：１ｇ５ｇ　）及び鉄（Ｆｌ ｎｋｌｅｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、 　Ｄｌｓ、　■T７ ５９）などは宿主中で供給されない。鉄により制御されるプロモータ（ａｅｒｏ ｂａｃｔｔｎ遺伝子プロモータなど）及びプリン経路における生合成遺伝子に対 するプロモータは、高濃度のこれらの栄養素中での生育により遮断されるプロモ ータの候補として最適である。他の有用な、環境に調節される力々〃θ／／ｆｊ ロモータには、マクロファージ中に特異的に発現される蛋白質をコードする遺伝 子（例えば、ＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬ蛋白質、これらは高温培養時に増加する、 及びある種のβ力ｏＰ活性化遺伝子産物、Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９９０．５ｃｆｅｎｃｅ　虱７３０．本発明の参考文献に取り入れられてい る）に対するプロモータが含まれる。このため、！ｊｚｃ５−制御配列、及び熱 シヨツク遺伝子（例えば、ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫ）に対するプロモータのよう なプロモータは、マクロファージ中で特異的に活性化されると思われる。マクロ ファージは抗原をプロセシングする部位であり、マクロファージ中での熱シヨツ ク遺伝子の発現及び自然界における熱シヨツク遺伝子の広範囲な保存により、こ れら蛋白質の免疫優位性が説明される。コンセンサスな熱シヨツクプロモータ配 列は既知であり、ベクター中で使用することが可能である（Ｃｏｖｌｉｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ［、Ｕ ＳＡ　８２：２Ｂ７９．本発明の参考文献に取り入れられている）。 異種蛋白質を発現するためのベクターには、環境に制御されるＴ７ポリメラーゼ 増幅機構が含まれる。例えば、鉄に制御されるプロモータの制御を受けているＴ ７ボリメラーゼ遺伝子（Ｓｔａｎ　Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｌ ｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔ。 ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄ、＾ｕｓｕｂｅｌ 　ｅｔ　ａｌ、＋　１９１１９．（ｐａｇｅ　３．５．１．Q）　Ｊｏｈｎ　Ｗ ｌｌｅＹ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、本発明の参考文献に取り入れられている、参照） を、上述のベクター上に含有することができる。我々は、ＣＡＴＴＴＣＴＣＡＴ ＴＧＡＴＡＡＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡ ＴＴＴＴＡＣＧ（配列番号：２）の配列を有する大腸菌のａｅｒｏｂａｃｔ　１ 　ｎ遺伝子プロモータ（Ｄｅｌｏｒｅ７ボリメラーゼ遺伝子の上流に挿入し、鉄 による遺伝子産物の制御を行なった。 ベクターのこの変形物は、Ｔ７ポリメラーゼブロモータの制御下に、一つまたは それ以上の異種抗原を含むこともできる。ＲＮＡが、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成オ リゴヌクレオチドエフプロモータ及び精製Ｔ７から合成されることはよく知られ ている。 菌体に低濃度の鉄を接触させると、Ｔ７ポリメラーゼが合成され、Ｔ７ブロモー タにより遺伝子の高発現が促進される。 解析には、以下の菌株、材料、及び方法を使用した。 栄養培地にはＬｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ　（ＬＢ）　、最少培地にはＭ９　（Ｄａ ｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０、５ｕｐｒａ　）を使用した。、９．９７ｙ ｉｌｚｔｔｒｈｔｚ　株Ｃ８１１９ｐｚｚｃｌ：：Ｔｎ）ｙｈｏＡ　ｐ力ｏＮ２ 　ｚｘｘ　：　：　６２５１Ｔｎ　１０ｄ−ｒｉｍの構築は既に報告されている （Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８９．５ｕｐｒａ）　６　Ａｓｅｒｆｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｔ＋１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅモ狽■ ｏｎ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ）　、５’、　ｔｙｐｌｔｊｚｗｊｗ株１０４２８にはＣ ３Ｏ１８（ｐ力ｏＰ１ρ５：：Ｔｎｌθｉ以外はＣ３１１９と遺伝子的に同質） 　（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８９．５ｕｐｒａ）、Ｃ３Ｏ２２ＡＩ 力ｏ　−２４（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ、　１７２：２４８５−２４９０．本発明の参考文献に取り入れられて いる）、及びＣ３Ｏ１５ｐＡ。 Ｐ２Ｏ３：　：　Ｔｎ　１０ｄ−ｃ　ａｍ　（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　 １９８９．５ｕｐｒａ）を含む。染色体ＤＮＡの調製に用いた他の野生型株には １，５’、　珈／ｚｗ、／１ｔｚＬ　Ｔ　２　（Ａ　Ｔ　ＣＣ１５２７７）　１ ．５’、　ｌｙ、ｏｉｌ／ｍｒｊｗＱ　１及び、５’、　／ｒｙｔｐｏｏ／　（ Ｄｒ、　Ｊ、　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｕ、　sｅｘｈｓ Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｒａｎｃｈ、　Ｇａ１ｖｅｓｔｏｎ）　、及びＳｓ／ｎｏｗ ／／ｉ　／／／／７／　Ｔ　ｙ　２　（Ｄｒ、　Ｃａｒｏｌ@ｊｎｅ Ｈａｒｄｅｇｒｅｅ、　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔ ｉｏｎ）が含まれる。ｐＬＡＦＲコスミドは、ｐＲＫ２０１３を含有する大腸菌 株ＭＭ２９４を用いて、大腸菌から、５’、　ｔｙｐ／ｌｊｉｗｊｍこ起動され た（Ｆｒｉｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ｇ２．　Ｇｅｎｅ　１８：２８９ −２９８．本発明の参考文献に取り入れられている）。アルカリフォスファター ゼ（ＡＰ）活性は、固体培地において、色原体性のフォスファターゼ基質、５− ブロモ−４−クロロ−３インドリルリン酸（ＸＰ）を用いて行なった。ＡＰアッ セイはすでに報告されているとおりに行ない（Ｂｒｉｃｌｖａｎ　ｅｔ　ａｔ、 、　１９７５．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｔ、　９Ｂ：３０７−３１６．本発明 の参考文献に取り入れられている）　、Ｍｉｌｌｅｒにより定義されたユニット 数で表示した（Ｍｉｌｌｅｒ、　１９７２．５ｕｐｒａ、　ｐｐ、　３５２−３ ５５）。 −次元蛋白質ゲル電気泳動は、Ｌａ５ｓｓ　Ｉ　ｉの方法（Ｌａｅｓｍｌｉ、　 １９７０．　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０、本発明の参考文献に取り入れられ ている）により行ない、すでに報告されている方法（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　ｅｔ　 ａｔ、、　１９１１１１．　Ｉｎｆｅｃｔ、　１ｍ５ｕｎ、　５６：２ｇ２２− ２８２９．本発明の参考文献に取り入れられている）に従い、ＡＰ抗体を用いた プロットハイプリダイゼータ５ンを行なった。細胞を５ＤＳ−１ｙｉｚＥサンプ ルバツフア（Ｌａｅｓｍｌｉ、　１９７Ｑ、　５ｕｐｒａ）中でボイルすること により、ＬＢ培地中で３７℃で通気しながら飽和状態まで培養した菌体から菌体 全蛋白質抽出物をＸｌｌ！！Ｌ、た。２次元電気泳動は、０°Ｆａｒｒｅｌ　Ｉ の方法（０°Ｆａｒｒｅｌｌ、　１９７５．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２ ５虹４００７．本発明の参考文献に取り入れられている）により行なった。１０ ％スラブゲル中の蛋白質は、銀染色（Ｍｅｒｒｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４ ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ吐１０虹４４１．本発明の参考文献に取り入れ られている）により検出した。 染色体ＤＮＡは、Ｍｅｋａｌａｎｏｓの方法（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ、　１９１１ ３．　Ｃｅ１１．３５：２５３−２６３．本発明の参考文献に取り入れられてい る）により調製した。アガロースゲル中で大きさを分画したＤＮＡを、５ｏｕｔ ｈｅｒｎの方法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　１９７５．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ 、　９１ｔ：５０３−５１７．本発明の参考文献に取り入れられている）により ニトロセルロースに転写した（プロットハイブリダイゼーションのため）。５ｏ ｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーシヨン解析用のＤＮＡプローブは、ランダムプラ イマー法（Ｐｒｌｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｔ、。 １９１１４、５ｕｐｒａ）により放射４１［Ｅｉｌした。プラスミドＤＮＡによ る大腸菌及びｊ；’ｉ／ｚｏｔｙｅ／／ｊの形質転換は、塩化カルシウム及び熱 ショック（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ、　１９８３．５ｕｐｒａ）によるか、またはＧ ｅｎｅｐｕｌｓｅｒ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　（Ｂ！ｏｒａｄ、　Ｒ［ｃｈｍｏｎ ｄ、　Ｃａ、）を用いて製造者の勧める方法チェレフトごボレーシ３ン（Ｄｏｗ ｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　１９８１１．　ＮｕｔＪ、　Ａｃｔｄｓ　Ｒｅｓ、　 １６：６１２７−８１４５．本発明の参考文献に取り入れられている）により行 なった。ＤＮＡの塩基配列は、シーケナーゼ（Ｕ、Ｓ、　ＢＩｏｃｈｅ＊１ｃａ ｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ　）を使用するように修正したダイデオ キシチェインターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　？４：５４６３− ５４６７、本発明の参考文献に取り入れられている）により行なった。オリゴヌ クレオチドは、ＡｐｐＨｅｄ　Ｂ１ｏｓｙｓｔｅ■ｓ　Ｍａｃｈｉｎｅを用いて 合成し、シーフェンシング反応及びＲＮＡのプライマー伸長法のプライマーに使 用した。Ｔｎｐ力ｏＡの２つの末端に特異的なプライマー（１つはアルカリフォ スファターゼをコードする配列に対応し、もう１つは右の！Ｓ５０配列に対応し ている）は、トランスポゾン挿入の連結部の塩基配列決定に使用した。 ｐＬＡＦＲ中でのＪ’、　ｊｙｔｙｉｌｍｒｊｔｔｔ：ｊスミド遺伝子バンクの 構築及び野生１１　ｐ　、ｔｌＣＤＮＡを含有するクローンのスクリーニングは 以下のとおり行なった。、９．ｌ、ｒｐ／ｎ７ｗｊｔｔｉ株ＡＴＣＣ１０４２８ 由来のＤＮＡを、制限酵素Ｓ　ａ　ｕ　３Ａを用いて部分分解し、１０〜４０％ シコ糖密度勾配により大きさを選択した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、２０〜 ３０キロベースの大きさの染色体ＤＮＡを、制限酵素ＢｚｍＨＩで消化したコス ミドベクターｐＬＡＦＲ３（ｐＬＡＦＲｌの派生体、Ｐｒｌｅｄｍａｎ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８２．　Ｇｅｎｅ　Ｌｌｌ：２８９−２９８．本発明の参考文献 に取り入れられている）に連結した。コスミドベクターをパッケージングし、Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｓ。 しａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａから購入した抽出物を用いて大腸菌株ＤＨ５−αに感 染した。プロットハイブリダイゼーション解析により、コロニーをスクリーニン グした。 クローニングしたＤＮＡからｌｎ　ｖｉｔｒｏ転写／翻訳アッセイにより生産し た蛋白質の解析は以下のように行なった。これらのアッセイは無細胞抽出物（Ａ 鳳ｅｒｓｈａ■、　Ａｒｔ！ｎｇｔｏｎ　！（ｅｌｇｈｔｓ、　ｌ１ｌｌｎｏｌ ｓ　）を用いて行ない、製造者により示された条件に従って行なった。その結果 得られた放射標識された蛋白質は、５ＤＳ−ｐｉｔＥにより解析した。 ＡＮＡは、対数増殖期初期及び定常期の、５’ｉ／ｚｔｙｍ／／Ａ養物からホッ トフェノール法（Ｃａｓｅ　ａｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｇｏｎｅ　７２：２ １９−２３８、本発明の参考文献に取り八れられている）により抽出し、アガロ ース−ホルムアミドゲルに流してプロットハイブリダイゼーション解析を行なっ た（Ｔｈｏｍａｓ、　１９１１０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃ１．　ＵＳＡ７７：５２０１．本発明の参考文献に取り入れられている）。Ｒ ＮＡのプライマー伸長解析は、ＡＭＶリバーストランスクリブターゼ（Ｐｒｏ＊ ｅｇａ、　１４ａｄｉｓｏｎ、　Ｖｉｓｃｏｎｓｉｎ　）及び合成オリゴヌクレ オチドブライマー（βＪ／Ｃ遺伝子座の３３５〜３５０及び５５０〜５６５に相 補的）を使用して、既に報告されている方法（Ｍｉｌｌｅｒ　ａｔａｌ、、　１ ９１１６．　Ｎｕｅ、Ａｃｔｄｓ　Ｒｅｓ、　１４ニア３４１−７３６０．本発 明の参考文献に取り入れられている）により行なった。 、５’、　ｌ麿／ｚｔｔｒ／ｌｔａのｐｔｚ、ｙＣ変異株において欠損している １８ｋＤａ蛋白質の同意　βＪ　／　（Ｔ変異株Ｃ５１１９株を２次元蛋白質電 気泳動により解析して、Ｔｎｐ力θＡ挿入の結果欠損すると思われる蛋白質種を 検出した。トランスポゾン挿入以外は遺伝子的に同質な株についてこの解析を行 なったところ、１種類の蛋白質のみ（約１８ｋＤ、ｐｌ−８，０）が欠損してい た。ｐ力０Ｐ及びｐ力ｏＱ変異を有する５’ｉ／ｌｏｊθ／／７　株について同 様の解析を行なったところ、やはりこの１８ｋＤの蛋白質が欠損していた。２次 元蛋白質電気泳動ではＣ３１１９株中で発現する蛋白質の小さな変化を検出する ことはできないが１．ｖｉｚｃ　：　：　Ｔｎ　ｐ力ｏＡ挿入の結果として単一 の主要蛋白質種が欠損することが示唆された。 さらに２次元ゲル解析を行なったところ、ｐｒｚｃ−ＡＰ融合蛋白質と思われる 約４５ｋＤａの新しい蛋白質種が検出された。、ｏｉｚｃ−ＡＰ融合蛋白質を、 ＡＰに対する抗血清を使用したウエスタンンプロット解析によっても解析した結 果、大きさは天然ＡＰとほぼ同様（４５ｋＤａ）であり、ｐ力ｏｐ−，５’−ｔ ｙ）ｙＭｚｔｔｒｊｖｉにおいては発現しないことが判明した。 ｐｚｚｃ　：　：　Ｔｎｐ力ＯＡ挿入のクローニング　ｊ？、　ｌｙ、ｔｙ／ｄ ｚｔｔｉブｔｔＡＳ１１９株から染色体ＤＮＡを調製し、Ｔｎｐ力０ＡのＤＮＡ 断片をプローブとしたプロットハイブリダイゼーション解析により、）ｙｚｚｃ ：：Ｔｎｌ）力ｔ）Ａ融合領域に赴１ける簡単な制限酵素切断地図を作成した。 この解析から、制限酵素ｅｃｏＲＶにより消化すると、）ｙｉｚｃ　：　：　Ｔ ｎｐ力０Ａ挿入（及び隣接する数キロベースのＤＮＡ）を含有する単一の断片が 得られることが示唆された。Ｃ９１１９株由来の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＶＣ平 滑末端）により消化し、制限酵素、９／７７ＪＩ（平滑末端）で消化した細菌性 プラスミドベクターｐ　Ｕ　Ｃ１９（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏｌａｂＳ ）に連結した。エレクトロポレーションにより、このＤＮＡを大腸菌ＤＨ５−α 株（ＢＲＬ）に導入し、抗生物質カナマイシン（Ｔｎｐ力０Ａにコードされてい る）及びアンピシリン（ｐＵＣ１９にコードされている）を含有するＬＢ寒天培 地にコロニーをまいた。アンピシリン及びカナマイシン耐性のクローン１株（ｐ ＳＭｌｏｏと命名されたプラスミドを含有する）を選択し、以降の実験に供した 。 ｐｓＭ１００由来の放射標ＥＩＤＮＡプローブを構築し、）ｙｉｚｃ　：　：Ｔ ｎ　ｐ／２ａＡ融合物がクローニングされたことを証明するために、Ｃ３１１９ 株及びその野生型親株ＡＴＣＣ１０４２８について５ｏｕｔｈｅｒｎハイブリダ イゼーシヨン解析を行なった。プローブは、トランスポゾンに直接隣接する（ア ルカリフォスファターゼ遺伝子と反対側）配列を含有していた（制限酵素１ｆ） ｙ　Ｊ　Ｉにより、トランスポゾンの右１５５０の１８６ベース及び、９Ｊ／＃ ＋７θ／／７Ｄ　Ｎ　Ａの１２７８ベースを含む断片が生成する、図２）、予期 したとおり、ｐｓＭ１００由来のプローブは、トランスポゾン挿入を存する株（ Ｃ３１１９）由来の１１〜１２キロベースの制限酵素Ａｃｃｌ消化ＤＮＡ断片に ハイブリダイズした。これは、野生型株に存在する、プローブにハイブリダイズ する３、９ｋＢ　Ａｃｃｌ断片よりも、約７゜７ｋｂ　ＣＴｎ）ｙＡｏＡの大き さ）大きい。さらに、プラスミドｐｓＭ１００の派生体ｐｓＭ１０１　（）ｉｃ プロモータなしでｐ７７ｃ　−Ｐ　ｈ　ｏ　Ａ遺伝子融合体を発現しない）によ り）ｙｈ　ｏＰ　（Ｃｓ　１１５株）及び）ｙＡｏＮ（Ｃ８０１９株）　、５’ Ｊ／ｚｏｉｙｅ／／ａ株を形質転換したところ、クローニングされたＡＰ活性の 発現はｐ力０１依存性であることが判明した。このことより、クローニングされ たＤＮＡには）ｙｉｔｚｃ　：　：　Ｔｎ　Ｊ）力ｏＡ融合体が含まれていると 結論づけた。 又珈ｌ及び工叱グ〃／と同様、他の５’、　！ｙｐ／ｄｚｔｉｉプｎ株において も）ｙｉｔｚｃ遺伝子が存在することが証明された。検討したすべての５１々〃 θ／、／Ｊ株において、８゜ＯｋｂのＡ−ｃｏＲＶ制限酵素消化断片及び３．９ ｋｂのＡｃｃｉｌ制限酵素消化断片が同様の強いハイブリダイゼーションを示し 、これにより％Ｊ）ＩｆＩＣが力／ｌ〃θ／／７種に共通の毒素遺伝子であるこ とが示唆された。 ヌクレオチド−４６（メチオニンの１番目の塩基を１とする）から８０２　ＣＰ ５／１部位から１１，１１１１部位）から成る）ｙｚｚｃ遺伝子プローブは、α ｌｌｙＪｉｃ１２０／ＩＩＩム及び／／＃ｓｊθ／／ｌｔ　／／７θｗｏｉｙｊ ｉ　由来のＤＮＡとはハイブリダイズしなかった。 野生型ｐｉｚｃ遺伝子座ＤＮＡのクローニング及びそれによる、５’、　ｔｙｐ Ｊｊｚｔｔｒ、／ｗＺＺＣ変異株の毒性欠陥の相補　上述と同じ制限酵素断片を 用いて、野生型株ＡＴＣＣ１０４２８のコスミド遺伝子バンクをスクリーニング した。１つのクローン（ｐｗｐ０６１と命名）は、１８キロベースの、９．ｌｙ ＭｚｔｔｒｊｖＡＮＡを有し、ｐ、ｒｚｃＤＮＡプローブに強くハイブリダイズ した。制限酵素解析及びプロットハイブリダイゼーション解析により、ｐＷＰＯ ６１は、ｐｓＭｌｏｏと同一のＳ、　ｔｙｐｌ／ｚｔｔｎ’＃ＤＮ　Ａを有する ことが判明した。ｐＷＰ０６１由来のプローブを用いて、野生型及びＣ３１１９ ，５’、ひｐＨｌｌｈプＪ由来のＤＮＡのプロットハイブリダイゼーション解析 も行なった。ｐｓＭｌｏｏにおいて見られたのと同一のハイブリダイゼーション パターンが観察された。ｐＷＰＯ６１も、Ｃ８１１９株ＣｔｙｉｉＣ変異株）中 に起動した。その結果得られた株は、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに対して野 生型同様の毒性を有した（腹腔注入により投与した場合、ＬＤ５ｏは２０菌体以 下）。このため、クローニングされたＤＮＡは、ｌ”ｆＣ変異株の毒性欠陥を相 補した。 ｐｔｒｚｃ遺伝子座を含有する野生型コスミドがｐｉｚｃ変異、９．９ｔｐ／Ｗ ｚｔｕゾＵ株の毒性欠陥を相補することが判明したため、）ｙｉｇｃ蛋白質は、 １８８アミノ酸（１８ｋＤａ）から成る、マクロファージ中での生存及び、５’ 、　ｔ）ｔｐ／Ｖｚｕｒ／ｗの毒性に必須の膜（下記参照）蛋白質であると結論 した。 制限酵素地図、ＤＮＡ塩基配列決定、及びβＺＺＣ遺伝子産物の決定　ｔｙｉｉ Ｃ遺伝子座の制限酵素地図を作成するため、また、ｐｓＭｌｏｏについては転写 方向を決定するために、プラスミドｐｓＭ１００及びｐｗｐ０６１の制限酵素解 析を行なった（図２）。ＤＮＡサブクローンを作製し、ＴｎｐカｏＡ融合連結部 及び、Ｓｓ／ｐｏｐｅ／／ｉＤ　Ｎ　Ａ　（ｐ力ｏＡ融合連結部の５′側８２８ 塩基のＨ）ｏ　Ｊ　１部位から、Ｔｎ７＞力ｏＡ挿入の３′側１０３２塩基のＡ −ｃｏＲ１部位）の塩基配列を決定した（図２及び３）。活性型ＡＰ遺伝子融合 体を合成するのに必要な、ＤＮＡ配列の正しいリーディングフレームが推定され た。このオープンリーディングフレームから推定されるアミノ酸は、１８８アミ ノ酸から成る、ｐＩ＋８．２の蛋白質であることが推定された。このデータは、 ｐｔ約＋８．０の１８ｋＤａの蛋白質が欠失していることを示すＣ３１１９株の ２次元ポリアクリルアミドゲル解析と一致する。３０アミノ酸より大きいペプチ ドをコードすると推定される他のオープンリーディングフレームは認められなか った。 １８８アミノ酸オーブンリーデイングフレームの、推定されるアミノ酸配列は、 ｐ、ｔｚｃ及びＡＰの融合から３３アミノ酸にメチオニン開始コドンを有する（ 図３）。この３３アミノ酸のｐｒｉｚｃにより、融合蛋白質は、ウェスタンプロ ット解析で見られる大きさと一致し、Ｎ末端に疎水性領域（Ｋｙｌｅ　ｅｔ　ａ ｔ、、　１９１ｉ２．　Ｊ。 Ｈｏｔ、　Ｂｌｏｔ、　１５７：１０５−１３２．本発明の参考文献に取り入れ られている、の方法により同定）が付与される。この疎水性Ｎ末端領域は典型的 な細菌性シグナル配列である（Ｗｏｎ　Ｈｅ１ｎｊｅ、　１９８５．　Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｌｏｔ、　１８４：９９−１０５．本発明の！考文献に取り入れられ ている）。特徴的に、２番目のアミノ酸は、正に荷電したリジンであり、その後 に疎水性領域が続き、２４番目のアミノ酸は、負に荷電したアスパラギン酸残基 である。このリーダー配列のコンセンサスな切断部位は、２３番目のアミノ酸の アラニン残基と推定される（Ｙｏｎ　Ｈｅ１ｎｊｅ、　１９１１４．　Ｊ、　Ｎ ｏｔ、　Ｂｌｏｔ、　１７３二２４３−２５１、本発明の参考文献に取り入れら れている）。ＤＮＡ配列から、典型的なりボゾーム結合部位（Ｓｈｌｎｅ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９７４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　Ｕ Ｓ＾７１：Ｌ３４２−１３４８、本発明の参考文献に取り入れられている）が、 推定翻訳開始点の５−側６〜２塩基（図３の塩基７１７〜７２３）にあることが 判明した。これにより、オープンリーディングフレームが実際に翻訳されること が示唆され、また、この配列が、Ｔｎ）ｙｈｏＡ挿入により中断されたβｉｚＣ 蛋白質の推定アミノ酸配列であることという仮定を支持している（図３）。 クローニングされたｐｉ♂Ｃ遺伝子座による蛋白質のＩＩｌ　ｖ＋ｔｒｏ合成　 ）ｙｙｚｃにより他の蛋白質がコードされていないかを検出し、また、ｐＪ　ｊ ’　Ｃ遺伝子産物のおおよその大きさを決定するために、ｈｙ　ｙｊｌｒｔの連 結した（ｃｏｕｐｌｅｄ　）転写／翻訳アッセイを行なった。ｐｗｐ０６１の５ ．３キロベ一スＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１９に挿入し、ｐｌｉＣｌ低Ｃを／ｉｃ プロモータなしでは発現しないようにした。このプラスミドを、１ｊｙｉｖｔの 連結した転写／翻訳アッセイに使用した。 無細胞系において、約２２キロダルトンの単一の蛋白質が合成された。この太き さは、リーダーペプチドを含むｐｉｚｃ蛋白質の前駆体の大きさと一致した。こ れらのデータは、単一なβ、ｙｚＣ，遺伝子産物が同定されたことを、さらに支 持している。 ｐｉｇｃによりコードされたＲＮＡの同定　約１−１００塩基のＲＮＡが、ρｄ ／Ｃにコードされている。ｐｘ、１７Ｃ遺伝子は、野生株及び）ｙ／ｙｏＰ−細 菌７と比較して１．ｃｔｉ、ｒ活性化のｐ力ｏＰ構成的表現型を有する細胞中で 高発現される。プロットハイブリダイゼーション実験において、培養定常期では 、ｐｉｇｃは、栄養培地中で培養した野生型細胞中にのみ検出された。この結果 は以前の研究（Ｘｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．５ｕｐｒａ、　Ｍｌ ｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９９０．５ｕｐｒａ）と併せて、ｐｉｇｃがｐ力 ｏＰ遺伝子産物により制御されており、ｐ力ｏＰ構成的表現型を有する細胞にお いては、対数増殖期初期（栄養培地中）にのみ発現されることを実証している。 ｐｉ、ｇｃ転写物の大きさは、１８８アミノ酸から成る蛋白質をコードするのに 必要な大きさより約５００塩基大きい。おおよその転写開始部位を決定し、これ らの塩基が１８８アミノ酸から成るｐｚｚｃ遺伝子産物の５゛または３′のいず れに転写されてるのか決定するために、βｉ７ｃ配列に特異的なオリゴヌクレオ チドブライマーを使用して、Ｓａｔ／ｚｏｊθ／／７ＲＮ　Ａのプライマー伸長 解析を行なった。 ｐｉｇｃの塩基５５０〜５６５（推定開始コドンから１５０塩基５′側）に相補 的と推定されるオリゴヌクレオチドを用いてプライマー伸長解析を行なった結果 、約３００塩基のプライマー伸長産物が得られた。このため、より上流のプライ マー（βＪ／Ｃの塩基３３５〜３５０に相補的）を構築し、同様の解析を行なっ た。 プライマーに特異的と思われる１８０塩基のプライマー伸長産物が認められた。 これは、塩基１７０から始まる転写と一致した（図３）。推定転写開始点の上流 に（塩基１５３〜１６０）、古典的なＲＮＡポリメラーゼ結合部位（−１２塩基 に′ｒ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔの配列、及び−１０塩基にＴＡＡＴＡＴの配列）が 認められた。 −１０領域から１５〜２１塩基上流において、コンセンサスＲＮＡポリメラーゼ 認識部位（ＴＴＧＡＣＡ）と完全に一致する配列は見られなかった。−３９（１ ２６〜１３１）塩基（ＴＴＧＧＡＡ）　、−３８（１２７〜１３２）塩基（ＴＴ ＧＴＧＧ）　、及び−２５（１３５〜１４０）塩基（ＴＴＧＡＴＴ）は、この配 列の最も高頻度に保存されている塩基と一致する配列である。 上述の結果に基づき、転写は、１８８アミノ酸から成る蛋白質の翻訳終始コドン （塩基１２９５、図３）の近傍で終結すると推定される。実際、塩基１３０９〜 １３３０にステムループ構造が見られ、これがターミネータとして機能する可能 性がある。これは、１８８アミノ酸から成る蛋白質の下流にオープンリーディン グフレームの形跡が認められないこと、及びクローニングされたｐｉｚｃ　ＤＮ Ａを用いて他の転写／翻訳産物が合成できないことと一致する。これは、ｐ７ｚ ｃ　：　：　Ｔｎ、ｐｈｏＡ挿入が単一の蛋白質のみの合成を不活性化すること を、さらに支持している。 １）ｐｉｇｃと、Ａｉｌ及びＬｏｍとの類似性　）ｙ　、ｔ　ｚｃの分子的機能 を解明する糸口を見出だすことを目的として、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｌｏｍｅｄ ｌｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ／Ｐｒｏｔｅｉｎ　１ｄｅ ｎｔＩｆｌｅａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ　（Ｇｅｏｒｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、 　１，９８６．　Ｎｕｅｌｅｉｃ　`ｃ１ｄｓ　ＲｅＳ 、　１４＋１１−１５．本発明の参考文献に取り入れられている）を使用した蛋 白質類似性のコンピュータ解析を行ない、蛋白質配列に基づいて、ｐＪ／Ｃとの 類似性を有する他の蛋白質の同定を試みた。特筆すべきことに、ｔｒｚｉｃは、 バタテリオファージラムダ蛋白質、Ｌｏｍ、に類似していることが判明した。Ｌ ｏｍは、ｍ１ｎｔｃｅｌｌ解析により、外膜に位置づけられており（Ｃｏｕｒｔ 　ｅｔ　ａｔ、、　１９８３．　Ｌａｍｂｄａ　ＩＩ。 Ｈｅｎｄｒｉｙ、　Ｒ，Ｖ、　ｅｔ　ａｌ、　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ窒奄獅■@Ｈａｒ ｂｏｒ　ＮＹ）＝　１１１１）、　２５１−２７７、本発明の参考文献に取り入 れられている）、大腸菌のラムダ溶原菌により発現されることが実証されている （Ｂａｒｏｎｄｅｓｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　１９９０゜Ｎａｔｕｒｅ　３４６： １１７１−８７４．本発明の参考文献に取り入れられている）。近年、クローニ ングされた。／’、　＃ｒｅＩ−ｏｔ−θ／ｌンノＣＺのｔｌｌ’ノ遺伝子産物 の推定されるアミノ酸配列が決定され、Ｌｏｍに類似していることが示された（ Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９９０ｂ、　Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７２：１０Ｂ２−１０６９　）　。このため、蛋白質 配列ファミリー及びコンセンサス配列を確立するコンビニータアルゴリズム（Ｓ ■ｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　 Ｓｃ１．８７：ＩＬｌｌ（２２，本発明の参考文献に取り入れられている）を使 用して、蛋白質配列ファミリーのアラインメントを行なった。このファミリーの 形成は、これらの蛋白質の間の類似性の内部データベース値により表示される： ｐＺＺＣとＬｏｍ　（１０７，８）　、ｔｙｉｚｃとＡｉ　１　（１０４，７） 　、及びＡｉｌとＬｏｍ　（８９，８）。これら同一の蛋白質を、データベース 中の３１４のコントロール配列に対して検索したところ、平均値及び範囲は、３ ９．　３　（７，３〜５２．９）ｉｙｚｉｃ、３７．４　（７，３〜５２．９） Ａｔ　１、及び４２．　１　（７゜０〜６１．９）Ｌｏｍであった。この蛋白質 ファミリーに対する類似性値は、３１４のランダム配列の類似性に対して得られ た最高スコアよりも、すべて３．５標準偏差以上上回った。データベース中に、 他の類似性または他のファミリーメンバーは認められなかった。類似性のある領 域は、リーダーペプチド膜横断領域のみならず蛋白質全体にわたっている。 ｐｚｚｃ変異株は毒性が低下している ）ｙｉｚｃ変異を有するＳｉ／ｚｏｌｅ／／ｉ　ｌｙｐ／ｄｚｗｌｔｔａ株は毒 性が最低１，０００倍低下しているため、これらの株においては、ｐ／！ｏＰに 制御された遺伝子の遺伝子産物の発現が最も不活性化されていると思われる。 導、または２因子機構の制御下にある遺伝子を不活性化する変異の誘導により低 下させることができる。最大毒性には、２因子機構の制御下にある遺伝子間の発 現のバランス（例えば、ｐｉｔ遺伝子発現とｐｒｌ遺伝子との間の発現バランス ）、及び恐らく２因子機構に制御された遺伝子と他の遺伝子との間の発現のバラ ンスが必要である。このバランスを崩す変異、例えば、２因子調節機構の制御下 にある遺伝子の構成的発現を引き起こす変異、または２因子機構の制御下にある 遺伝子（例えば、１２２７遺伝子）を不活性化する変異、は毒性を低下させる。 ２因子レギニレータにおける構成的な変異は、２因子機構の制御下にある遺伝子 へのレコーダ遺伝子融合体を有する株を用いて同定することができる。最も典型 的には、このような遺伝子融合体は、２因子機構の制御下にある遺伝子に融合し たｊｉｃＺ遺伝子またはアルカリフォスファターゼをコードするＤＮＡを有する 。制御を受けることなく　（すなわち、構成的に）高発現する（野生型株または 親株と比較して）融合遺伝子を有する株は、その酵素の色原体性基質の色の増加 により検出することができる。構成的変異を検出するために、例えば、ＤＮＡ修 復機能を欠損した大腸菌株に通す（ｐａｓｓａｇｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ）ことによ り、または化学的変異剤により、クローニングされた毒性レギュレータに変異導 入することができる。次いで、変異導入されたレギュレータＤＮＡを、遺伝子融 合及び構成的変異（融合遺伝子の高発現により同定される、ＩａｃＺ融合の場合 Ｘ−ｇａｌを含有する培地上で青くなる）を有する菌株中に導入する。他の構成 的変異の塩基配列を決定し、構成的発現性をもたらす特異的なアミノ酸の変化を 同定した後に、１ｎｖｌｔｒｏ変異導入により２因子調節機構に含まれる因子に おける構成的変異を生じさせることもできる。幾つかのアミノ酸の改変（すべて 、ＰｈｏＰが構成的である表現型を生じる）により、自然発生的な塩基変化によ る復帰突然変異の頻度が低下する。構成的変異は、ｐｈｏｓｐｈｏａｃｅｅｐｔ ｏｒ領域を含有するｐｈｏｓｐｈｏ−ａｃｃｅｐｔｉｎｇレギニレータのアミノ 末端の一部を欠失させることによっても構築することができる（例えば、）ｙＡ ｏＰ遺伝子のアミノ末端アミノ酸からアミノ酸１１９までをコードする配列の欠 失、または他の２因子調節機構の遺伝子におけるアナログｐｈｏｓｐｈｏ　ａｃ ｃｅｐｔｉｎｇ配列の欠失）。これにより、リン酸化により誘導されるのと類似 した構造的変化が生じ、ＤＮＡ結合が増加し、また、転写が活性化される。 便里 本発明のＳｓ／ｌｏｌθ／／Ｊ細胞は、動物（例えば、哺乳類、例えば、ヒト） において、疾！（例えば、腸チフス及び関連疾患）に対する免疫的防御の供給源 として（特に、動物の腸にコロニーを形成し、強力な免疫反応を誘発する能力を 有する生菌ワクチンの元として）有用である。このような、毒性を低下させであ る生ワクチンの適切なｍ１及び投与条件は、Ｈｏ１ｅｓ　ａｔ　ａｌ、、＾ｃｕ ｔｅ　Ｅｎｔｅｒｌｃ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ、Ｎｅｗ 　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｏｎ　（１９８１）　Ｅ撃唐■魔■■■ ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｈ、 　２Ｂ、　ｐｐ、　４４３　ｅｔ　ｓｅｑ、　（Ｌｅｖｉｎ■@ｅｔ　ａｌ、） 、本発明の参考文献に取り入れられている、に記載されているとおりである。 の遺伝子（例えば、芳香族アミノ酸合成遺伝子、例えば、ａｒｏＡまたはａｒ。 Ｄ）中、またはｃｙａ遺伝子（アデニレートシクラーゼ）またはａｒｐ遺伝子（ アデニレートシクラーゼ受容体）中に毒性を低下させる変異を有する菌株も特許 請求の範囲に含まれる。 （２）配列番号：１： （ｉ）配列の特性 （ｘｉ）配列：配列番号＝１： 貼Ｔ届茸紘アＧ丁丁ＣσＣＧ四鮎力ＴへπＧＡＣＴＧ丁のＴｋ艷圓シｆｌＧ届ｑ ユ閃へ　２０８０．ＧｃＡｃｃＯ＋０１Ａフ：’ｒ？ツ！Ｔ！ＡＴＡＡＡＡＴＯ ＡＡＡ？！’ｔｌＪＣＡ（＝Ｎ＝：（＝２ＩｉＡＴＧＧ〕ｒｉＩシ〔＝１−一鼈 黶j−（１し【＝電＝−Ｃ龜Ｔ’ＱＴＣＴＴＴＴＴｈ２１４０（２）配列番号： ２： （ｉ）配列の特性 （Ｃ）鎖の数二　一本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列：配列番号：２： ＣＡＴＴ？ＣＴＣＡＴ　ＴＧＡτ入入ＴＧＡＧ　ＭＴＣＪＴＴＡＴ’ｒ　ＧＡ（ ＪＴＡＡＴＴＧ　ＴＴＡＴ’ｆＡＴ？’ＴＴ　Ａｃｅ　５３７〜Ａば’ｍＴｍｅ ’え７゜−喜、。−ｇｏい嘉°、モ凸＝≠。 ａｔＣａｍｃτＭＯｅＪＯ”−ＧＡＡＯＣＡＭＡＡＡＣＡＴＣＴＣＣＴＣＴＡ（ ％ＡＡＡＴＡＡＡＣＧＯＣＴＴＣ１８６ＶＡＬ　Ａｌ２　ＶＡＬ　（ｉＬＹ　、 、、　ＣｕＪ　（ｉＬＹ　ｍ　Ａｊｌｌ　！ＬＥ　ｇｔｌ　ｌｔｌ　ＴＩＬ　Ｌ Ｙ！　Ｙｕ　ｕｌｌ@ａτＰＳＩＥ　ｉｉ。 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：０１） （７２）発明者　ミカラノス　ジョン　ジエイアメリカ合衆国　マサチューセッ ツ州　ケンブリッジ　ウォーカーコート　ワン Ｉ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ｐｈｏｐ調節領域における前記領域の制御下にある遺伝子の構成的発現を引 き起こす第一の変異及びａｒｏ、ｐａｇ、またはｐｒｇ遺伝子における第二の変 異により毒性を低下させたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞を含有するワクチン。
2. ２．ｐａｇまたはρｒｇ遺伝子における変異及びａｒｏ遺伝子における変異によ り毒性を低下させたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞を含有するワクチン。
3. ３．ρｐｙｏｐ調節領域を構成的に発現し、ａｒｏ、ｐａｇまたはｐｒｇ遺伝子 ににおける変異により毒性を低下させたｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞。
4. ４．ｐａｇまたはｐｒｇ遺伝子中に毒性を低下させる第一の変異を有し、ａｒｏ 遺伝子中に毒性を低下させる第二の変異を有するＳａｌｍｏｎｌｌａ細胞。
5. ５．ｐａｇまたはｐｒｇ遺伝子中に異種蛋白質をコードする遺伝子、または前記 異種蛋白質遺伝子の調節因子が挿入された生存Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞。
6. ６．異種蛋白質をコードする前記ＤＮＡが、環境に調節されるプロモータの制御 下にあることを特徴とする請求項５に記載の生存Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞。
7. ７．異種蛋白質をコードする第一のＤＮＡ配列と、マーカーをコードする第二の ＤＮＡ配列と、毒性に必要な産物をコードする第三のＤＮＡ配列（前記第三のＤ ＮＡ配列は変異により不活性化されている）を有する、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの 染色体に組み込み可能なベクター。
8. ８．ｐａｇＣ遺伝子産物をコードするＤＮＡを有するベクター。
9. ９．ｐａｇＣ遺伝子産物の精製された調製物。
10. １０．ｐａｇＣにコードされたＤＮＡへの試料の接触、及び前記ｐａｇＣにコー ドされたＤＮＡと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションの検出を含む、 試料中に存在するＳａｌｍｏｎｇｅｌｌａの検出方法。