KR20010099789A - 독성 유전자와 단백질 및 그들의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은E. coliK1에서 일련의 독성 유전자들의 확인에 기초하는 것으로, 그것의 생성물들은 유기체의 병원성에 연루될 수 있다. 이 유전자들의 확인은 그들을 또는 그들의 발현 생성물들을 감염을 치료하기 위한 수 많은 방식으로 사용되게 한다.
Description
E. coli는 동물의 장관에 살고있는 그람-음성 미생물인 장내세균과 (Enterobacteriaceae), 또는 장내 세균의 일원이다. 이 세균 과 (family)의 다른 일원으로는 엔테로박터 (Enterobacter), 클레브시엘라 (Klebsiella), 살모넬라 (Salmonella), 쉬겔라 (Shigella) 및 예르시나 (Yersinia)를 들 수 있다. 비록E. coli는 보통 인간의 위장관에서 발견되지만, 이것은 페혈증, 내막염, 요로 감염, 상처 감염, 종기 형성, 복막염 및 담관염을 포함하여 인간의 질환에 연루되어 왔다.
E. coli에 의해 야기되는 질환 상태는 특정의 독성 결정기들에 의존한다. 예를들면,E. coli는 신생아 내막염에 연루되어 있고 그리고 독성의 주요 결정기는 시알산 (sialic acid)의 단일중합체인 K1 항원으로 확인되었다. K1 항원은 숙주의 면역계를 피하고 그리고 식균작용을 방지하는 데 역할을 한다.
본 발명은 독성(virulence) 유전자 및 단백질의 확인 및 그들의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 치료법 및 약제의 선별 (screening)에서의 그들의 용도에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은E. coliK1에서 일련의 독성 유전자들의 확인에 기초한 것이고, 또한 유기체의 병원성에 연루될 수 있는 생성물들을 생성하는 유기체에 관련된다.
본 발명의 일면에 따르면, 펩티드는 여기서E. coliK1 또는 그람-음성 세균에서 그것의 동족체 (homologue)로부터mdoG, creC, recG, yggN, tatA, tatB, tatC, tatE, eck1, iroD, iroC, iroE, mtd2및ms1 내지 16으로 확인된 유전자들중 어느 것을 포함하는 오페론 또는 그것의 기능성 단편에 의해 코드화된다. 그러한 펩티드는 예를들면, 단리될때 치료적인 사용에 적합하다.
여기서 용어 "기능성 단편"은 전체 유전자 또는 펩티드와 유사한 치료학적 이용성을 보유하는 유전자 또는 펩티드의 일부를 정의하는 것으로 사용된다. 예를들면, 펩티드의 기능성 단편은 백신 또는 항체의 생산에 유용한 항원 결정기로서 사용될 수 있다. 유전자 단편은 활성 펩티드를 코드화하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 유전자 단편은 치료학적 효과를 발휘하는 생체내 야생형 유전자를 표적화하는 유전자 치료법에 유용성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드는 여기서 SEQ ID NOS. 2, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 23, 24, 25, 26, 28, 31, 29, 32 및 35-48로 확인된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
독성 결정기로서 이들 펩티드들의 확인은 감염 치료에서 수 많은 방식으로 이들이 사용될 수 있게 한다. 예를들면, 숙주는 본 발명에 따른 펩티드를 발현하기 위해 형질전환되거나 또는 그 펩티드를 코드화하는 유전자의 발현을 방해하도록 변형될 수 있다. 백신은 감염의 치료를 위하여, 본 발명에 따른 펩티드, 또는 그것의 발현을 위한 수단을 포함할 수 있다. 또한, 백신은 독성 유전자 결실을 갖는 미생물을 포함하는 데, 여기서 유전자는 본 발명에 따른 펩티드를 코드화한다.
본 발명에 따른 또 다른 일면에 따르면, 펩티드 또는 유전자는 유력한 항미생물 제제의 선별을 위해 또는 독성의 검출을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 면은 그람-음성 세균, 특히E. coli에 의한 감염과 연관된 상태의 치료 또는 예방을 위한, 여기서 확인된 생성물들의 사용이다.
발명의 설명
본 발명은E. coli의 독성 유전자 (및 독성 결정기)를 확인하기 위하여, 약독화된 (attenuated) 돌연변이체를 위한E. coliK1 균주 RS228 (Pluschke et al, Infection and Immunity 39:599-608) 미니-Tn5 돌연변이체 뱅크를 선별하는 시그너처-태그된 (signature-tagged) 돌연변이화 (STM) (Hensel et al, Science, 1995; 269:400-403)를 이용하였다.
비록E. coliK1은 독성 유전자들, 본 발명의 범위 내라고 여겨지는 다른 장내 세균에서의 상응하는 유전자들을 확인하기 위한 미생물로서 사용되었다. 예를들면, 대응하는 유전자들 또는 코드화된 단백질들은, 서열 상동성을 기초로 하여, 엔테로박터, 클레브시엘라, 및 살모넬라, 쉬겔라 및 예르시니아를 포함하여 인간의 장 질환에 연루된 다른 속에서 발견될 수 있다.
여기에서 용어 "독성 결정기"는 예를들면, 병원성 세균의 유지(maintenance)에 역할을 할 수 있는 펩티드 또는 단백질을 정의하는 것으로 사용된다. 특히, 독성 결정기는 감염성 또는 질환-유발 미생물의 병원성에 연루된 세균성 단백질 또는 펩티드다.
독성 결정기를 코드화하는 유전자는 "독성 유전자"로 칭하여 진다. 돌연변이, 결실 또는 삽입의 방식에 의한 독성 유전자의 파괴는 숙주에서 세균의 감소된 수준의 생존, 또는 미생물의 병원성에서 일반적인 감소를 가져올 것이다.
시그너처-태그된 돌연변이화는 독성 유전자 및 그들의 생성물들을 확인하기에 매우 유용한 기법으로 증명되어 왔다. 이 기법은 복제를 허용하는 조건하에서, 미생물의 게놈으로 트랜스포존을 무작위로 삽입하는 능력에 의존한다. 트랜스포존은 용이한 확인을 위해 개별적으로 표식되고, 그리고 나서 미생물로 별개로 도입되어, 게놈의 파괴 (interupt)를 야기한다. 그리고 나서 감소된 독성을 갖는 돌연변이된 미생물들은 음성 선택에 의해 검출되고 그리고 삽입 불활성화가 일어난 유전자들이 확인되고 특징화된다.
STM 방법에서 첫번째 단계는 적절한 트랜스포존 또는 트랜스포존-유사 성분들(elements)의 제조이다. 상이한 트랜스포존의 라이브러리가 제조되고, 미생물로의 전달을 촉진하기 위하여 이들 각각은 벡터 또는 플라스미드로 병합된다. 적절한 트랜스포존을 갖는 벡터들의 제조는 당업자에게 분명할 것이고 또한 WO-A-96/17951에 개시되어 있다. 그람-음성 세균, 예를들면E. coli에 대해서, 적절한 트랜스포존은 Tn5 및 Tn10을 포함한다. 트랜스포존을 제조한 후, 세균 균주의 돌연변이화를 행하여 개별적으로 돌연변이된 세균 라이브러리를 만든다.
그리고 나서 돌연변이된 미생물 푸울이 적절한 숙주로 도입된다. 적절한 기간 후에, 미생물들을 숙주로부터 회수하고 그리고 숙주에서 살아남은 그 미생물들을 확인함에 의해서, 또한 살아남지 못한 돌연변이된 균주들 즉, 무독성의 균주들을 확인한다. 그리고 나서 저장된 라이브러리에서 대응하는 무독성의 균주들은 삽입 불활성화가 일어나는 유전자들을 확인하기 위해 사용된다. 보통, 트랜스포존 삽입 부위는 트랜스포존 삽입 부위에 연접해 있는 DNA를 단리함에 의해 확인되고, 그리고 이것은 독성에 연루된 유전자들의 특징화를 가능케 한다.
일단 무독성의 미생물이 확인되면, 돌연변이체의 치사량으로 적절한 숙주 동물을 감염함에 의해 독성에서 돌연변이된 유전자의 중요한 역할을 더 상세히 결정하는 것이 가능하다. 감염된 동물의 생존 시간은 야생형 균주로 감염된 대조구의 그것과 비교되고, 그리고 대조구 보다 더 장기간 동안 생존하는 동물들은 돌연변이된 독성 유전자들을 갖는 미생물로 감염될 것이라고 언급될 수 있다.
또한, 독성에 유력한 역할은 야생형 및 돌연변이 세균의 혼합물로 동물 숙주를 감염시킴에 의해 조사될 수 있다. 적절한 기간 후에, 세균은 숙주 동물의 기관으로부터 수확되고 그리고 야생형 및 돌연변이 세균의 비율이 결정된다. 이 비율은 경쟁적 지수(CI)를 결정하기 위하여 접종물에서 야생형 및 돌연변이의 비율로 나눈다. 1 미만의 경쟁적 지수를 갖는 돌연변이체는 무독성으로 언급될 수 있다.
트랜스포존의 삽입에 의해 불활성화되는 유전자는 진정한 독성 유전자가 아닐 수 있으나, 하류 (독성) 유전자상의 극성 (polar) 효과를 가질 수 있는 가능성이 있다. 이것은 유전자의 더 정의된 영역들에서 비-극성 돌연변이들을 위치시키거나, 또는 다른 인접한 유전자들을 돌연변이시키고 그리고 돌연변이체가 무독성인지 아닌지를 수립하는 추가의 실험에 의해 결정될 수 있다.
E. coli에서 독성 유전자를 특징화하면, 그 유전자 서열을 다른 미생물들에서 상동성을 수립하기 위해 사용하는 것이 가능하다. 아렇게 하여, 다른 미생물들이 유사한 독성 결정기들을 갖는지 여부를 결정하는 것이 가능하다. 서열 상동성들은 예를들면 EMBL 또는 Genebank와 같은 존재하는 데이터베이스에서 조사하여 수립될 수 있다.
독성 유전자들은 종종 병원성 아일런드(island)로 불리는 별개의 염색체 영역들에서 서로 클러스터되어 있다. 병원성 아일런드들은, 그들이 보통 반복 서열들이 접하여 측면에 위치(flanking)하기 때문에, 삽입 요소 또는 tRNA 유전자로 인식될 수 있다. 또한 G + C 함량은 보통, 그들이 다른 유기체로부터 수평 전파에 의해 획득되었다는 것을 제시하는, 염색체의 잔여물과는 다르다. 예를들면,E. coliK12 게놈의 G + C 함량은 52%이다.E. coli균주들에서 발견되는 모든 병원성 아일런드는 이 평균에서 벗어나는 G + C 함량을 갖을 것 같다.
확인된 독성 유전자들은 약독화된 백신 균주들을 생산하는 데 유용하고 그리고 항미생물을 위한 표적으로서 유용하다. 그리고 일반적으로 그람-음성 세균에서 상동체에서도 동일하게 유용할 것이다.
본 발명의 목적을 위해서, 적절한 정도의 상동성은 통상 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 60% 또는 70%, 그리고 더 바람직하게는 적어도 80% 또는 90% 이다 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서).
본 발명에 따른 단백질들은 당해 분야에서 알려진 방법들에 의해 정제되고 그리고 단리될 수 있다. 특히, 유전자 서열을 확인하면, 적절한 숙주에서 유전자를 발현하는 재조합 기법들을 사용하는 것이 가능할 것이다. 활성 단편들 및 상동체들이 확인될 수 있고 그리고 치료법에서 유용할 수 있다. 예를들면, 단백질들 또는 그들의 활성 단편들은 면역 반응을 끌어내기 위하여 백신에서 항원 결정기로서 사용될 수 있다. 그들은 또한 수동 면역화를 위한 항체의 제조에 또는 진단적 응용에 사용될 수 있다. 적절한 항체들은 모노클로날 항체, 또는 단일 사슬 fv 단편들을 포함하는 그것의 단편을 포함한다. 항체들의 제조방법은 당업자에게 분명할 것이다.
약독화된 미생물들에 기초한 백신의 제조는 당업자에게 알려져 있다. 백신 조성물들은 필요와 요구에 따라 예를들면 명반과 같은 적절한 담체 또는 부형제와 제형화 될 수 있고, 그리고E. coli또는 다른 그람-음성 세균에 대한 효과적인 면역화를 제공하기 위한 치료법에 사용될 수 있다. 백신 제형화의 제조는 당업자에게 명백하다.
더 일반적으로, 치료학적 용도를 위한 본 발명의 활성 성분의 적절한 양이 잘 알려진 바와 같이, 적절한 담체 또는 부형제, 및 투여 경로를 알 수 있다. 이 요소들은 치료될 상태의 성질/심각도, 대상의 유형 또는 건강상태 등과 같은 알려진 범주에 따라 선택되거나 결정될 것이다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시한다. 실시예들에서, STM이 전신(systemic) 감염의 마우스 모델을 사용하여 약독화된 돌연변이체를 위한E. coliK1 미니-Tn5돌연변이체 뱅크를 선별하기 위해 사용되었다. Hensel et al (상동)에 개시된 기본 절차가 따랐다. 독성 유전자 내에 미니-Tn5 삽입을 함유하는E. coliK1는 돌연변이체의 혼합된 집단으로 접종된 마우스들로부터는 회수되지 않았으므로 약독화된 것 같다.
미니-Tn5 삽입의 어느 하나의 측면에 접하여 위치한 DNA 영역은 역 PCR에 의해 또는 카나마이신-저항 마커의 구제(rescue)에 의해 클론되었다. 후자의 경우에서, STM-유래 돌연변이체로부터의 염색체 DNA는 제한효소들로 소화되었고, 플라스미드 pUC19로 연결되었고, 그리고 수용성E. coliK12 세포들로 형질전환 후에 카나마이신-저항성 클론들을 선택하였다. 그리고 나서 연이은 클로닝 및 서열화가 수행되고 그리고 유전자 서열들을 추정상의 유전자 산물들을 특징화하기 위해 공개적으로 이용가능한 서열 데이터베이스 (EMBL)에 있는 서열들을 사용하여 비교하였다.
실시예 1
첫번째 돌연변이체에서, 클론된 DNA의 두 단편들을 서열화하였다. 뉴클레오티드 서열들은 SEQ NO. 1 및 SEQ ID NO. 3에 도시되어 있고 그리고 SEQ ID NO. 1로부터 DNA의 번역된 영역은 SEQ ID NO. 2에 도시되어 있다. SEQ ID NO. 1은E. coliK12 (EMBL 데이터베이스 접근 번호 AE000206) 유래의mdoGH영역, 뉴클레오티드 2577 내지 6908과 99.8% 동일성을 보인다. 이 DNA 단편은ymdD유전자의 5'-부분, 전체mdoG유전자 및mdoH유전자의 5' 부분을 코드화한다.mdoG유전자의 생성물은 그 기능이 알려져 있지 않으나, 막-유래 다당의 생합성에 관련된 것으로 여겨진다.
SEQ ID NO. 3은mdoH유전자의 3'-부분 및E. coliK12로부터 하류 유전자 서열들(뉴클레오티드 7187 내지 7760)과 98.3% 동일성을 보인다. SEQ ID NO.2는E. coliK12 (Swiss Prot 접근 번호 P33136)으로부터의mdoG단백질과 아미노산 1 내지 511에서 99.6% 동일성을 보인다.
신규한 유전자는 혼합된 감염을 사용하여, 전신 감염의 뮤린 모델 (Achtman et al., Infection and Immunity, 1983; Vol. 39:315~335)에서 독성의 약독화에 대해 테스트하였고, 그리고 0.38의 경쟁적 지수 (CI)로 약독화됨을 보였다. 이것은 원래의 트랜스포존 돌연변이체의 약독화는mdoG유전자의 파괴에 기인하는 것임을 확인해 준다.
mdoG의 극성 및 비-극성 결실 돌연변이체들을 축조하였다.mdoG유전자 및 측면에 연접한 영역을 올리고뉴클레오티드 5'-TGCTCTAGAGCCATTACTCAGAATGGG-3' (SEQ ID NO. 49) 및 5'-CGCGAGCTCGACGACTGAATGATCCC-3' (SEQ ID NO. 50)으로 PCR 해서 증폭하였다. 그리고 나서 생성물들을 pUC19로 클론하였다.mdoG의 5'- 및 3'-말단 단편들 및 전체 pUC19 서열을 함유하는 PCR 생성물을 올리고뉴클레오티드 5'-TCCCCCGGGTACTGCAGCACTCAACC-3' (SEQ ID NO. 51) 및 5'-GATCCCGGGACCACTGAAATGCGTGC-3' (SEQ ID NO. 51)으로 역 PCR 함에 의해 증폭하였다. 극성 및 비-극성 구조체를 부여하기 위하여 비-극성 카나마이신 내성 카세트 (aphT)를mdoG서열들 사이에 두 방향으로 삽입하였다. 그리고 나서mdoG::aphT융합체들을 자기불활성화 벡터 pCDV442로 전달하였다. pCDV442 구조체들을 야생형E. coliK1에 컨쥬게이트한 후,mdoG의 염색체 복사체를 대립유전자 전달 (allelic transfer)에 의해 돌연변이 시켰다.
축조된 돌연변이체는 전신 감염의 뮤린 모델 (Achtman et al., supra)에서 독성의 약독화에 대해 테스트하였다. 극성 및 비-극성 구조체들 모두 각각 0.37 및 0.35의 경쟁적 지수 (각각 3마리 마우스들로부터의 평균 CI)로 독성이 약독화되었다. 이것은 원래의 트랜스포존 돌연변이체의 약독화는mdoG유전자의 파괴에 기인하는 것임을 확인해 준다.
실시예 2
두번째 돌연변이체는 SEQ ID NO. 4에 도시되어 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 독성 유전자 및 SEQ ID NO. 5에 도시되어 있는 번역된 아미노산 서열로 확인되었다. 미니-Tn5 트랜스포존은 뉴클레오티드 581 (SEQ ID NO. 4)에 그리고 아미노산 187 (SEQ ID NO. 5)에 삽입했다.
이 서열들은E. coliK12의creC유전자와 97.9% 동일성을 보인다 (EMBL 및 Genebank 접근 번호 M13608, AE000510 및 U14003).
E. coliK12 유래의creC단백질은 신호 도메인을 함유하는 단백질들로 구성되는 단백질 패밀리에 뿐만 아니라 히스티딘 키나제의 단백질 패밀리에 속한다.
신규한 유전자를 독성의 약독화에 대해 테스트하였고 (Achtman et al, supra.), 그리고 0.09의 경쟁적 지수로 약독화됨을 보였다.
E. coliK12creC유전자는creD유전자를 갖는 오페론의 일부로서 전사되므로, 이 약독화는 추정되는E. coliK12creD유전자 상의 극성 효과에 기인할 가능성이 있다.
실시예 3
세번째 돌연변이체는 SEQ ID NO. 6에 도시된 뉴클레오티드 서열 및 바로 이어서 미니-Tn5를 가졌다. 이 서열의 번역은 SEQ ID NO. 7에 도시되어 있다.
이 뉴클레오티드 서열은E. coliK12의recG유전자, 뉴클레오티드 5-146에서 93.7% 동일성을 보인다 (EMBL 및 Genebank 접근 번호 P24230 및 M64367). 이것은 파괴된 유전자가E. coliK12의recG유전자에 적어도 부분적으로 동일하다는 것을 증명한다.E. coliK12의recG유전자는 ATP-의존 DNA 나선효소로서 기능하고 그리고 DNA 복구에서 결정적인 역활을 하는 76.4kD 단백질을 코드화한다.
약독화 테스트에서, 경쟁적 지수는 0.48로 보여졌다.recG유전자는 오페론의 말단 유전자로서 전사되고, 그러므로 이 약독화는 또 다른E. coliK1 유전자 상의 극성 효과에 기인하는 것 같지는 않다.
실시예 4
네번째 돌연변이체는 SEQ ID NO. 9에 도시된 번역 생성물을 갖는, SEQ ID NO. 8에 도시된 뉴클레오티드 서열 내에 삽입된 트랜스포존을 가졌다.
미니-Tn5 트랜스포존을 뉴클레오티드 359 및 아미노산 80에 삽입했다.
이들 서열들은E. coliK12의yggN유전자 (EMBL 접근 번호 AE000378)와 뉴클레오티드 339-1054에서 98.5% 서열 동일성을 보였고, 그리고 아미노산 수준으로 99.6% 동일성을 보였다.
비록yggN유전자의 서열은 알려져 있더라도, 그것의 코드화된 단백질의 기능은 아직 결정되지 않았다.
신규의 유전자는 독성의 약독화에 대해 테스트하였고, 그리고 0.43의 경쟁적 지수로 약독화됨을 보였다.
실시예 5
몇몇의 돌연변이체들은 또한 동일한 영역 내에 트랜스포존 삽입으로 발견되었다. 그 영역을 클론하고 그리고 서열화하는 것은 SEQ ID NO. 10에 도시된 뉴클레오티드 서열을 밝혀냈다. 이 서열은E. coliK12의tatABCD오페론과 상동성을 갖는다 (EMBL 및 Genebank 접근 번호 AJ005830, AE000459 및 AE000167). 이 오페론은 Sec-의존 단백질 유출 경로의 구성성분으로서 기능하는 예측된 질량 9.6kD, 18.4kD, 28.9 kD 및 29.5 kD의 단백질들을 코드화한다. 이 경로는 세포질에서 조-인자들의 부착 후에, 게이트된 포어 (gated pore)를 통하여 페리플라즘으로 완전히 접힌 단백질들의 전좌를 가능케 한다.
뉴클레오티드 서열의 번역은tatA(SEQ ID NO. 11)에 상응하는 단백질,tatB(SEQ ID NO. 12)에 상응하는 서열,tatC(SEQ ID NO. 13)에 상응하는 서열 및tatD(SEQ ID NO. 14)에 상응하는 서열을 밝혀 냈다.
STM에 의해 확인된 돌연변이체들에서 미니-Tn5는 SEQ ID NO. 10의 뉴클레오티드 1429 및 2226에 위치되었다. 이들 트랜스포존 삽입들은 아미노산 50에서tatB단백질 서열을 파괴하고 그리고 아미노산 143에서tatC단백질 서열을 파괴한다.
tatB및tatC유전자들을 독성의 약독화에 대해 테스트하였고 그리고 각각 0.0012 및 0.0039의 경쟁적 지수로 약독화됨이 보여졌다. 이 유전자들은 또한 전신 감염의 동일한 모델에서 단일 감염에서 테스트될 때, 독성이 약독화되었다.
실시예 6
추가의 돌연변이체가 SEQ ID NO. 15에 도시된,E. coliK12의tatE유전자에 상응하는 영역 내에서 삽입적으로 불활성화되었다.tatE유전자는E. coliK12 유전자의 그것 (접근 번호 AE000167)과 뉴클레오티드 6719-7306에서 98% 동일성을 보인다.
tatA,tatD및tatE유전자들이 독성에 요구되는 지 여부를 수립하지 위하여, 비-극성 결실 돌연변이들을 각각에서 축조하였다.tatA,tatD및tatE유전자들의 어느 한 측면에 연접해 위치한 DNA의 영역들을 하기의 프라이머들로 증폭하였다:
SEQ ID NO. 53 및 SEQ ID NO. 54 프라이머들을tatA의 상류 DNA 서열들을 증폭하기 위하여 사용하였고, SEQ ID NO. 55 및 SEQ ID NO. 56 프라이머들을tatA의 하류 DNA 서열들을 증폭하기 위하여 사용하였다.
SEQ ID NO. 57 및 SEQ ID NO. 58 프라이머들을tatD의 상류 DNA 서열들을 증폭하기 위하여 사용하였고, SEQ ID NO. 59 및 SEQ ID NO. 60 프라이머들을tatD의 하류 DNA 서열들을 증폭하기 위하여 사용하였다.
SEQ ID NO. 61 및 SEQ ID NO. 62 프라이머들을tatE의 상류 DNA 서열들을 증폭하기 위하여 사용하였고, SEQ ID NO. 63 및 SEQ ID NO. 64 프라이머들을tatE의 하류 DNA 서열들을 증폭하기 위하여 사용하였다.
이들 연접해 위치하는 DNA 단편들을 pUC19로 클로닝한 후, 비-극성aphT카나마이신 내성 카세트 (Galan et al, J.Bacteriol, 1992; 174:4338-4349)를tatA,tatD및tatE유전자들을 대체하기 위하여 연접해 위치하는 DNA 단편들 사이에 삽입하였다. 그리고 나서 이들 DNA 단편들을 자기불활성화 벡터 pCVD442 (Blomfield et al, Mol. Micro., 1991;5:1447-1457)로 전달하였다. 그리고 나서 pCVD442 구조체들을 야생형E. coliK1으로 컨쥬게이트한 후,E. coliK1tatA,tatD및tatE유전자들의 염색체 복사체들을 대립유전자 전달에 의해 돌연변이 시켰다.
tatA,tatD및tatE유전자들의 파괴는 독성의 약독화 (Achtman et al., supra)에 대해 테스트 되었다.
어떤 유전자도 단리시 결실될 때 약독화되지 않았다. 유전자들은 여전히 독성에서 역할을 하고, 그리고 이를 테스트하기 위해서, 돌연변이체들을tatA및tatE유전자들 둘 다에서 결실을 갖게 제조되었다. 이중 돌연변이체는 야생형 균주와 혼합된 감염을 사용하여 독성에서 약독화를 테스트하였고 그리고 0.0017의 경쟁적 지수로 약독화됨을 보였다. 그러므로tatA,tatD및tatE유전자들은 비독성 미생물들을 만들기 위해 조합하여 사용될 수 있는 것으로 보인다.
E. coliK1tatABCD유전자들과S. typhimurium게놈 및Neisseria meningitidis게놈에 존재하는 예측된tatABCD유전자들의 유사성이 주어지면, tat 시스템이 이들 및 다른 유기체들에서 독성에 또한 요구될 것이다.S. typhimurium tatC유전자 (SEQ ID NO. 17)에서 결실은 하기의 프라이머들로 tatC 유전자의 어느 한 측면에 연접해 위치한 DNA를 증폭함에 의하여 축조되었다:
SEQ ID NO. 65 및 SEQ ID NO. 66 프라이머들을S. typhimurium tatC유전자의 하류 DNA 서열들을 증폭하기 위하여 사용하였고, SEQ ID NO. 67 및 SEQ ID NO. 68 프라이머들을S. typhimurium tatC유전자의 상류 DNA 서열들을 증폭하기 위하여 사용하였다.
tatC 유전자의 두 영역들에 대한 코드화된 아미노산 서열들은 SEQ ID NO. 18 및 SEQ ID NO. 19에 도시되었다.
이들 인접해 위치하는 DNA 단편들을 pUC19로 클로닝한 후, 비-극성 카나마이신 내성 카세트 (aphT)를S. typhimurium tatC유전자를 대체하기 위하여 인접해 위치하는 DNA 단편들 사이에 삽입하였다. 그리고 나서 이 DNA 단편는 자기불활성화 벡터 pCVD442로 전달되었다. 그리고 나서, pCVD442 구조체를 야생형S. typhimurium균주 TML 및 SL1344로 컨쥬게이트한 후,S. typhimurium tatC유전자의 염색체 복사체를 대립유전자 전달에 의해 돌연변이 시켰다.
파괴된S. typhimurium tatC유전자를 전신 감염의 뮤린 모델에서 혼합 및 단일 감염을 이용하여 독성의 약독화에 대해 테스트를 하였다. 혼합 감염을 위해서, 6-7주balbC마우스를 104세균 세포들로 복강내 접종하였다. 경쟁적 지수는 3일후 비장에 존재하는 돌연변이 및 야생형 세균의 수를 비교한 후에 계산하였다. 단일 감염을 위해서, 마우스들을 다양한 양으로 복강내 또는 경구적으로 접종하고 그리고 마우스 생존을 17일 동안 모니터 하였다. 균주들은 독성에서 약독화되었고, SL13444tatC및 TMLtatC결실 균주들의 경쟁적 지수는 각각 0.078 및 0.098이었다.
단일 감염에서, 마우스 생존은 야생형 대조구에 비하여 연장되었다.
서열 상동성은 또한Neisseria meningitidis로부터의 tat 서열로 증명되었다.N. meningitidis으로부터의 유전자 서열은 SEQ ID NO. 20에 도시되고 그리고 tatC에 대한 코드화된 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 21에 도시되어 있다.
독성에 대한 테스트를 위하여, 결실 돌연변이는 하기의 프라이머들을 사용하여 제조되었다:
DNA 단편들 및aphT카나마이신 내성 카세트를 pUC19로의 클로닝은 상기에서S. typhimurium에 대해 요약된 절차를 따랐다.N. meningitidis tatC유전자의 염색체 복사체를 pUC19-기재 구조체를 야생형N. meningitidis세포들로 형질전환함에 의해 돌연변이 시켰다.
결과의 형질전환체들의 서던 분석은 모든 형질전환체들이 부분이배체였고 그리고tatC유전자의 야생형 및 돌연변이된 복사체 둘 다를 함유하였다. 이것은tatC유전자가 결실된 돌연변이체들의 분리에 대한 몇몇 선택이 있음을 나타낸다.
극성 및 비-극성 구조체들에 대해 더 연구한 결과 형질전환체들은 선택적 배지에서는 자라지 않았음을 보여주었다. 이것은N. meningitidis tatC유전자는 이 유기체의 생체외 성장에 필수적임을 제시한다.
실시예 7
SEQ ID NO. 22로서 여기에서 확인된 뉴클레오티드 서열내에, 뉴클레오티드 3981에 트랜스포존 삽입을 갖는 추가의 돌연변이체가 확인되었다. 여기서eck1으로서 확인된 서열은 수많은 세균들 유래의 몇몇 그룹 1 글리코실트랜스퍼라제에 서열 상동성을 보였다. 서열 상동성은 또한E. coliK12의gnd유전자 (SEQ ID NO. 22의 뉴클레오티드 4197-4604에)로 보여졌다.
E. coli eck1유전자의 번역은 SEQ ID NO. 26에 도시되어 있다. 상기에서 지적된 바와 같이, 그 유전자를 독성 약독화에 대해 테스트하였고 그리고 0.025의 경쟁적 지수로 약독화되는 것으로 보인다.
몇몇의 개방 리딩 프레임 (ORF)은 또한 DNA 서열 (SEQ ID NO. 22)로부터 확인되었다. 이들중 첫번째는 여기서 MS1으로서 확인되고 그리고 번역 생성물은 SEQ ID NO. 25로서 도시된다. 아미노산 서열은E. coli세로타입 0111 (TrEMBL 데이터베이스 접근 번호 AAD46732) 유래의 추정 글리코실 트랜스퍼라제에 50.3% 동일성을 갖는 것으로 보여진다. 아미노산 서열은 또한E. coliK1 유래의 eck1 단백질 그리고Yersinia entercolitica(TrEMBL 데이터베이스 접근 번호 Q56917) 유래의 TrsE 단백질과 상동성을 보였다.
여기서 MS2로서 확인된 두번째 개방 리딩 프레임은 SEQ ID NO. 24에 도시된 유전자 서열을 가졌다. 이것은Yersinia entercolitica유래의 추정 글리코실 트랜스퍼라제 TrsC (TrRMBL 데이터베이스 접근 번호 Q56915) 및E. coli세로타입 0113 유래의 글리코실 트랜스퍼라제 WbnA (TrEMBL 데이터베이스 접근 번호AAD50485)과 서열 상동성을 보인다.
세번째 개방 리딩 프레임은 여기서 MS3 (SEQ ID NO. 23)으로서 확인된 생성물을 코드화한다. 아미노산 서열은Streptococcus mutans유래의 람노실트랜스퍼라제에 30.2% 동일성을 보인다.
SEQ ID NO. 22로서 확인된 유전자 서열은 미생물 게놈상의 클러스터에 위치된 다중 독성 유전자들을 갖는 병원성 아일런드의 적어도 일부일 수 있다.
실시예 8
iroCDE오페론 내에 트랜스포존 삽입을 갖는 추가의 돌연변이체가 확인되었다. 미니-Tn5 삽입의 어느 한 측면에 연접해 위치하는 뉴클레오티드 서열들은 SEQ ID NO. 27 및 SEQ ID NO. 30에 도시되어 있다.
미니-Tn 트랜스포존은 SEQ ID NO. 27의 뉴클레오티드 1272에 그리고 SEQ ID NO. 30의 뉴클레오티드 1에 삽입되고 그리고iroD유전자를 중단시킨다.iroD의 N-말단 영역은 SEQ ID NO. 29로서 도시되고, 그리고 C-말단 영역은 SEQ ID NO. 31로서 도시된다.
iroD에 더하여, SEQ ID NO. 27로서 도시된 유전자는 SEQ ID NO. 28로서 도시된 아미노산 서열과 부분적인 펩티드를 코드화한다. 이 아미노산 서열은Salmonella typhi유래의 추정 ATP 결합 카세트 운반체iroC와 70.9% 동일성을 보인다.
SEQ ID NO. 30으로서 도시된 유전자 서열은 SEQ ID NO. 32로서 도시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코드화하는 개방 리딩 프레임을 포함하고 그리고 이것은Salmonella typhi유래의iroE단백질과 서열 상동성을 갖는다.
상기에 기재된 바와 같이, 독성의 약독화를 위한 모델에서 유전자들을 테스트한 결과iroD유전자가 0.107의 경쟁적 지수로 약독화되었다.iroD유전자에서 미니-Tn5 돌연변이는 P1 형질도입에 의해 야생형E. coliK1 균주로 재도입되었다. 결과의 형질도입체는 또한 0.1의 경쟁적 지수로 독성이 약독화된다. 이것은 약독화된 표현형은iroD내에 삽입체에 연결되어 있다. 그러나, 약독화는E. coliK1iroE유전자 상에 극성 효과에 기인한다.
실시예 9
SEQ ID NO. 33으로서 도시된 뉴클레오티드 서열 내의 트랜스포존 삽입을 갖는 추가의 돌연변이체가 확인되었다. 트랜스포존은 SEQ ID NO. 33의 뉴클레오티드 2264에 삽입된다. 뉴클레오티드 서열은E. coliK12의aslA/hemY영역 (EMBL 접근 번호 AE000456)에 서열 상동성을 보인다.aslA는 아릴술파타제 상동체를 코드화하는 반면에,hemY는 프로토헴 IX의 생합성에 관련된다. 이것은 파괴된 영역이E. coliK12의aslA/hemY영역에 적어도 부분적으로 동일함을 증명한다.
트랜스포존은 SEQ ID NO. 33의 뉴클레오티드 2264에 삽입된다. 이 삽입 부위는hemY유전자의 종결 코돈으로부터 하류 216 뉴클레오티드이고 그리고aslA유전자의 개시 코돈으로부터 상류 472 뉴클레오티드이다.
상기에 기재된 바와 같이, 신규 영역이 독성의 약독화에 대해 테스트되었고, 그리고 0.033의 경쟁적 지수로 약독화되는 것으로 보여졌다. 이 영역에서 미니-Tn5 돌연변이는 P1 형질도입에 의해 야생형E. coliK1 균주로 재도입되었다. 결과의 형질도입체는 또한 0.008의 경쟁적 지수로 독성이 약독화된다. 이것은 약독화된 표현형은 이 영역 내에 트랜스포존 삽입체에 연결되어 있다. 그러나,aslA의 극성 및 비-극성 결실 돌연변이체들이 축조되고 그리고 상기에서 언급된 바와 같이 독성의 약독화에 대해 테스트되었다.
극성 및 비-극성 돌연변이체들 모두 독성에서 약독화되지 않았고 그리고 이것은 원래의 트랜스포존 돌연변이체의 약독화가aslA유전자 상의 극성 효과에 기인하지 않음을 증명한다. 이것은 트랜스포존이aslA및hemY사이의 유전자간 영역 내에 코드화된 몇몇 다른 기능을 파괴함을 나타낸다. 예를들면, oxyS와 유사한조절 RNA (Altuvia et al., Cell, 1997; 90:43-53)와 같은, 이 영역 내에 코드화된, 일부 비번역된 RNA 분자가 있을 수 있다. 또한 트랜스포존은 예를들면 DNA 복제에 관련될 수 있는 일부 DNA 구조를 파괴할 수 있었다. 이 DNA 영역은 또한 병원체Salmonella typhimurium에 존재하고, 그것이 다른 유기체들에서 병원성에 대해 중요할 수 있음을 제시한다. 이 영역 (SEQ ID NO. 33)은 항-미생물 약제를 확인하기 위하여 표적으로서 사용될 수 있다.
실시예 10
추가의 돌연변이체가 확인되었고 그리고 미니-Tn5 삽입의 어느 하나의 측면에 엽접해 위치하는 DNA 영역이 클론되었고 그리고 SEQ ID NO. 34로서 도시된 뉴클레오티드 서열을 가졌다. 이 뉴클레오티드 서열은 사이토신-특이적 메틸트랜스퍼라제로서 기능하는mtd2유전자 생성물을 갖는,Herpetosiphon aurantiacus(EMBL 접근 번호 P25265)의mtd2유전자와 상동성을 갖는다.mtd2유전자는E. coliK12게놈에서 발견되지 않고 그리고 병원성 아일랜드를 나타낼 수 있다.
미니-Tn5 트랜스포존 삽입들은 SEQ ID NO. 34의 뉴클레오티드 4773 및 3764에 위치되었고 그리고mtd2유전자를 중단케함이 보여졌다.
mtd2유전자의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 43으로서 도시되어 있다.
상기에 기재된 바와 같이,E. coliK1mtd2유전자는 독성의 약독화에 대해 테스트되었고 그리고 0.073의 경쟁적 지수로 약독화됨이 보여졌다.
mtd2유전자에 더하여, 일련의 개방 리딩 프레임들이 또한 여기서 각각 MS4 내지 MS16, SEQ ID NOS. 48-44 및 42-35로서 확인된 번역 생성물들로 확인되었다. 개방 리딩 프레임들이 유력한 병원성 아일런드에 위치되기 때문에, 이들 유전자에서 돌연변이들은 또한 독성에서 약독화를 초래할 수 있을 것이다. 게다가,E. coli및 다른 세균들이 뉴클레오티드 서열에서 다른 형태들로 펩티드들을 코드화할 수 있음이 알려져 있기 때문에, 이들 단백질의 일부 코딩 영역들은 겹쳐질 수 있다. 또한, Val로 개시하는 것으로 보여진 모든 아미노산 서열은 사실 Met로 개시할 수 있다.
Claims (11)
- 치료학적 용도를 위한,E. coliK1 또는 그람-음성 세균에서 그것의 동족체로부터 얻을 수 있는tatA,tatB,tatC,tatE,mdoG,creC,recG,yggN,eck1,iroD,iroC,iroE,mtd2및ms1 내지 16로서 확인된 유전자들중 어느 것을 포함하는 오페론, 또는 그것의 기능성 단편에 의해 코드화되는 펩티드.
- 제 1항에 있어서, SEQ ID NOS. 2, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32 및 35-48로서 확인된 아미노산 서열들중 어느 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 치료학적 용도를 위한, 제 1항 또는 제 2항에 따른 펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 1항 또는 제 2항에 따른 펩티드를 발현하도록 형질전환된 숙주.
- 제 1항 또는 제 2항에 따른 펩티드를 포함하는 백신, 또는 그것의 발현을 위한 수단.
- 독성 유전자 돌연변이를 갖는 미생물을 갖는 미생물을 포함하는 백신으로서,유전자는 제 1항 또는 제 2항에 따른 펩티드를 코드화하는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 6항에 있어서, 두개의 유전자에 독성 유전자 결실을 갖고, 이들중 하나의 유전자는tatA를 코드화하고 그리고 나머지는tatE를 코드화하는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 6항에 있어서, 유전자는 병원성 아일런드 내에 놓여 있고, 상기 아일런드는 여기서 확인된 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
- 유력한 약제들을 선별하기 위한 또는 독성의 결실을 위한, 제 1항 내지 제 4항중 어느 한항 또는 SEQ ID NO. 33에 따른 생성물의 사용.
- 그람-음성 세균에 의한 감염에 관련된 상태의 치료 또는 예방용 약제 제조에의 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 따른 생성물의 사용.
- 제 10항에 있어서, 세균은E. coli인 것을 특징으로 하는 사용.
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