JPH09506254A

JPH09506254A - ＳＨＩＧＥＬＬＡＦＬＥＸＮＥＲＩ２ａのエンドテロトキシン

Info

Publication number: JPH09506254A
Application number: JP7515651A
Authority: JP
Inventors: ファサノ，アレッシモ; ノリエガ，フェルナンド; レヴィン，マイロン・エム; ナタロ，ジェームズ・ピー
Original assignee: ユニヴァーシティー・オブ・メリーランド・アット・バルチモア
Priority date: 1993-12-02
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 1997-06-24
Anticipated expiration: 2022-04-11
Also published as: AU1210595A; JP3903347B2; JP2009022299A; EP0734451B1; US5589380A; EP0734451A1; DE69434087D1; AU675028B2; DE69434087T2; ATE280229T1; JP2007020572A; JP2004337171A; WO1995015396A1; US5686580A; EP0734451A4

Abstract

(57)【要約】Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの実質的に純粋なエンテロトキシン、それを得る方法、該エンテロトキシンに対して結合特異性を有する抗体および非反応原性Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのワクチン候補物を開発するための該エンテロトキシンを利用する方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】ＳＨＩＧＥＬＬＡＦＬＥＸＮＥＲＩ２ａのエンドテロトキシン関連出願の相互参照本出願は、現在放棄された１９９２年６月５日出願の米国特許出願第０７／８９４，７７４号の一部継続出願である１９９３年１２月２日出願の米国特許出願第０８／１６０，３１７号の一部継続出願である。発明の分野本発明はＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの二つの実質的に純粋なエンテロトキシン（以下”ＳｈＥＴ１”および”ＳｈＥＴ２”と称する）、それらを得る方法、該エンテロトキシンに対する結合特異性を有する抗体および非反応原性Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａワクチンとなる物質を開発するための該エンテロトキシンの使用方法に関する。発明の背景Ｓｈｉｇｅｌｌａの分子的病因ついて、上皮細胞に浸入し、それによって赤痢を引き起こす能力に関与するそれらの遺伝子と遺伝子生産物に関して多くのことが記述されてきた（Makino et al.,Microb．Pathog.,5:267-274 (1988);Sansone tti et al.，Infect．Immun.,35:852-860 (1982); Hale et al，Infect．Immun .,40:340-350 (1983); Pal et al,J．Clin．Microbiol.,27:561-563 (1989);およびVenkatesan et al，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA.,85:9317-9321 (1988)）。対照的に、Ｓｈｉｇｅｌｌａが水分の多い下痢を引き起こす正確な機構は驚くほどにほとんど知られていない。Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ感染の病因のきわめて重要な特徴は上皮細胞の侵入に関わるものであるが、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａが水分の多い下痢を起こし得ることから、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａもエンテロトキシンを作ると仮定された（Rout et al.,Gastroente rology ，68:270-278 (1975)およびKinsey et al.,Infect．Immun.,14:368-371 ( 1976)）。より具体的には、以下の観察からＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａにおけるエンテロトキシンの存在が示唆されている：１．臨床的にはヒトにおけるＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ感染は、通常は少ない血液と粘液の赤痢性便の開始に先立って水分の多い下痢の期間により特徴付けられる（DuPont et al，J．Infect．Dis.,119:296-299 (1969);a nd Stoll et al，J．Infect．Dis.,146:177-183 (1982)）。温和な場合では、水分の多い下痢だけが起こって、エンテロトキシン原性大腸菌感染によるものと区別できない臨床的病床像をもたらすことがある（Taylor et al，J．Infect．Dis .,153:1132-1138 (1986)；and Taylor et al,J．Clin．Microbiol.,26:1362-136 6（1988））。２．Ｓｈｉｇｅｌｌａをサルに与えると、３つの臨床的症候群が見られる（Ro ute et al,Gastroenterology，68:270-278 (1975)）。一部のサルは赤痢のみを示し；あるものは水分の多い下痢のみを示し、あるものは水分の多い下痢と赤痢を示す。Ｒｏｕｔら（Gastroenterology，68:270-278 (1975)）によるインビボ潅流研究によれば、結腸内腔中への水の全体的な移送がすべての病気の動物に起こることが示された。対照的に、明白な水分の多い下痢（それのみまたはその後の赤痢をともなう）を有するサルの空腸のみにおいて、水、ナトリウムおよび塩化物イオンの全体的分泌が起こる。そのような全体的な輸送は、水分の多い下痢のない赤痢を示すサルの空腸には起こらない。空腸中の全体的な分泌は、小腸のこの解剖組織部位での異常組織学的知見をともなうものではなかった。３．水分の多い下痢を有するサルの空腸中への水と電解質の全体的な分泌は、空腸を経るＳｈｉｇｅｌｌａの侵入を必要とする（Kinsey et al，Infect．Immu n .,14:368-371 (1976)）。このことは、小腸をバイパスさせ、Ｓｈｉｇｅｌｌａを直接にサルの盲腸に接種することにより示された。臨床的な病気にかかった１６匹のサルのうち、１５匹が赤痢を示し、「・・・軽い下痢が先に生じることは非常に稀であった」。水とナトリウムの結腸への全体的な分泌は、盲腸内接種後赤痢にかかった病気のサルで記録されながらも、水または電解質移送の異常は病気の動物の空腸には観察されなかった。これらを一緒にすると、これらの観察は、Ｓｈｉｇｅｌｌａは空腸を通るにしたがって、感染の初期に分泌を引き出すエンテロトキシンを作ることを示唆している。しかし、他のＳｈｉｇｅｌｌａ種ではなくＳｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅにより作られる細胞毒／神経毒／エンテロトキシン（腸管毒）を除いて（O'Brien et al,Microbiol．Rev.,51:206-220 (1987); Keusch et al，Pharma c ．Ther.,15:403-438 (1982); and Fontaine et al，Infect．Immun.,56:3099- 3109 (1988)）、Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ以外のＳｈｉｇｅｌｌａがエンテロトキシンを実際に作るとの主張を立証するための説得性のある証明はほとんどなされてはいない。より具体的には、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの上清中のエンテロトキシン活性を検出しようとする当分野でのこれまでの試みはわずかに１例で肯定的な知見が得られたにすぎない。Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（Infect．Immun.,15: 796-798 (1977)）は、無細胞中の上清中で検出可能で、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ株Ｍ４２４３により作られた毒素を部分精製した。この毒素はウサギ回腸ループにおいて体液生産を促進したが、単層のヒーラ（ＨｅＬａ）細胞に対しても細胞毒性があり、マウス腹腔内に接種すると致死的であった。さらに、エンテロトキシン活性を検出するためにＦｅ⁺⁺のない培地で微生物を生育させることは必要ではなかった。さらに、上記のＯ’Ｂｒｉｅｎらにより記載された毒素、ｓｕｐｒａ、の細胞毒性はＳｈｉｇａ（Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１）毒素に対する抗血清により中和された。Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａと３ａの無細胞上清中のエンテロトキシン活性は、Ｋｅｔｙｉら（Ketyi et al,ActaMicrobiol．Acad．Sci．Hung .,25:165-171 (1978); Ketyi et al,ActaMicrobiol．Acad．Sci．Hung.,25:219 -227 (1978); and Ketyi et al,ActaMicrobiol．Acad．Sci．Hung.,25:319-325 (1978)）により報告された。Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａと３ａの二株の濾過超音波溶解物は、ウサギ回腸ループ中で迅速な体液蓄積を与えることがわかった（４時間アッセイ）。しかし、これらのループは接種の１８〜２４時間後に調べたときには体液蓄積を示さなかった。３ループのみに２つの試験株の各々を接種し、４時間後に試験したときに、一つの株の２／３と他の株の１／３のみが陽性であった。さらに、ＳｈｉｇｅｌｌａはＦｅ⁺⁺のない培地で生育しなかった。細胞毒活性とは明らかに切り離されたエンテロトキシン活性が無細菌培養上清中でＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａにより発現され、Ｆｅ⁺⁺のない培地での該細菌の生育後のみに検出できたことが本発明で初めて発見された。Ｆｅ⁺⁺のない培地で生育されたときに、腸侵入大腸菌（ＥＩＥＣ）は、分離されたウサギ回腸ループにおける体液蓄積とアッシングチャンバー（Ｕｓｓｉｎｇｃｈａｍｂｅｒｓ）における電気的応答を引き起こすエンテロトキシン（分子量約６８〜８０ｋＤａ）を作ることが報告された（Fasano et al，Infect．Immu n .,58:3717-3723 (1990))。腸侵入大腸菌とＳｈｉｇｅｌｌａとの間に存在することが知られている類似性に基づいて（Levine et al，J．Infect．Dis.,155:37 7-389 (1987)）、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａはＦｅ⁺⁺のない培地で生育したときにエンテロトキシンを発現すると本発明では仮定されている。本発明において、予期されずに、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａは二つの異なるエンテロトキシン（一つは染色体によりコードされ、別のものは侵入性の毒性プラスミドによりコードされる）を産生することが開示された。後者のエンテロトキシンは本発明においてＥＩＥＣエンテロトキシンと実質的に同じであることがわかった。発明の要約本発明の目的は、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａにより作られた２種類のエンテロトキシンを精製することである。本発明のもう一つの目的は、前記エンテロトキシンを作るようにＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａを培養する方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、前記エンテロトキシンに対して結合特異性を有する抗体を提供することである。さらに別の目的は、そのようなエンテロトキシンをコードする遺伝子の同定、クローニングおよび配列決定を行なうことである。本発明のさらにもう一つの目的は、Ｓｈｉｇｅｌｌａエンテロトキシン遺伝子の変異の結果として少なくとも１つの機能エンテロトキシンを作らないＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ変異体を提供することである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載の発明の詳細な説明で達成された。図面の簡単な説明図１は、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＭ４２４３株、Ｍ４２４３ａｖｉｒ株およびＢＳ１０３株の培養上清、ＥＩＥＣのＣＶＤ／ＥＩ−３４株（０１３６：Ｈ−）の３０〜１００ｋＤａ画分（陽性コントロール）および培養培地（陰性コントロール）を用いたときのアッシングチャンバーでのエンテロトキシン活性のアッセイ結果を示す。これらのアッセイにおいて、短絡電流の変化（デルタＩ_sc）を測定した。図２Ａ〜２Ｄは、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａエンテロトキシンに対する抗血清（抗ＳｈＥＴ）、ＥＩＥＣエンテロトキシンに対する抗血清（抗ＥＩＥＴ）、野性型Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａで誘発したボランティア（ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）の誘発前血清または誘発後血清で最初に中和されたＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＭ４２４３株の培養上清を用いたときのアッシングチャンバーでのエンテロトキシン活性のアッセイ結果を示す。これらのアッセイにおいて、短絡電流の変化（デルタＩ_sc）（図２Ａと２Ｃ）および上皮を横切る電位差（デルタＰＤ）（図２Ｂと２Ｄ）を測定した。図３Ａ〜３Ｂは、ウサギ回腸ループ（図３Ａ）およびアッシングチャンバー（図３Ｂ）においてアッセイしたときのＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＭ４２４３株のエンテロトキシン部分の分子量決定を示す。ウサギ回腸ループアッセイにおいて、体液蓄積が測定され、アッシングチャンバーにおいて短絡電流の変化（デルタＩ_sc）を測定した。図４は、６５〜７５ｋＤａカラム画分を示すＭ４２４３ａｖｉｒ株（ＳｈＥＴ１エンテロトキシンのみを含有）、未使用のニトロセルロース切片の抽出物（陰性コントロール）および６５〜７５ｋＤａカラム画分を表す試料（陽性コントロール）から得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥからのタンパク質バンドを用いたときのアッシングチャンバーにおけるエンテロトキシン活性のアッセイ結果を示す。値は、独立して調製された試料に関する観察の回数を表すＮによるＩ_sc変化（μＡｍｐ／ｃｍ²）として示している。図５はｔｉｅ遺伝子を含有するｐＪＳ２６中の断片の制限酵素地図ならびにｐＪＳ２６に由来するプラスミドの関連部分の制限酵素地図を示す。図６Ａ〜６Ｄ（配列番号１）は、腸侵入大腸菌によりコードされたＥＩＥＴエンテロトキシンのＤＮＡ配列ならびにその決定されたアミノ酸配列を示す。図７Ａ〜７Ｄ（配列番号２）は、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ侵入プラスミド上に位置するＳｈＥＴ２エンテロトキシンのＤＮＡ配列ならびにその決定されたアミノ酸配列を示す。図８は、ＳｈＥＴ１遺伝子を含有するｐＦ９−１−９０中の断片の制限酵素地図を示す。図９Ａ〜９Ｂ（配列番号１５）は、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ染色体上に位置するＳｈＥＴ１エンテロトキシンのＤＮＡ配列ならびにその決定されたアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明本発明において、エンテロトキシンはＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａをＦｅ⁺⁺のない培地に培養し、上清を集めることにより得られる。「Ｆｅ⁺⁺のない培地」とは本分野でよく知られ、用いられる表現である。この表現は、鉄のない培地、例えば、イミノ二酢酸イオン交換基を有するスチレンジビニルベンゼン樹脂マトリックスであるＣＨＥＬＥＸ（登録商標）（BioRad）で処理して培地中の微量の鉄を除去したシンケースブロス（ｓｙｎｃａｓｅｂｒｏｔｈ）が挙げられる。使用される特別な培養培地は本発明には重要ではない。そのような培養培地の例としては、Ｆｅ⁺⁺のないシンケースブロスまたはＬ-ブロスにエチレンジアミン-Ｎ-Ｎ’-二酢酸（ＥＤＤＡ）を添加したものが挙げられる。エンテロトキシンの最大生産がＦｅ⁺⁺のないシンケースブロスで得られるために、この培地が好ましい培養培地である。培養温度と培養時間は本発明には重要ではないが、通常培養温度は３０〜３７ ℃、好ましくは３６〜３７℃の範囲にあり、培養時間は２４〜７２時間、好ましくは４８〜７２時間の範囲にある。エンテロトキシンはサイズ排除クロマトグラフィーとＨＰＬＣクロマトグラフィーにより上清から精製することができる。Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａは、the Center for Vaccine Dev elopment、the Center for Disease Control、the Walter Reed Army Institute of Research、the Uniformed Services University of the Health Sciencesおよびthe Institut Pasteur等の多様な供給源から利用することのできるよく知られた毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ血清型である。本発明に用いられるＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの特別な株は本発明には重要ではない。そうしたＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ株の例としては、M4243、M4243avir、Sh igella flexneri 2a Chile 747、Shigella flexneri 2a Chile 3480（Ferreccio et al,Am．J．Epi.,134:614-627 (1991)）；2457T株（Kotloff et al,Infect.I mmun .,60:2218-2224 (1992)）；およびBS103（Andrews et al,Infect.,Immun.,5 9 :1997-2005 (1991)）が挙げられる。本発明に用いられる好ましいＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ株はＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＭ４２４３株とＭ４２４３ａｖｉｒ株である。Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＭ４２４３株およびそのプラスミド矯正誘導株であるＭ４２４３ａｖｉｒ株は、例えばワシントンＤ．Ｃ．のth e Walter Reed Army Institute of ResearchのサムエルＢ．フォーマル博士より得ることができる。ＢＳ１０３はメリーランド州ベテスダのthe Uniformed Serv ices University of the Health Sciencesのアントニー・マウレリ博士より得ることができる。本発明の二種類のエンテロトキシンに対して結合特異性を有する抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。精製エンテロトキシンに対するポリクローナル抗体は”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（A LaboratoryManual，Harlow and Dav id Lane，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)）に記載されているような通常の方法により調製することができる。精製エンテロトキシンに対するモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（Nature，256:495-497 (1975)）に記載されているような通常の方法により調製することができる。精製エンテロトキシンを用いて得られたモノクローナル抗体を用いてＳｈｉｇｅｌｌａ腸感染に対する受動免疫を誘導してもよい。そのような抗体はＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａエンテロトキシンに結合して細胞レセプターとのこれら相互作用を妨げ、水と電解質の分泌の促進を妨げる。受動免疫を誘導するために用いられる抗体の全量は通常は約１０ｍｇ〜１０ｇである。そのような抗体を産生するために用いられるトキソイドの全量は通常は約５００μｇ〜５．０ｍｇである。本発明の実質的に純粋なエンテロトキシンは非反応原性Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの経口生ワクチン候補の開発にも有用である。米国では背景として、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａが、病気に関連したＳｈｉｇｅｌｌａの最も通常の血清型の１つとされている。発展途上国では、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉは下痢の病気を引き起こすＳｈｉｇｅｌｌａの最も通常の血清型グループであり、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａがしばしば単一の最も通常の血清型である。チリ、サンチアゴにおけるＳｈｉｇｅｌｌａ感染が風土病である低社会経済集団での期待される疫学的研究によると、シゲラ症の初期の臨床的感染は同じ血清型によるその後の病気に対して顕著な保護を与えることが示された（Ferroccio et al,Am．J．Epidemiol.,134:614-627( 1991)）。野性型Ｓｈｉｇｅｌｌａによる下痢の病気の免疫効果も、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ（(DuPont et al,J．Infect．Dis.,125:12-16( 1972)）またはＳｈｉｇｅｌｌａｓｏｎｎｅｌ（(Herrington et al,Vaccine,8 :353-357 (1990)）による初期臨床感染が、均一な野性型微生物による再誘発に対して顕著な保護を与えた実験的シゲラ症のボランティアモデルにおいて示された。これらの観察はともに、単一の投与のみを必要とするワクチンによりシゲラ症に対する保護が可能であることを示唆するものである。Ｓｈｉｇｅｌｌａの弱毒化株をワクチンとして開発しようとする多くの試みがあった。いくつかの試みではその成功は限られたものとなった。１９６０年代には、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａおよび他の血清型のストレプトマイシン依存株が経口用生ワクチンとして開発され、利用された（Mel et al,Bu ll ．WHO，32:647-655 (1965); Mel et al,Bull．WHO，39:375-380 (1968); およびMel et al,ActaMicrobiol．Acad．Scient．Hung.,21:109-114 (1974)）。これらのストレプトマイシン依存株は安全であり、実施されたほとんどの効能調節フィールド試験でシゲラ症に対し、血清型に特異的な顕著な保護を与えた（Met et al,Bull．WHO，32:647-655 (1965); Met et al,Bull．WHO，39:375-380 (19 68); Mel et al,ActaMicrobiol．Acad．Scient．Hung.,21:109-114 (1974); およびLevine et al，Am．J．Epidemiol.,133:424-429 (1976)）。しかし、ストレプトマイシン依存Shigellaワクチンはいくつかの欠点がある。その一つは、保護を与えるためには間隔をおいた複数の投与がなされなければならないことである（多数（２〜４×１０¹⁰個）の生きているワクチン微生物を含有する２週間にわたる４投与量）。さらに、保護期間は比較的短いうちに終わる。二度目の予防注射投与は、保護を維持するために一年後に行なわなければならない（Mel et a l,ActaMicrobiol．Acad．Scient．Hung.,21:109-114 (1974)）。Ｉｓｔｒａｒｉら（Arch．Roumaines Pathol．Exp．Microbiol.,24:677-686 (1985)）により記載されたコロニーの変異Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａワクチン株Ｔ₃₂も耐性がよく、保護性があるが（Wang Bing Rui,Arch．Roumaines Pathol.E xp ．Microbiol.,43:285-289 (1984)）、尚も複数の投与が必要である。１９６０年代のストレプトマイシン依存性ワクチン及びＴ₃₂ワクチンの上記欠点のために、ちょうど単一の投与物の投与後に保護できる、さらに免疫原性のあるＳｈｉｇｅｌｌａワクチンを作ることを多くの研究者が試みた。それらのアプローチには下記のものが挙げられる：（１）大腸菌Ｋ−１２染色体の特定のセグメントを接合によりＳｈｉｇｅｌｌａに導入（Formal et al，Dev．Biol．Stand.,15:73-78 (1971);およびLevine et al，J．Infect．Dis.,127:261-270 (1973)）；（２）防御Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗原をコードするＤＮＡを大腸菌Ｋ−１２に導入（ Formal et al，Infect．Immun.,46:465-469 (1984)）；および（３）芳香族アミノ酸生合成経路の遺伝子を不活性化することにより、Ｓｈｉｇｅｌｌａを、ヒト組織中では利用できない基質に対して栄養依存性とする（Lind berg et al，Vaccine，6:146-150 (1988);およびKarnell et al,Rev．Infect．D is .,13(4):S357-361 (1991)）。残念なことに、上記アプローチの各々が制限されたものとなっている。すなわち、Ｓｈｉｇｅｌｌａが弱毒化用大腸菌ＤＮＡを有する雑種は不安定であり、その病毒力が完全に戻り得ることである（Levine et al，J．Infect．Dis.,127:26 1-270 (1973)）。さらに、Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗原を発現する大腸菌の最も新しい世代は、いくつかの個体でのワクチンの副反応、例えば熱、激しくはない下痢およびすべての赤痢と関連している（Kotloff et al,Infect．Immun.,60:2218-222 4(1992)）。最後に、△aroD Shigella flexneriの受けた者の一部は激しくはない下痢にかかった（Karnell et al,Rev．InfectDis.,13(4):S357-361 (1991))。これらの多様なＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ候補ワクチン株において直面する残ったままの下痢は、恐らく２種類のエンテロトキシンのためであるということが本出願で仮定されている。しがたって、例えば、他の弱毒化変異を含有させることに加えて、エンテロトキシンよりもむしろ一つまたは二つのトキソイドを発現するＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａワクチン候補物を構築することができる。これは、生物活性「毒性」部位をコードするエンテロトキシン部分を欠失させ、タンパク質の免疫原性配列をそのまま残すことにより達成することができる。具体的には、Ｓｈｉｇｅｌｌａ染色体の少なくとも１つのａｒｏ遺伝子（ａｒｏＡ、ａｒｏＣまたはａｒｏＤ）に欠失変異を導入して該株をパラアミノベンゼン酸（ヒトではインビボで十分に利用できない基質）に対して栄養素要求性としたＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ株（例えば以下の実施例８で調製されたＣＶＤ１２０３株（ＡＴＣＣＮｏ．５５５５６））を構築することができる。さらに、該株は、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの１４０ＭＤの侵入プラスミド上に発見されたｖｉｒＧ遺伝子中に独立して弱毒化を行なう欠失変異を有していることが好ましいであろう。このプラスミド遺伝子はｉｃｓａとしても知られており（Sansonetti et al，Vaccine，7:443-450 (1989)、Ｓｈｉｇｅｌｌａの細胞内と細胞間の広がりに関与している。この変異もＣＶＤ１２０３に存在している。ワクチンとなる物質、例えばＣＶＤ１２０３がちょうどこれらの変異ではまだ十分には弱毒化されていないことを認識し（エンテロトキシンの産生能は完全にそのままの状態にあるために）、エンテロトキシン遺伝子を変異させることができる。１つの種類の変異、例えば実質的にすべてのエンテロトキシン遺伝子の欠失は全体的にエンテロトキシン産生を不活性化して非エンテロトキシン原性株をもたらす。第二の変異、例えばエンテロトキシン遺伝子の一部の欠失はトキソイド（すなわち毒素の毒性は持っていないが免疫原性部分は保持している修飾タンパク質）の発現をもたらす。このもう一つの変異により二種類のトキソイドを発現するワクチン候補株が得られよう。これらのトキソイドを用いてＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ感染に対する能動免疫を誘導することができる。この欠失の特定の大きさは本発明にとって重要ではなく、エンテロトキシンの完全な不活性化を望むのか、または単純にトキソイドの産生を望のかにより容易に決めることができる。実施例７に示されているように、ＳｈＥＴ１は二つの異なる遺伝子（図９Ａと図９Ｂ、配列番号１５）によりコードされている。ＳｈＥＴ１遺伝子と他のエンドトキシン（例えばコレラ毒素またはエンテロトキシン原性大腸菌の熱不安定エンテロトキシン）をコードする遺伝子との類似性に基づくと、大きなオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）が活性サブユニットをコードしている。よって、このオープンリーディングフレームの内部欠失は免疫原性トキソイドの産生を引き起こすであろう。エンテロトキシン遺伝子をコードする本発明の単離ＤＮＡ分子はいかなる適当なプラスミドやベクターにもクローニングすることができ、例えばプローブとして用いられる大量のＤＮＡを作ったり、変異エンテロトキシン遺伝子をワクチン株に組み込むために用いることができる。「単離（された）」という表現はここではその自然の環境から離されている（例えばＤＮＡ分子が、本発明において得られた元の親染色体または親プラスミドから分離されている）ことを意味する。よって、ここで用いられている「単離（された）」は外来宿主か外来プラスミド中にＤＮＡ分子が存在していることを包含する。以下の実施例は具体的な説明の目的のためだけに示すもので、決して本発明の範囲の限定を意図するものではない。実施例１エンテロトキシンの製造Ａ．培養濾過画分の調製Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＭ４２４３株とそのプラスミド矯正誘導株Ｍ４２４３ａｖｉｒとＢＳ１０３を、５ｍｌのＣＨＥＬＥＸ（登録商標）（カリフォルニア州リッチモンドのＢｉｏＲａｄ）で処理したＦｅ⁺⁺のないシンケースブロス（O'Brien et al,J．Infect．Dis.,136:763-759 (1982)）中で振盪しながら３７℃で一晩生育させた。ＣＨＥＬＥＸ（登録商標）はブロス中に存在する鉄と結合する。用いられたすべての培養容器は、６．０ＮＨＣｌに一晩浸して、蒸留脱イオン水で洗って確実に鉄を除去した新しいプラスチックまたはホウ素シリケートガラスであった。次に、得られた培養ブロス５０μｌをバッフル付Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ中の５．０ｍｌのＦｅ⁺⁺のないシンケースブロス中で二次培養し、上記条件下でさらに４８時間インキュベートした。７２時間のインキュベーション後、培養物を２０分間４℃で１２，０００×ｇの遠心により集め、その上清を０．４５μｍ濾過膜（マサチューセッツ州ベッドフォードの Millipore Products）を通して「無菌上清」を得た。Ｂ．ウサギ回腸ループ試験上記のようにして得られたＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ株Ｍ４２４３とそのプラスミド矯正誘導株Ｍ４２４３ａｖｉｒの全培養液を、それらの各々の上清とともに標準ウサギ回腸ループ試験で調べた。（ウサギ回腸ループにおいて体液蓄積を誘導する）ＥＩＥＣ株ＣＶＤ／ＥＩ−３４（０１３６：Ｈ−）と非病原性大腸菌ＨＳもそれぞれ陽性コントロールと陰性コントロールとして各実験に含めた（Fasano et al，Infect．Immun.,58:3717-3723 (1991)）。ＥＩＥＣ株ＣＶＤ／ＥＩ−３４（０１３６：Ｈ−）は、the Center for Vaccine Devel opment strain collectionから得られた。大腸菌ＨＳはWalter Reed Army Insti tute of Researchのハーマン・シュナイダー博士より入手した。さらに具体的には、体重２〜３ｋｇのオス成熟ニュージーランド白ウサギに２４時間餌を与えず、水は自由にとれるようした。これらの動物を次に５０ｍｇ／ｋｇケタミンと１．０ｍｇ／ｋｇのアセプロマジンの混合物を筋内投与することのより麻酔した後、７．０ｍｇ／ｋｇのキシラジンを筋内投与した。細菌培養物を１０⁸〜１０⁹ＣＦＵ／ｍｌに達するように生育させた。全培養物または各無菌上清を１．０ｍｌの標準容積にて、中間虫垂に最も近い結び目部分近くの麻酔ウサギ腸の内腔中に注入した（Moon et al，Ann．NY．Acad．Sci.,17 6 :197-211 (1971)）；第二の結び目部分を作って接種部位を分離させた。回腸の基部に沿って、二重結び目で分離した７〜８ｃｍ長さの一連の５〜６ループを分離させ、接種した（Moon et al，Ann．NY．Acad．Sci.,176:197-211 (1971)）。インキュベーションの１８時間後、動物を殺し、該ループの体液容積と長さを測定し、各ループからの腸の切片を１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン生理食塩水により固定化し、光学顕微鏡により調べた。ループ試験の結果を以下の表１の実験１に示す。上記の表１の実験１において示されているように、陽性コントロール（Ｍ４２４３の全生存培養物およびそれからの無菌培養上清）を注入された腸ループは接種後１８時間で顕著な体液蓄積を示し、全生存培養物では２倍以上の体液蓄積を示している。さらに、上記の表１の実験１に示されているように、Ｍ４２４３ａｖｉｒ（全培養物と無菌上清の両方）により誘導された体液蓄積は陰性コントロール株ＨＳよりも有意に高いものではなかった。ウサギ回腸ループにおいて記録された消化管の長さに対する体液（０．５ｍｌ／ｃｍ）は目盛付シリンジ（液体）と物差し（長さ）を用いて測定されたもので、腸出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）株９３３Ｊ、血清型（０１５７：Ｈ７）を用いて観察されたもの（１．５〜２．０ｍｌ／ｃｍの比率が見られる）よりも実質的に低い。しかし、目盛付シリンジ（液体）と物差し（長さ）を用いて測定された消化管長さに対する記録体液は全分泌と体液蓄積の明確な証拠も現している。各ループからの腸の切片の組織学的検査で、激しい組織損傷がＭ４２４３の全培養物を用いて観察され、これは内腔上皮の主要な壊死と腸絨毛の顕著な萎縮により特徴付けられる。対照的に、Ｍ４２４３無菌培養上清による場合は、組織損傷は検出されなかった。さらに、Ｍ４２４３ａｖｉｒの全培養物またはそれからの無菌上清を用いた場合にも組織損傷は観察されなかった。さらに、陰性コントロール株ＨＳとともにインキュベートした組織でも組織損傷は観察されなかった。インキュベーション時間と培地中の鉄含量がこのエンテロトキシン部分の完全発現に重要であるかどうかを決定するために、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＭ４２４３株をＦｅ⁺⁺含有培地（Ｌブロス）およびＦｅ⁺⁺のない培地（シンケースブロス）で培養した。各培地で２４時間と７２時間のインキュベーション後、上記のように無菌上清を得て次に回腸ループに注射された。これらの結果は上記の表１の実験２に示す。上記の表１の実験２に示されているように、Ｆｅ⁺⁺のない培地条件はエンテロトキシンの発現を検出するために必要とされる。さらに、エンテロトキシン発現はインキュベーション時間の長さにより顕著に影響を受けることはなかった。ウサギ回腸ループアッセイで得られた結果はＭ４２４３によるエンテロトキシンの産生と一致した。Ｃ．アッシングチャンバーこれらの実験は以前にＧｕａｎｄａｌｉｎｉら（J．Pediatr．Gastroenterol.Nutr .,6:953-960（1987））により記載されたように行なった。簡単に記載すれば、体重２〜３ｋｇのオス成熟ニュージーランド白ウサギをメトキシフルラン吸入により麻酔して、空気を断って殺した。末端回腸の２０ｃｍセグメントを除去し、これを腸中間に沿って開き、腸内容物がないように洗浄し、筋肉層と漿膜層を外した。このように調製された腸の４片を次にルサイト・アッシングチャンバー（１．１２ｃｍ²の開口）に乗せ、５３ｍＭＮａＣｌ、５．０ｍＭＫＣｌ、３０．５ｍＭＮａ₂ＳＯ₄、３０．５ｍＭマンニトール、１．６９ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．３ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１．２５ｍＭＣａＣｌ₂、１．１ｍＭＭｇＣｌ₂および２５ｍＭＮａＨＣＯ₃を含有するリンガー溶液に漬けた。実験中、該組織を３７℃に保ち、９５％Ｏ₂−５％ＣＯ₂の気体で処理した。組織がいったん安定な条件に達したら、Ｆｅ⁺⁺のない培養液からのＭ４２４３、Ｍ４２４３ａｖｉｒまたはＢＳ１０３無菌上清のいずれか３００μｌを粘膜表面に加えて、元の培養濾過濃縮物の１：３３希釈物を得る（０．３ｍｌを１０ｍｌのリンガー溶液に加える）。Ｍ４２４３、Ｍ４２４３ａｖｉｒまたはＢＳ１０３無菌上清のいずれか３００μｌも漿膜側に加えて浸透バランスを保つ。上皮を横切る電位差（デルタＰＤ）、全組織電気伝導（Ｇｔ）および短絡回路（デルタＩ_sc）の変化を記録した。ＥＩＥＣ（０１３６：Ｈ−）およびＣＨＥＬＥＸ（登録商標）処理シンケースブロス（培養培地）からの３０〜１００ｋＤａ上清画分もそれぞれ陽性コントロールと陰性コントロールとして同じ方法で試験した。４動物を各試験に用いた。結果を図１に示す。図１に示されているように、Ｉ_SCの全体的な増加は陰性コントロール（培養培地）と比較してＭ４２４３上清が有意に高く（^**＝Ｐ＜０．０２）、陽性コントロール（ＥＩＥＣ０１３６：Ｈ−）により誘導されたものと大きさが類似していた。一方、プラスミド矯正誘導株のＭ４２４３ａｖｉｒとＢＳ１０３からの上清は、プラスミド含有親株と比較して有意に低いエンテロトキシンを発現した（^* ＝Ｐ＜０．０５）。しかし、Ｍ４２４３ａｖｉｒとＢＳ１０３上清のエンテロトキシン活性はそれにもかかわらず陰性コントロール（培養培地）よりも有意に高かった（^*＝Ｐ＜０．０５）。そのような理由の可能な解釈は、（１）染色体毒素遺伝子を調節するプラスミドにコードされた調節因子、（２）Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ染色体とプラスミドの両方に置かれている同じ遺伝子の複数コピー、または（３）異なるエンテロトキシン因子をコードする侵入プラスミド上の遺伝子を包含する。以下に説明するように、この最後の仮定が正しいものとわかった。Ｍ４２４３株のプラスミド矯正誘導株は回腸ループとアッシングチャンバーの両方で野性型よりも低いエンテロトキシン活性を示した。アッシングチャンバーのみでＭ４２４３ａｖｉｒは、陰性コントロールとは有意に異なる変化を誘導した；このことは回腸ループアッセイと比較してアッシングチャンバー技術の高い感度によるものであろう。これらのデータは、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａＭ４２４３のビルレンスプラスミドはその効果のために絶対的に必要ではないが、エンテロトキシン活性を向上させることを示唆している。Ｄ．エンテロトキシンの中和ＥＩＥＣ（０１３６：Ｈ−）とＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａは多くの類似性、例えば表面抗原、同じプラスミド（ｐＩｎｖ）、臨床的徴候等を分け合っている。よって、ＥＩＥＴ（０１３６：Ｈ−）により作られるエンテロトキシンとＭ４２４３により作られるエンテロトキシンとの間に免疫学的関連性があるかどうかを決定するために中和実験を行なった。より具体的には、Ｍ４２４３無菌上清の３０〜１００ｋＤａ画分６００μｌ（以下の第Ｅ章を参照）を抗ＳｈＥＴポリクローナル血清（抗Shigella flexneri 2aエンテロトキシン）または抗ＥＩＥＴポリクローナル血清（抗腸侵入大腸菌エンテロトキシン）または誘発前または誘発後の回復期患者血清とともに６０分間、３７℃でインキュベートした。抗ＳｈＥＴポリクローナル血清、抗ＥＩＥＴポリクローナル血清および回復期患者血清は実施例２に記載のように得た。得られた試料を、アッシングチャンバー中で、上記の第Ｃ章に記載のようにチャンバーの各側面に添加された各混合物の半分を用いて調べた。結果を図２Ａ〜２Ｄに示す。図２Ａ〜２Ｄに示されているように、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａエンテロトキシンに対するポリクローナルウサギ抗体（抗ＳｈＥＴ）またはＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａによる誘発を受けた患者ボランティアの回復期血清とともにＭ４２４３上清をプレインキュベートしたときに、アッシングチャンバーでの電気的応答は劇的に減少した。この中和は、応答が活性画分のみを試験するときに見られた応答と同等である免疫前血清コントロール実験のいずれでも観察されなかった。Ｍ４２４３上清を腸侵入大腸菌エンテロトキシンに対するポリクローナル抗体（抗ＥＩＥＴ）とともにプレインキュベートしたときには、部分的交差中和のみが観察された。図２Ａ〜２Ｄにおいて、試験された動物の数は４であった。値は平均±ＳＥである。ＰＢＳ（陰性コントロール）と比較して、^*＝ｐ＜０．０５および^**＝ｐ＜０．０２。これらの結果を一緒にすると、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ上清は、ＳｈＥＴ１（その遺伝子はＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ染色体上に位置する）およびＳｈＥＴ２（その遺伝子は侵入プラスミド上に位置する）の２種類のエンテロトキシン部分を恐らく含有していることが示唆された。両エンテロトキシンは、抗Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ抗血清を用いたときに中和された。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ上清の腸毒素を部分的に中和するＥＩＥＣ抗血清の能力は、ＳｈＥＴ２遺伝子に対するＥＩＥＴ遺伝子の高い類似性（９９％）のためであった（下記参照）。Ｅ．分子質量の評価Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａエンテロトキシン分子（Ｍｒ）の評価を得るために、Ｍ４２４３の無菌上清を、ＤＩＡＦＬＯ限外ろ過膜（マサチューセッツ州のダンバース、Amicon社）による超遠心により分画した。ＹＭ１００膜（カットオフ分子量100,000）とＹＭ３０（カットオフ分子量30,000）膜を用いてこれらのサイズリミットにより限定される画分を得た。膜に保持された物質はリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）で洗浄して低分子量種を除去し、ＰＢＳを用いて連続的な１０：１容量希釈を２回行い、再濃縮し、最後にＰＢＳ中で最初の容量になるまでに再構成した。１００ｋＤａ以上、３０〜１００ｋＤａおよび０．５〜３０ｋＤａの粗い分子量プールを表すそれぞれの画分をエンテロトキシン活性についてアッシングチャンバーと回腸ループにより調べた。結果を図３Ａ〜３Ｂに示す。図３Ａ〜３Ｂに示されるように、回腸ループ（図３Ａ）とアッシングチャンバー（図３Ｂ）の両方のアッセイによれば活性エンテロトキシン画分は３０〜１００ｋＤａサイズ範囲内にあった。図３Ａ〜３Ｂにおいて、試験動物の数は４であった。値は平均±ＳＥである。他の画分および陰性コントロールと比較して、^*＝ｐ＜０．０５および^**＝ｐ＜０．０２。Ｆ．細胞毒アッセイエンテロトキシン活性と細胞毒活性との間に関連性があるかどうかを確認するために以下の実験を行なった。細胞溶解物を以下のようにして得た。Ｍ４２４３株の培養物を１２，０００× ｇで２０分間４℃遠心することにより集めた。上清を０．４５μｍフィルターを通し、アッセイのために保持した。次に微生物細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、フレンチ加圧セルにて１２，０００ｌｂ／ｉｎ²で壊して細胞溶解物を得た（Fasano et al，Infect．Immun.,58:3717-3723 (1991) ）。次に、この細胞溶解物を３．５ｍｌのＰＢＳ（最終容量５．０ｍｌ）と混合し、１８，０００×ｇで４℃、２０分間遠心することにより清澄とし、０．４５ μｍ膜によるフィルター無菌化を行なった。Ｍ４２４３株の培養上清画分は上記の第Ｅ章に記載のように得た。細胞毒アッセイは細胞溶解物と３種類の異なる培養上清画分（３０ｋＤａ以下、３０〜１００ｋＤａ、および１００ｋＤａ以上）について、Ｖｅｒｏ細胞を用い、Ｇｅｎｔｒｙらの方法（J．Clin．Microbiol.,12:361-366 (1980)）にしたがって行なった。培養上清画分と細胞溶解物の一連の２倍希釈物（１：２〜１：６４）を調べ、Ｖｅｒｏ細胞の５０％を殺すのに必要とされる細胞毒量（ＣＤ₅₀ ）を分光光度計を用いて評価した（Gentry et al，J．Clin．Microbiol.,12:361 -366 (1980)）。Ｓｈｉｇａ様毒素１（ＳＬＴ１）を作るエンテロ腸出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）株９３３Ｊ、血清型０１５７：Ｈ７の全培養上清と細胞溶解物をＶｅｒｏ細胞毒アッセイの陽性コントロールとして用いた（Fasano et al，Infect．Immun.,58: 3717-3723 (1991)）。病原性のアッセイと臨床的研究において陰性コントロールとして広く用いられている非病原性大腸菌株ＨＳの全上清（Levine et al，Lanc et ，I:1119-1122 (1978);およびLevine et al，J．Infect．Dis.,148:699-709 ( 1983)）をＶｅｒｏ細胞毒アッセイの陰性コントロールとして用いた。陽性コントロール（ＥＨＥＣ）は１：６４希釈でＶｅｒｏ細胞の５０％以上を殺したので、ＥＨＥＣの上清と溶解物はともに１０倍希釈物を試験した。細胞毒力価は、３０〜１００ｋＤａ培養上清画分または細胞溶解物のＣＤ₅₀／ｍｇタンパク質の逆数として表し、タンパク質含量はＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Anal．Bi ochem .,72:248-254 (1976)）により測定した。陽性コントロール株であるＥＨＥＣ株９３３Ｊ血清型（０１５７：Ｈ７）の上清と溶解物の両方が高いレベルの細胞毒（それぞれ０．５×１０³と３．４×１０⁴ＣＤ₅₀／ｍｇタンパク質）を示した。対照的に、ＨＳの上清である陰性コントロールは細胞毒を示さなかった。これらの二つの両極端に対して、Ｍ４２４３は低いレベルの細胞活性を示し、この活性がみられたのは３０ｋＤａ以下の上清画分（４．２×１０²ＣＤ₅₀／ｍｇタンパク質）と細胞溶解物（５．１×１０²ＣＤ₅₀／ｍｇタンパク質）に限定された。上記の細胞毒アッセイを、Ｖｅｒｏ細胞の代りにＨｅＬａ細胞を用いた以外は同じように繰り返した。この実験の結果、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ上清と細胞溶解物から得られた３０〜１００ｋＤａ画分もＨｅＬａ細胞に対して細胞毒活性を持たないことがわかった。一方、予想されかつＶｅｒｏ細胞を用いて得られた結果と一致して、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａから得られた３０ｋＤａ以下の上清画分のみがＨｅＬａ細胞に対して細胞毒活性を有している（３．２×１０²ＣＤ₅₀／ｍｇタンパク質）。さらに予想されたように、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａからの３０ｋＤａ以下の画分を含有する細胞溶解物もＨｅＬａ細胞に対して細胞毒活性を有している（４．４ ×１０²ＣＤ₅₀／ｍｇタンパク質）。よって、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ中に発見されたエンテロトキシン（３０〜１００ｋＤａ画分）活性と細胞毒（３０ｋＤａ以下の画分）活性は二つの異なる部分の結果である。したがって、３０〜１００ｋＤａ画分（ここでエンテロトキシン活性が見られる）はウサギ回腸ループでの体液蓄積とアッシングチャンバーでの電気的応答を招いたので、エンテロトキシンはＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａにより誘導される下痢の原因であるように思われる。実施例２抗血清の調製Ａ．ウサギにおける抗体の調製エンテロトキシン活性を示したＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ株Ｍ４２４３の上清からの３０〜１００ｋＤａ画分１．０ｍｌを等量のフロイントの完全アジュバントと混合し、オスのニュージーランド白ウサギの離れた４部位に筋肉内接種した。ブースター（追加抗原刺激）投与（１．０ｍｌ）を４週間後に行い、その１ヵ月後に動物から血液を採取して抗血清を得た。ＣＶＤ／ＥＩ− ３４株（０１３６：Ｈ−）からのＥＩＥＣエンテロトキシン（ＥＩＥＴ）に対する抗血清を同じ方法で調製した。これらの抗血清はここでは抗Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａエンテロトキシン（抗ＳｈＥＴｓ）と抗腸侵入大腸菌エンテロトキシン（抗ＥＩＥＴ）と呼ぶ。Ｂ．ヒトにおける抗体の調製Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａＭ４２４３の接種後に下痢にかかった１０人の成人ボランティアからの誘発前および誘発後の（回復期）血清プール（Kotloff et al,Infect．Immun.,60:2218-2224 (1992)）を調製してアッシングチャンバーでの中和実験（図２Ｃと２Ｄ）とウェスタンイムノブロット（図４）に用いた。実施例３Ｓｈｉｇｅｌｌａエンテロトキシン１（ＳｈＥＴ１）の精製とその部分配列の決定Ａ．精製Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａエンテロトキシンのラージスケール精製を、さらに特性付けと分析を行なうために十分な量の材料を得るために行なった。ＳｈＥＴ２の発現とプラスミドにコードされた膜関連タンパク質の発現を避けるために、プラスミド矯正Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａＭ４２４３ａｖｉｒを用いた（Hale et al，Infect．Immun.,50:620-629 1985）。この膜関連タンパク質はエンテロトキシン活性を示す画分に対して大きさが類似し、ボランティアのヒトにおいて抗原性のあることが知られている（Van De Verg et al,J.Infect ．Dis.,166:158-161 (1992)）。より具体的には、プラスミド矯正Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａを、鉄キレーターであるエチレンジアミン−ジ−ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸（ＥＤＤＡ）を２５μｇ／ｍｌで含有する３０リットルのＬブロスに接種し（Roge rs，Infect．Immun.,7:445-456 (1973)）、New Brunswick Scientificの３０リットルファーメンターにて３７℃で一晩インキュベートした。細菌細胞をSharpl es工業用遠心機で５，０００×ｇの遠心により除去し、上清を０．４５μｍフィルターで濾過した。この濾液（約３０リットル）を、これらの大きな容量の限外濾過処理のためにペリコンタンジェンシャルフローカセット（Millipore）を用いた以外は上記のように分画し、３０〜１００ｋＤａ範囲にある部分を単離し、１００倍に濃縮した。この濾液は、プラスミド矯正株を用いる小さなバッチについて観察されたレベルと類似するエンテロトキシン活性を示した。次に、この３０〜１００ｋＤａ濃縮物の１０ｍｌアリコートをさらにＨＰＬＣサイズ排除カラム（カリフォルニア州トランス所在のPhenomexのガードカラムを備えた７．５×６００ｃｍのＳＥＣ−２０００）による２回の分離により分画を行なった。フラクションはＰＢＳで０．５ｍｌ／分でカラムから溶出させた。６５〜７５ｋＤａ範囲の部分を含有する画分を集め、プールし、１０ｋＤａ膜（カリフォルニア州ロサンゼルス所在のSpectrum Medical IndustriesのMicroProDiC on）を用いた真空透析により１．０ｍｌまで濃縮した。この材料の一部をエンテロトキシンアッセイのためにとっておき、残りのものを、周囲にマーカーレーンを有する１１ｃｍの調製用ウェルを用いた硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した（Laemmli,Nature，22 7 :680-685 (1970)）。得られた１８バンドをＴｏｗｂｉｎらの方法（Towbin et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA.,76:4350-4354 (1979)）にしたがってニトロセルロース膜に移した。このニトロセルロース膜から２ｍｍ幅の多数の垂直切片を作り、コロイド状の金（ニュージャージ州ピスカタウェイ所在のJanssen PharmaceuticaのAurodye）で染色してタンパク質バンドを目に見えるようにするか、ウェスタンイムノブロット法によりプールされた回復期血清と反応させた（Vial et al，J．Infect．D is .,158:70-79 (1988)）。５本のタンパク質バンドを、それらの抗原性関連性を示す回復期血清ウェスタン切片を用いて同定した。これらの５本のタンパク質バンドを、ＰｏｎｃｅａｕＳ（コロイド状の金（Harlow et al，Antibodies: A LaboratoryManual，p．4 94 (1988)）で可逆的に染色しておいたニトロセルロースブロットの残りと一直線にして並べた。５本のタンパク質バンドの各々からの免疫反応性材料に対応する長さ約１０ｃｍのバンドを、ウェスタンとタンパク質染色切片の同定および重なりによって注意深くメスを用いて切り出した。これらのバンドの各々からの材料を２００μｌのジメチルスルホキシドに切片のニトロセルロースを溶解することにより溶出し（Montelero,Electrophoresis，8:432-438 (1987)）、４体積分の水を加えてニトロセルロースを析出させた後、１０，０００×ｇの遠心を行い、上清をＰＢＳに対して透析した。次に、保存された６５〜７５ｋＤａのサイジングカラム画分および各々陽性と陰性コントロールとして擬似ブロットされた切片、抽出されたニトロセルロース切片からの材料に加えて、各試料を上記実施例１に記載のようにアッシングチャンバーでそれらのエンテロトキシン活性を調べた。結果を図４に示す。図４に示されているように、分子量それぞれ約６３ｋＤａ、５３ｋＤａおよび４１ｋＤａのバンドの３本がエンテロトキシン活性を示した。４１ｋＤａの分子量に対応するバンドの複製が７０．４μＡｍｐ／ｃｍ²のＩ_scの一致する平均的な上昇を示したが、６３ｋＤａと５３ｋＤａのバンドはそれぞれ２４．３と１９．５μＡｍｐ／ｃｍ²のＩ_scの上昇を示した。残りの二つの免疫反応性バンドはエンテロトキシン活性を示さなかった。野性型Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａが与えられたボランティアの回復期血清は抗体を含有しており、これら抗体はアッシングチャンバー中でＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ上清のエンテロトキシン活性を中和し、そうした活性を示すことが示された固定化タンパク質に特異的に結合するとの観察から、ＳｈＥＴ１が免疫応答を誘因する場合にインビボで発現されることを示している。したがって、このエンテロトキシンはヒトにおけるＳｈｉｇｅｌｌａ下痢の病因に一定の役割を果たしている可能性が高い。Ｂ．ＳｈＥＴ１のＮ末端配列の決定配列決定のためのさらに大量のタンパク質を得るために、クロマトグラフィー操作のスケールアップを４℃のジャッケット付５×１００ｃｍＸＫ５０／１００カラム（Pharmacia）に充填のＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００（ニュージャージー州ピスカタウェイ、Pharmacia）を用いて行なった。電気泳動転写用のニトロセルロースの代りにポリビニリデンジフルオリジン膜（MilliporeのImmobilon ）を用いた以外は上記と同じように６５〜７５ｋＤａの大きさの画分を処理した。上述のように同定した３タンパク質バンドを切り出し、蒸留水でよくすすぎ、乾燥させた。タンパク質のバンドを有する個々の切片を次にApplied Biosystems のシーケンサー４７７Ａモデルを用いてＨａｌｌら（J．Bacteriol.,171:6372-6 374 (1989)）に記載されたようにそのＮ末端配列を決定した。決定されたＮ末端配列データを以下の表２に示す。上記の表２に示されているように、３バンドのいずれにも利用可能な材料からの一定の伸長配列は決定できなかった。しかし、同一の推定アミノ酸配列はすベての３バンドの最初の４残基について見つかった。さらに、得られたデータから、二つの別個のＮ末端が同一であることが示唆された。注意すべきことに、このことは調べられた全ての３バンドについて合致した。ウィスコンシン大学のパッケージ（ウィスコンシン州マジソン、Genetics Com puter Group）（Devereux et al，Nucleic Acids Res.,12:387-395 (1984)）、すなわち公知のタンパク質配列と翻訳されないＤＮＡ配列を有するデータベースを詳細に調べて、上記試料から得られた推定Ｎ末端配列に対する潜在的アミノ酸相同性を有するものを同定した。ＧｅｎＢａｎｋリリース７５．０とＰＩＲＰｒｏｔｅｉｎ３５．０もＴＦＡＳＴＡとＷＯＲＤＳＥＡＲＣＨプログラムを用いて調べた。伸長アライメントの明らかな領域の存在は発見されなかった。さらに、公知の細菌毒素に対する実質的な相同性は見付けられなかった。細菌エンテロトキシンによく見られる共通のＡ：Ｂ_n活性：結合ユニット部分、例えば、コレラ毒素（ＣＴ）（LoSpalluto et al，Biochem．Biophys．Acta,2 57 :158-166 (1972)）、エンテロトキシン原性大腸菌の熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ）（Clements et al，Infect．Immun.,38:806-809 (1982)）およびＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＳｈｉｇａ毒素（Olsnes et al，J．Biol．Chem. ,256:8732-8738 (1981);およびSeidah et al，J．Biol．Chem.,261:13928-13931 (1986)）が上記データに反映されているかも知れない。すなわち、表２に提案されているように、活性物質の見掛け上の分子の大きさは以前に同定されたエンテロトキシンのＡ（２８〜３２ｋＤａ）サブユニットとＢ（７．７〜１１ｋＤａ）サブユニットの大きさに基づく上述の化学量論に一致する。伸長により、６５〜７５ｋＤａの大きさおよびＡ１：Ｂ４構造と一致するホロトキシンはこれらの規則により予測されるであろう。これらの仮の立体配置も、エンテロトキシンをエンテロ細胞に付着、侵入させて腸における分泌を開始させる結合ドメインと活性ドメインの通常の要件を満足させている。実施例４腸侵入大腸菌エンテロトキシン遺伝子の配列決定腸侵入大腸菌からのエンテロトキシンの同定とクローニングのために遺伝子アプローチを用いた。より具体的には、ＴｎｐｈｏＡ挿入変異体をＥＩＥＣのＥＩ −３７株（０１３６：ＮＭ）（Fasano et al，Infect．Immun.,58:3717-3723 (1 991)）にＴａｙｌｏｒら（J．Bacteriol.,171:1870-1978 (1989)）に記載されたように作った。得られたＴｎｐｈｏＡ挿入変異体を、標準Ｌ寒天と比較して低い鉄含量のＬ寒天（３０μｇ／ｍｌのＥＤＤＡを含有）中でアルカリ性ホスファターゼの向上発現についてスクリーニングした。その結果、アルカリ性ホスファターゼの向上発現を示した９種類の挿入変異体が同定された。次に、得られた９種類のＴｎｐｈｏＡ挿入変異体からの上清を上記のようにアッシングチャンバーで試験し、２種類の変異体でＩ_scの変化により定義されたエンテロトキシン活性が野性型親株よりも有意に低いことがわかり、エンテロトキシン活性をコードするオープンリーディングフレーム中にｐｈｏＡ遺伝子が挿入されたことが示唆された。次に、これらの２種類の変異体からＤＮＡを精製し、精製ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した。ＴｎｐｈｏＡ挿入物に隣接するこれら得られたＤＮＡ断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳｋ＋／−（カリフォルニア州ラ・ジョラ、Strata gene）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。次に、このクローンニングされたＤＮＡをＥＩＥＣのＥＩ−３４株のｐＨＣ７９コスミドライブラリーに対してハイブリダイゼーションを行なった（Fasano et al，Infect．Immun.,58:3717-372 3(1991)）。２つのＴｎｐｈｏＡ挿入変異体の１つからの隣接ＤＮＡ配列は９個のコスミドクローンに対して相同性のあることがわかった。これらコスミドクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋／−にランダムにサブクローニングすることにより、アッシングチャンバーでエンテロトキシン活性をコードすることがわかった２．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片の同定を行なった。この断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋／−のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化したとき、ｐＪＳ２６をもたらした（図５）。ＤＨ５α（メリーランド州ガイサースベルク所在のGibco/BRL Life Technologies）をｐＪＳ２６で形質転換したところ、アッシングチャンバーにて再現性のあるＩ_sc増加を示すことがわかった。２．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列をマニュアルで決定し、６２．８ｋＤａと１６．１ｋＤａの予想されるペプチドをコードする二つの潜在的なオープンリーディングフレームが発見された（図５）。２．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片をＣｌａＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩとＣｌａＩとで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳｋ＋／−にサブクローン化して、６２．８ｋＤａオープンリーディングフレームのみを有するｐＪＳ２６４を作った（図５）。ｐＪＳ２６４で形質転換されたＤＨ５αは、アッシングチャンバーで全２．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片による場合と類似のＩ_scの増加を示した。ｔｉｅと命名された（"toxin invasive E．coli"）このオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列をその決定されたアミノ酸配列とともに図６Ａ〜６Ｄ（配列番号１）に示す。２．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片もＣｌａＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩとＣｌａＩとで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳｋ＋／−にサブクローン化して１６．１ｋＤａオープンリーディングフレームのみを有するｐＪＳ２６３を得た（図５）。ｐＪＳ２６４で形質転換されたＤＨ５αはアッシングチャンバーでＩｓｃの上昇を誘導しなかった。翻訳されたオープンリーディングフレームのアミノ酸相同性についてのＧｅｎＢａｎｋサーチでは公知の原核生物の配列と有意な同一性は明らかとはならなかった。次に、ｔｉｅ遺伝子を含有する２．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片をＡｃｃＩにより消化し、ＤＨ５αにクローン化してｐＪＳ２６１を得て（図５）、次にこれを用いてＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体もアッシングチャンバー中で上記のように試験したときにエンテロトキシン活性を発現することがわかった。分泌活性に対するｔｉｅ遺伝子の効果を評価するために、ｐＪＳ２６中のｔｉｅ遺伝子をＮｄｅＩとＳｐｈＩにより消化することにより欠失変異を構築した。得られたプラスミドはｐＪＳ２６△と命名した（図５）。このプラスミドはオープンリーディングフレームのＮ末端の最初の２／３を欠如するものであった。次に、このプラスミドを用いてＤＨ５αを形質転換し、アッシングチャンバー中で上記のように試験した。ｐＪＳ２６△形質転換体から得られた上清は、アッシングチャンバーでｐＪＳ２６に比べて低い応答を誘導し、ｔｉｅ遺伝子がＥＩＥＴ構造遺伝子であることが確認された。よって、上記のようにＡサブユニットとＢサブユニットからなると信じられているＳｈＥＴ１とは異なり、ＥＩＥＴは単一分子である。実施例５Ｓｈｉｇｅｌｌａエンテロトキシン２（ＳｈＥＴ２）の遺伝子配列の決定上記のように、ＳｈｉｇｅｌｌａとＥＩＥＣはいくつかの類似性を分け合っている。よって、図６Ａ〜６Ｄ（配列番号１）に示されているＥＩＥＣエンテロトキシンをコードしている遺伝子を含有しているオープンリーディングフレームをプローブとして用いて、Ｓｈｉｇｅｌｌａが類似のＤＮＡ配列を有しているかどうかを決定した。より具体的には、精製染色体ＤＮＡをＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａＭ４２４３とＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａＭ４２４３ａｖｉｒの各々から得て、ＳａｌＩで消化し、次にｔｉｅ遺伝子とのハイブリダイゼーションでスクリーニングを行なった。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、プラスミド矯正誘導株からではなく、野性型株からの染色体ＤＮＡ中に３．５ｋｂの単一バンドの存在を示した。この結果は、同一のＤＮＡが侵入プラスミド上に置かれていることを示唆している。３．５ｋｂＳａｌＩ断片は、ｔｉｅ遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＡＧＴＧＴＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＧ（配列番号１３）およびＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＣＡＧＴＣＡＧ（配列番号１４））を用いるＰＣＲによりＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａＭ４２４３プラスミド上で同定され、自動化シーケンサーを用いて配列決定を行なった。得られたＤＮＡ配列は、決定されたアミノ酸配列とともに図７Ａ〜７Ｄ（配列番号２）に示す。図７Ａ〜７Ｄ（配列番号２）に示されているように、この断片は１５９５ｂｐオープンリーディングフレームを有することが分かり、ＥＩＥＴ遺伝子に対して少なくとも９９％の相同性を有している。このＳｈｉｇｅｌｌａ遺伝子は予想分子量６３ｋＤａと等電点６．３６のタンパク質をコードしている。リーダーペプチドは同定されなかった。ペプチド構造の分析から、膜にかかる可能領域（アミノ酸位置１２０〜１４０、２６０〜３００および４８０〜５２０）と５つのシステイン残基が明らかとなった。予想されたリボソーム結合部位は塩基位置２９０〜２９３に見られた。このオープンリーディングフレームの翻訳を表２に示されたＳｈＥＴ１のＮ末端配列と比較すると、相同性は見られず、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａＭ４２４３プラスミド上に位置するこの遺伝子が、ＳｈＥＴ１とは異なるが、ＥＩＥＴとは実質的に同一である毒素（以下「ＳｈＥＴ２」と呼ぶ）をコードすることを示唆している。ＥＩＥＴ遺伝子とＳｈＥＴ２遺伝子との類似性のために、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａＭ４２４３プラスミド上に位置する遺伝子（すなわちＥＩＥＴ遺伝子プローブとハイブリダイズする）はＳｈＥＴ２構造遺伝子であることは明らかである。実施例６ＤＮＡプローブとしてのＥＩＥＣエンテロトキシン遺伝子の利用ｔｉｅ遺伝子をＤＮＡプローブとして用いて、厳密な条件下のコロニーブロット法によりＥＩＥＣ株とＳｈｉｇｅｌｌａ株の集合物に対するこのプローブのハイブリダイゼーションを行なった。結果を表３に示す。上の表３に示されているように、ｔｉｅ相同配列は、全ての４種類のＳｈｉｇｅｌｌａ種（ｆｌｅｘｎｅｒｉ、ｂｏｙｄｉｉ、ｓｏｎｎｅｉおよびｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）を含むＳｈｉｇｅｌｌａ株の８０％（２７／３４）とＥＩＥＣの７５％に存在している。ＥＩＥＣ以外の１１０大腸菌は相同配列を有していなかった。実施例７Ｓｈｉｇｅｌｌａエンテロトキシン１（ＳｈＥＴ１）の遺伝子配列の決定コロニーイムノブロット法を利用し、実施例２に記載のウサギポリクローナル抗体を用いてＳｈＥＴ１遺伝子（ｓｅｔ１）をクローニングした。より具体的には、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの２４５７Ｔ株のプラスミド矯正誘導体株（２４５７ＴＡ株（the Walter Reed Army Institute of Research）と命名）から得られた染色体ＤＮＡのライブラリーをＳａｕ３Ａによる部分消化により得た。得られた５〜１０ｋｂ断片をＧｅｎｅＣｌｅａｎにより精製し、次にＳａｕ３ＡＤＮＡ末端をクレノウ反応でｄＡＴＰとｄＧＴＰで部分的に満たした。これとは別に、未消化λＺＡＰＩＩベクター（カリフォルニア州ラ・ジョラ所在Stratagene）のｃｏｓ末端を連結してからこのベクターをＸｈｏＩで消化し、得られた末端をｄＣＴＰとｄＴＴＰで部分的に満たした。この結果、それらベクター間ではなく、ベクターと染色体挿入物との間に適合末端が得られた。染色体断片とベクターの適合末端を連結し、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＧｏｌｄパッキングエキストラクト（Stratagene）システムを用いて製造業者に推薦された方法にしたがってパッケージした。得られたλＺＡＰＩＩ：：２４５７ＴＡライブラリーを大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’株（Stratagene）中で評定し、１００ｍｍプレートあたり１００プラーク濃度を得た。次に、バクテリオファージλベクターライブラリーの発現の免疫学的スクリーニングのためにＳａｍｂｒｏｏｋら（Molecular Cloning.A LaboratoryManual、第２版、Cold Spring Ha rbor Laboratory Press (1989)）の記載した方法を用いて、該プラークをＩＰＴＧ飽和ニトロセルロースフィルターを用いてブロットした。次に、４０フィルター（約４×１０³プラーク）を実施例２に記載のウサギポリクローナル抗血清を用いてスクリーニングし、６プラークが強い陽性を示すことかわかった。これらのプラークを集め、対応する２４５７ＴＡＤＮＡ挿入物を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳｋ＋／−を、λＺＡＰＩＩベクターからＥｘＡｓｓｉｓｔ／ＳＯＬＲシステム（Stratagene）を用いて製造業者により推薦された方法にしたがって切り出した。得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳｋ＋／−を用いてＤＨ５αを感染させ、各イムノブロット陽性プラークに由来する単一コロニー２４個を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＦｅ⁺⁺のないＬＢ培地３００ｍｌで生育させ、３７℃で４８時間培養した。次に、これらの培養物の上清は、９６ウェルのマニホールド（BioRad）を用いて重力によりニトロセルロース紙を通させ、上記ウサギ抗血清でイムノブロットした。１つの陽性プラークに由来するクローンの上清は強く反応性のあることがわかった。これらの強く反応性のあるクローンのうち任意に選択された６クローンからのフィルター無菌化上清はアッシングチャンバーでウサギ回腸粘膜上で調べた。これら上清の１つは、ＤＨ５α（１７．９＋／−７．３μＡｍｐ／ｃｍ²）陰性コントロール上清よりも顕著に高く、かつ２４５７ＴＡ上清（３８．８＋／−１０．１μＡｍｐ／ｃｍ²）と等しいＩ_sc変化（５８．７＋／−７．９μＡｍｐ／ｃｍ²）を誘導した。このクローンに含まれるプラスミドをｐＦ９−１−９０と命名し、このプラスミドを精製してマッピングしたところ６．０ｋｂＤＮＡ挿入物が発見された（図８を参照）。プラスミドｐＦ９−１−９０を有するクローンからの上清をウェスタンイムノブロットにかけると、２４５７ＴＡに存在する類似のバンドパターンの発現が示されたが、宿主ＤＨ５α（ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳｋ＋／−）のみでは示されなかった。参照としてｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳｋ＋／−のポリリンカー中に見つかった複数の制限酵素を用いて、６．０ｋｂ挿入物の多様なセグメントを同じベクター中にクローニングした。多様な大きさのセグメントを含むクローンからの上清をアッシングチャンバーとイムノブロットで試験した。ｐＦ９−１−９０中の選択された遺伝子挿入物一本鎖の配列決定は自動化蛍光配列決定により実施した（カリフォルニア州フォスター市、Applied Biosystems のモデル３７３ＡのＤＮＡシーケンサー）。シークエナーゼ・バージョン２．０ＤＮＡ配列決定用キット（オハイオ州クリーブランド、ＵＳＢ）を用いるチェイン・ターミネーション配列決定法を用いて相補ＤＮＡ鎖の配列を決定した。チェイン・ターミネーション配列決定法は、以下に記載のｐｓｅｔ１中のｓｅｔ１遺伝子の同定とその方向の決定のためにも用いた。ｐＦ９−１−９０中のプロモーターＴ７の下流にある３．０ｋｂＤＮＡセグメントの配列決定分析から、同じ方向でわずかに６．０ｂｐだけ離れたそれぞれ１４６ｂｐ（ｓｅｔ１Ｂ）と５７４ｂｐ（ｓｅｔ１Ａ）の２つのオープンリーディングフレームが明らかとなった（図９Ａ〜９Ｂ；配列番号１５）。驚くべきことに、図９Ａ〜図９Ｂに示されたＤＮＡ配列に基づくＳｈＥＴ１の予想されたアミノ酸配列は、表２に示されたＮ末端アミノ酸配列に対応しなかった。このことから、ＳｈＥＴ１遺伝子のクローニングの困難性が確かめられる。これらのオープンリーディングフレームによりコードされたタンパク質分子の予測分子量（ＭＷ）は、ｓｅｔ１Ｂとｓｅｔ１Ａに関してそれぞれ約７．０ｋＤａと２０ｋＤａである。下記のイムノブロット実験における５５ｋＤａタンパク質の発見は、ホロトキシンに関するＡ₁：Ｂ₅構成（ここで、Ａサブユニットは２０ｋＤａであり、各々のＢサブユニットは７．０ｋＤａである）の概念を支持している。ｓｅｔ１Ｂ遺伝子は、ｓｅｔ１Ｂとｓｅｔ１Ａの両方の遺伝子の転写を支配する上流プロモーターを有している。ｓｅｔ１Ｂのアミノ酸配列の分析から、予想されたシグナル配列を有するペプチド構造が明らかとなった。この予想されたタンパク質をＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋの配列ライブラリーと比較したところ、アミノ酸または塩基レベルで原核生物または真核生物の配列間の有意な相同性は示されなかった。ｓｅｔ１Ａ遺伝子は、開始コドンから１５ｂｐ上流にそれ自身のＳｈｉｎｅＤｅｌｇａｒｎｏ配列を持っている。ｓｅｔ１Ａの予想されたアミノ酸配列も推定シグナルペプチドを特徴付けている。このオープンリーディングフレームをＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋと比較したところ、公知の配列との有意な相同性は明らかとはならなかった。（９８ｂｐの上流セグメントを有する）ｓｅｔ１オープンリーディングフレームを有する１，０９３ｂｐフラグメントは、ｐＦ９−１−９０中の６．０Ｋｂ挿入物をＸｍａＩで消化し、これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋／−にクローニングすることにより得た。このようにして得られたプラスミドはｐｓｅｔ１と命名し、これを用いてＤＨ５αを形質転換した。次に、ＤＨ５α（ｐｓｅｔ１）上清を上記のようにイムノブロットし、アッシングチャンバー中でエンテロトキシン活性を調べた。ＤＨ５α（ｐｓｅｔ１）培養物からのＦｅ⁺⁺のない上清をイムノブロットしたところ、５５ｋＤａタンパク質バンドの発現がＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの２４５７ＴＡ株とｐＦ９−１−９０株の上清中には検出されたが、ＤＨ５α陰性コントロール中には検出されなかった。ＤＨ５α（ｐｓｅｔ１）上清は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの野性株２４５７ＴＡ（３８．８０＋／−７．６μＡｍｐ／ｃｍ²；ｎ＝６）とＤＨ５α（ｐＦ９−１−９０）（５３．６３＋／−１１．３ μＡｍｐ／ｃｍ²；ｎ＝８）よりもＩ_scの高い増加（７９．１８＋／−１４．１ μＡｍｐ／ｃｍ²；ｎ＝６）をアッシングチャンバーで試験時に誘導した。アッシングチャンバーで試験されたすべてのＳｈＥＴ１含有上清は、ＤＨ５α（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋／−）陰性コントロールから得られた上清により誘導された変化（１０．１８＋／８．５μＡｍｐ／ｃｍ²；ｎ＝７；ｐ＜０．０１）と比較してＩ_scの高い増加を示した。エンテロトキシン効果はＳｈＥＴ１の発現のレベルに比例し（ｐｓｅｔ１＞ｐＦ９−１−９０＞２４５７ＴＡ）、ＳｈＥＴ１の毒性に関して投与量と応答とに関連性のあることを示唆した。実施例８弱毒化Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株ＣＶＤ１２０３の構築成人ボランティアでの実験誘発研究に基づき有毒であることが知られているＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ株２４５７Ｔ（Kotloff et al,Infect．Immun．60:22 18-2224 (1992)）を野性型親株として選択し、ａｒｏＡとｖｉｒＧの両遺伝子の欠失の導入して弱毒化した。より具体的には、ａｒｏＡ遺伝子（Duncan et al，FEBS，170:59-63 (1984)）を、プログラムできるサーマル・コントローラー装置で、Ｐｒｏｍｅｇａから入手したＴａｇポリメラーゼと緩衝液を用いるポリメラーゼ連鎖反応に供して、ａｒｏＡ遺伝子中の２０１個のヌクレオチドの欠失（これはコードされた酵素のアミノ酸１６８〜２３１の欠失に対応する）を得た。特に、ＥｃｏＲＩ部位を導入するように上流プライマー（ＴＡＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴＡ）（配列番号５）を用い、ＫｐｎＩ部位とＳｓｐＩ部位を導入するように下流プライマー（ＧＧＴＡＣＣＣＣＣＡＡＴＡＴＴＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＧＣＣ）（配列番号６）を用いてａｒｏＡ遺伝子の５’末端を増幅した。ＳｓｐＩ部位とＫｐｎＩ部位を導入するように、上流プライマー（ＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＣＴＴＡＴＴＴＧＧＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＡ）（配列番号７）を用い、ＳａｌＩ部位を導入するように下流プライマー（ＴＧＡＴＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＡＡＴ）（配列番号８）を用いて、ａｒｏＡ遺伝子の３’末端を増幅した。両セグメントを１分間９４℃、２分間５０℃および４分間７２℃のサイクルを３０回繰り返して増幅した。第２回目のＰＣＲ反応において、５’セグメントと３’セグメントを融合し、得られた融合生産物を同じ反応で増幅した。この反応において、所与の相同性領域（ＳｓｐＩ−ＫｐｎＩ）をアニールし、５’セグメントと３’セグメントを効果的に融合する。この時にこれらセグメントはそれら自体のプライマーおよび／またはＴａｑポリメラーゼのための鋳型として働き、これらに基づいてＤＮＡの鎖がアニールされた。この融合を促進するために、最初の１５サイクルはアニール温度を徐々に上げ（１℃／８秒間で４０℃〜５０℃＋５０℃、２分間）、その後に５５℃のアニール温度で１５サイクル行って、新しい△ａｒｏＡ遺伝子を増幅した。Ｓｈｉｇｅｌｌａの△ａｒｏＡ遺伝子を、温度感受性ベクターｐＩＢ３０７（Blomfield et al,Mol.,Microbiol.,5:1447-1457 (1991)）のＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位にクローン化してｐＩＢ３０７：：△ａｒｏＡを得た。ｐＩＢ３０７：：△ａｒｏＡを大腸菌ＤＨ５αにエレクトロポレーションにより移入し、３０℃で生育させた。第二ステップにおいて、ｐＩＢ２７９のＳａｃＢ−ネオマイシン^Rセグメント（Blomfield et al,Mol.,Microbiol.,5:1447-1457 (1991)）をｐＩＢ３０７：：△ａｒｏＡのＢａｍＨＩポリリンカー部位に移入し、この得られたプラスミド（ｐＦＪ２０１と命名）をエレクトロポレーションによりＤＨ５ αに導入し、３０℃でインキュベートした。ｐＦＪ２０１をエレクトロポレーションによりＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉの２４５Ｔに移入し、野性型株中で対立遺伝子交換を行なった。単一の相同組換えを表すＣｏ−ｉｎｔｅｇａｔｅｓが容易に得られた。対抗選択（３０℃のＡｒｏ−ショ糖プレート）を用いて、二重相同組換の特徴を有する（すなわち染色体中で対立遺伝子ａｒｏＡの△ａｒｏＡによる交換を表している）クローンを同定した。このクローンはカナマイシン感受性、コンゴレッド陽性であり、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ抗血清で凝集し、０．４ｇＮａＣｌ、８．４ｇＫ₂ＨＰＯ₄、３．６ｇＫＨ₂ＰＯ₄、０．８ｇ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２．５ｇグルコース、０．０５ｇニコトン酸、０．０５ｇアスパラギン酸、０．０５ｇセリンおよび１５ｇノーベルＬ寒天からなるＳｈｉｇｅｌｌａ最小培地（ＳＭＭ）では生育することができなかった。ＳＭＭを用いて、芳香族化合物を新たに合成することができない△ａｒｏＡ変異体コロニーをスクリーニングすることができ、よって生育するためには外来の芳香族化合物を必要とする。この株のＰＣＲで、作られた遺伝子が欠失を有することが示され、野性型株の産物が１．２ｋｂである一方で、該クローンの産物は１．０ｋｂであった。この欠失の確認は、遺伝子の欠失部分に由来する４０塩基合成オリゴヌクレオチド配列を用いて行なった。³²Ｐ標識プローブは野性型コロニーにハイブリダイズしたが、該クローンとはハイブリダイズしなかった。この△ａｒｏＡクローンはＣＶＤ１２０１．１と命名した。 △ａｒｏＡＣＶＤ１２０１．１株と野性型２４５７Ｔ株を、芳香族アミノ酸（５０ｍｇＬ−トリプトファン、５０ｍｇＬ−チロシン、５０ｍｇＬ−フェニルアラニン）、１０ｍｇ酢酸鉄アンモニウムおよび１０ｍｇＰＡＢＡを暫時補った５．０ｍｌ容積のＳＭＭ中で３７℃で振盪しながら生育させた。ＣＶＤ１２０１．１は生育するためにチロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびＰＡＢＡの添加を必要とした。ＶｉｒＧ遺伝子中の９００ヌクレオチドの欠失（Lett et al，J．Bacteriol.,172 :352-359 (1989)）は、１２０ｋＤａＶｉｒＧタンパク質のアミノ酸３４１〜６４０の欠失に対応しており、△ａｒｏＡ変異を作るために用いたときと類似の以下のステップにより得られた。１２０ｋＤａタンパク質中のこの欠失のための特定の処理部位は、Ｊａｍｅｓｏｎ／Ｗｏｌｆ抗原指標（ＩＢＩＰｕｓｔｅｌｌ配列分析プログラム）に基づいて分子の高い疎水性と弱い抗原性を持つ部分を表している。より具体的には、ＶｉｒＧ遺伝子の５’末端は、ＥｃｏＲＩ部位を導入するように上流プライマー（ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＴ）（配列番号９）を用い、および下流プライマー（ＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＴ）（配列番号１０）を用いて増幅した。ＶｉｒＧ遺伝子の３’末端は、上流プライマー（ＣＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＡＴＡ）（配列番号１１）、およびＳａｌＩ部位を導入するように下流プライマー（ＣＧＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡ）（配列番号１２）を用いて増幅した。ＶｉｒＧの５’セグメントと３’セグメントの増幅と融合を上記と同じＰＣＲサイクルを用いて実施した。得られた新しい△ｖｉｒＧ遺伝子をｐｉｒに基づく自殺（ｓｕｉｃｉｄｅ）ベクターｐＫＴＮ７０１（Hone et al，Vaccine，9:8 10-816 (1991)）のＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位にクローン化して、ｐＳｈ△ｖｉｒＧを得て、これを大腸菌のＳＹ３２７株中にエレクトロポレーションにより導入した（Miller et al，J．Bacteriol.,170:2575-2583 (1983)）。次に、このプラスミドをＳｍ１０λｐｉｒ株中にエレクトロポレーションにより導入した（Mi ller et al，J．Bacteriol.,170:2575-2583 (1983)）。Ｓｍ１０λｐｉｒ（ｐＳｈ△ｖｉｒＧ）を用いて、この欠失カセットを△ａｒｏＡ株（ＣＶＤ１２０１．１）中に接合した。自殺ベクターｐＳｈ△ｖｉｒＧを△ａｒｏＡ株（ＣＶＤ１２０１．１）のビルレントプラスミド（△ｖｉｒＧ）遺伝子座に組み込み、相同組換えにより△ｖｉｒＧ変異を導入した後、Ｈｏｎｅら（Vaccine,,9:810-816 (1991)）によりサルモネラに関して記載された方法を用いてクロラムフェニコール感受性を高めた。推定二重相同組換えの成功を表す抗体感受性クローンは、ＰＣＲ、コンゴレッド陽性、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ抗血清による凝集、および欠失配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしないことにより確認した。このようにして、△ａｒｏＡ △ＶｉｒＧＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ変異体であるＣＶＤ１２０３（ＡＴＣＣＮｏ．５５５５６）を単離した。１２０ｋＤａＶｉｒＧタンパク質はＣＶＤ１２０３の全細胞溶解物を使ったイムノブロットおよび△ＶｉｒＧの欠失部分内の△ＶｉｒＧ部分を表すＶｉｒＧペプチド（Ｉｌｅ３５９〜Ｃｙｓ３７５）に対するウサギ抗血清では検出されなかった。しかし、ＣＶＤ１２０３中に発現した△ＶｉｒＧの一部を表すもう一つのＶｉｒＧペプチド（Ｌｅｕ５５〜Ｔｈｒ７３）に対する抗ウサギ血清をイムノブロットで用いたときに、８５ｋＤａバンドが検出された。ＣＶＤ１２０３は、その野性型親株と同じように、十分なＰＡＢＡと芳香族アミノ酸を含有する腸性培地で育ち、糖、鉄、寒天の３重スラントの接種の１８〜２４時間後に、Ｈ₂Ｓまたは気体と典型的な酸性バット／アルカリ性スラント反応を示す。２４５７Ｔ株とＣＶＤ１２０３株からのＬＰＳを銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけると、ＬＰＳパターンが同一であることが示された。同様に、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ２４５７Ｔに対するヒト抗血清と反応したＣＶＤ１２０３と２４５７ＴのＬＰＳをウェスタンイムノブロットにかけると、いずれの株のＬＰＳ調製物も同一のバンドを示した。ＣＶＤ１２０３と２４５７Ｔのそれぞれの水抽出物は、ＩｐａＢ（４２ｋＤａ）またはＩｐａＣ（６２ｋＤａ）に対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンイムノブロットで同一の単一バンドを示した。抗ＩｐａＣモノクローナル抗体を用いて、等量のタンパク質を含有するこれら二種類の抽出物の連続的希釈物をドットイムノブロットにかけると同じ終点を示し、両株が同じ量のＩｐａＣを作ることがわかった。本発明が詳細にその具体的な実施態様を参照しながら記載されてきた一方で、多様な変化と修正がその精神と範囲を離れることなくここで行なわれ得ることが当業者には明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年１月３０日【補正内容】請求の範囲１．配列番号１５のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの実質的に純粋なＳｈＥＴ１エンテロトキシン。２．ＳｈＥＴ１に対して結合特異性を有する抗体。３．前記抗体がポリクローナルである請求の範囲第２項記載の抗体。４．配列番号２のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの実質的に純粋なＳｈＥＴ２エンテロトキシン。５．ＳｈＥＴ２に対して結合特異性を有する抗体。６．前記抗体がポリクローナルである請求の範囲第５項記載の抗体。７．配列番号１のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるＥＩＥＴをコードする単離されたＤＮＡ分子。８．前記ＤＮＡ分子が配列番号１に示された塩基配列からなる請求の範囲第７項記載の単離されたＤＮＡ分子。９．請求の範囲第７項記載のＤＮＡを含むプラスミド。１０．請求の範囲第８項記載のＤＮＡを含むプラスミド。１１．配列番号１５のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるＳｈＥＴ１をコードする単離されたＤＮＡ分子。１２．前記ＤＮＡ分子が配列番号１５に示される塩基配列からなる請求の範囲第１１項記載の単離されたＤＮＡ分子。１３．請求の範囲第１１項記載のＤＮＡを含むプラスミド。１４．請求の範囲第１２項記載のＤＮＡを含むプラスミド。１５．配列番号２のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるＳｈＥＴ２をコードする単離されたＤＮＡ分子。１６．前記ＤＮＡ分子が配列番号２に示される塩基配列からなる請求の範囲第１５項記載の単離されたＤＮＡ分子。１７．請求の範囲第１５項記載のＤＮＡを含むプラスミド。１８．請求の範囲第１６項記載のＤＮＡを含むプラスミド。１９．ＳｈＥＴ１遺伝子、ＳｈＥＴ２遺伝子またはその組合せの変異の結果として、エンテロトキシンＳｈＥＴ１、ＳｈＥＴ２またはその両者を産生しない変異Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ。２０．前記変異が欠失変異である請求の範囲第１９項記載の変異Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ。２１．前記変異体がａｒｏ ^-およびＶｉｒＧ ^-表現型を有する請求の範囲第２０項記載の変異Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ。２２．前記変異が親株Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＣＶＤ１２０３株（ＡＴＣＣＮｏ．５５５５６）に導入されている請求の範囲第２１項記載の変異Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ａ６１Ｋ 39/112 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/112 39/395 9284−4Ｃ 39/395 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ノリエガ，フェルナンドアメリカ合衆国メリーランド、コロンビア、タマー・ドライヴ・ナンバー425、 8354 (72)発明者レヴィン，マイロン・エムアメリカ合衆国メリーランド、コロンビア、ウインドミル・レーン 5209 (72)発明者ナタロ，ジェームズ・ピーアメリカ合衆国メリーランド、カトンズヴィル、ドロウブリッジ・コート３

Claims

【特許請求の範囲】１．図９Ａ〜９Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号１５）を有するＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの実質的に純粋なＳｈＥＴ１エンテロトキシン。２．ＳｈＥＴ１に対して結合特異性を有する抗体。３．前記抗体がポリクローナルである請求の範囲第２項記載の抗体。４．図７Ａ〜７Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号２）を有するＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの実質的に純粋なＳｈＥＴ２エンテロトキシン。５．ＳｈＥＴ２に対して結合特異性を有する抗体。６．前記抗体がポリクローナルである請求の範囲第５項記載の抗体。７．図６Ａ〜６Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号１）から実質的になるＥＩＥＴをコードする単離されたＤＮＡ分子。８．前記ＤＮＡ分子が図６Ａ〜６Ｄに示される塩基配列（配列番号１）から実質的になる請求の範囲第７項記載の単離されたＤＮＡ分子。９．図９Ａ〜９Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号１５）から実質的になるＳｈＥＴ１をコードする単離されたＤＮＡ分子。１０．前記ＤＮＡ分子が図９Ａ〜９Ｂに示される塩基配列（配列番号１５）から実質的になる請求の範囲第９項記載の単離されたＤＮＡ分子。１１．図７Ａ〜７Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号２）から実質的になるＳｈＥＴ２をコードする単離されたＤＮＡ分子。１２．前記ＤＮＡ分子が図７Ａ〜７Ｄに示される塩基配列（配列番号２）から実質的になる請求の範囲第１１項記載の単離されたＤＮＡ分子。１３．ＳｈＥＴ１遺伝子とＳｈＥＴ２遺伝子の変異の結果としてエンテロトキシンＳｈＥＴ１、ＳｈＥＴ２またはその両者を産生しない変異Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ。１４．前記変異が欠失変異である請求の範囲第１３項記載の変異Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ。１５．前記変異体がａｒｏ ^-およびＶｉｒＧ ^-表現型を有する請求の範囲第１４項記載の変異Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ。１６．前記変異が親株Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＣＶＤ１２０３株（ＡＴＣＣＮｏ．５５５５６）に導入されている請求の範囲第１５項記載の変異Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ。